Question 1

Cos'è un plasmide e perché viene utilizzato nella trasformazione batterica?

Accepted Answer

Un plasmide è un piccolo frammento circolare di DNA extracromosomico che agisce come vettore per trasportare la vostra specifica sequenza di DNA nelle cellule batteriche. Contiene un sito di clonazione multiplo dove enzimi di restrizione inserire il vostro gene bersaglio, un'origine di replicazione per la copia del DNA e un gene di resistenza agli antibiotici che permette ai batteri trasformati di sopravvivere su terreni contenenti antibiotici.

Question 2

Come fa l'elettroporazione a creare pori nelle membrane cellulari batteriche?

Accepted Answer

L'elettroporazione applica un campo elettrico ad alta tensione di 1.000 a 10.000 volt per centimetro per millisecondi, causando il raggiungimento di 0,5-1 volt attraverso la membrana. Questo riorganizza il doppio strato di fosfolipidi, creando pori temporanei attraverso i quali DNA plasmidico passa. Una volta che gli impulsi si fermano, il doppio strato si ripara, intrappolando il DNA all'interno della cellula.

Question 3

Cosa sono le cellule elettrocompetenti e come vengono preparate?

Accepted Answer

Le cellule elettrocompetenti sono batteri preparati per assorbire prontamente il DNA durante l'elettroporazione. Le cellule di E. coli vengono coltivate fino alla fase di log medio, poi lavate più volte in acqua deionizzata e soluzione di glicerolo al 10% per rimuovere il sale. La rimozione del sale è fondamentale perché un alto contenuto di sale causa l'arco, una scarica elettrica che uccide le cellule e indica un fallimento della trasformazione.

Question 4

Perché la costante di tempo è importante nel prevedere il successo dell'elettroporazione?

Accepted Answer

La costante di tempo misura quanto rapidamente la tensione decresce dopo l'applicazione dell'impulso elettrico. Le buone costanti di tempo per i batteri vanno da 5-10 millisecondi. Un rapido decadimento indica un'alta concentrazione di sale, causando arco elettrico e morte cellulare. Monitorare la costante di tempo aiuta a prevedere se la tua trasformazione avrà successo prima di osservare la crescita delle colonie.

Question 5

Come si confronta l'elettroporazione con la trasformazione per shock termico?

Accepted Answer

La trasformazione con shock termico utilizza cloruro di calcio ed esposizione al calore al posto dei impulsi elettrici, rendendola più delicata sui batteri e più economica rispetto all'elettroporazione. Tuttavia, lo shock termico produce efficienze di trasformazione inferiori, richiede più tempo e funziona solo su batteri, lievito e protoplasti vegetali. L'elettroporazione raggiunge un'efficienza superiore e si applica a cellule di mammiferi attraverso un processo chiamato trasfezione.

Question 6

Quali passaggi seguono l'elettroporazione per identificare con successo i batteri trasformati?

Accepted Answer

Dopo il pulsing, aggiungere il terreno di recupero alle cellule e incubare a 37°C per un'ora con agitazione. Piattare le cellule su agar contenente antibiotico e incubare durante la notte a 37°C. Solo i batteri che hanno preso con successo il plasmide sopravvivono all'antibiotico. Contare le colonie risultanti e calcolare l'efficienza di trasformazione dividendo i trasformanti di successo per il DNA totale piattato.

Question 7

Quali sono le applicazioni dell'elettroporazione oltre alla trasformazione batterica?

Accepted Answer

L'elettroporazione si applica alle cellule di mammiferi attraverso la trasfezione, utilizzando intensità di campo inferiori e costanti di tempo più elevate rispetto alle cellule batteriche. Gli scienziati utilizzano anche l'elettroporazione in interi organismi come embrioni di pollo in via di sviluppo iniettano DNA plasmidico nel tessuto cerebrale e applicano un campo elettrico. Ciò consente l'osservazione dell'espressione di proteine fluorescenti e dei cambiamenti strutturali nel tessuto neurale in via di sviluppo.

Trasformazione batterica: elettroporazione - Quiz di valutazione