Name: Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Impara la microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi nel cervello del topo per studiare il ruolo di geni bersaglio nelle fasi di acquisizione, estinzione e reinstatement della condizionata place preference.

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Gli autori desiderano ringraziare Anni Lee e Maureen Byrne per il loro aiuto nello stabilire il luogo protocollo esteso preferenza condizionata.

Tutte le procedure sono condotte in conformità con il Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care e Usa regole del Comitato. 1. Preparazione e configurazione di consegna stereotassico di vettori virali <ol><li> Se uno strumento, tampone sterile, o della mano indossando guanti sterili è contaminata da entrare in contatto con una superficie non sterile, eliminare o ri-sterilizzare lo strumento con un caldo tallone sterilizzatore, scartare il tampone o passare a nuovi guanti sterili. </li><li> Posizionare una gabbia del mouse con biancheria da letto su un blocco di calore per riscaldare per il recupero post-operatorio. </li><li> Impostare rasoio elettrico per radersi la testa e l&#39;etanolo e iodio per sterilizzare il cuoio capelluto. </li><li> Pulire le orecchie bar e bocca stretta della stereotax con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzando un 5 microlitri siringa Hamilton, redigere 5 ml di vettore virale (1 x 10 6 particelle virali / mL) e istituito nel supporto siringa sul stereotax. </li><li> Riscaldamento a microonde pad o accendere pad elettrica su una° posto su stereotax. Coprire con un tampone assorbente pulita per ridurre il rischio di ustioni. Controllo della temperatura corporea del mouse (tra 97-99,5 ° F) frequentemente durante procedura. </li><li> Iniettare topo (peso compreso tra 22-35 g) con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). Una volta che un topo è anestetizzato, punta della coda pizzico di verificare i riflessi del mouse e osserva qualsiasi movimento o risposta per garantire che il mouse è adeguatamente anestetizzato. </li><li> Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi. </li><li> Pulire la testa rasata con alternanza di etanolo e iodio sterili applicatori di cotone. </li><li> Passa il mouse a pad riscaldato stereotax. </li></ol> 2. Microiniezione stereotassica di vettori virali <ol><li> Indossare guanti sterili durante l&#39;intervento chirurgico. Se i guanti sono contaminati in qualsiasi momento toccando superfici non sterili, cambiare i guanti. </li><li> Zero bar e con i denti bar scale orecchio. </li><li> Set denti in bar dente. </li><li> Vite in museruola. Se dimenando o baffo mossazione è notato, in qualsiasi momento, somministrare una dose di richiamo ip (~ 0,05 cc) di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). </li><li> Vite in barre orecchio. </li><li> Lubrificare gli occhi con PuraLube. </li><li> Tagliare cuoio capelluto aperta a appena dietro le orecchie con un bisturi. </li><li> Luogo bulldog clip su angoli del cuoio capelluto per sbucciare la pelle dal cranio. Bregma e lambda dovrebbe essere facilmente visibile. </li><li> Assicurati di sutura dal bregma al lambda sia allineata. Se la sutura è storto riaggiustare posizionamento della testa. </li><li> Verificare che tutte le impostazioni sulla stereotax sono azzerati. </li><li> Mettere la punta dell&#39;ago in atto a bregma. </li><li> Misurare tutte le coordinate per entrambi bregma e lambda. Questo include coordinate dorsale / ventrale, mediale / laterale e anteriore / posteriore. </li><li> Regolare la testa fino a quando le coordinate ventrali per bregma e lambda sono a 0,02 millimetri l&#39;uno dall&#39;altro. </li><li> Una volta allineata, dal bregma medialmente andare fuori alle coordinate mediale / laterale (M / L). Assicurarei lati sinistro e destro sono allineate all&#39;interno di 0,02 mm di vicenda. </li><li> Punta dell&#39;ago ri-center su bregma e da lì muoversi nella direzione anteriore / posteriore (A / P) per la coordinata anteriore / posteriore desiderato. </li><li> Se necessario, ago angolo in una direzione e assicurarsi che il stereotax è bloccato. Uscire alla M / L coordinata sinistra (+ / - 1,52) </li><li> Misurare la posizione ventrale della parte superiore del cranio da utilizzare come riferimento dopo il pozzo viene perforato. </li><li> Praticare un foro con una punta sterile alla coordinata desiderata. Controllare che l&#39;ago può entrare senza interruzioni attraverso il cranio. </li><li> Abbassare l&#39;ago alla coordinata ventrale desiderato. </li><li> Una volta che la coordinata è raggiunto, dip 0,015 millimetri sotto per ~ 10 sec per creare una piccola tasca per il vettore virale. </li><li> Iniettare il volume desiderato di vettore virale a una velocità di ~ 0,1 ml / min. Attendere 3 minuti per il vettore virale per diffondere completamente. Sollevare la punta dell&#39;ago 0,015 millimetri e attendere un ulteriore 2 min. </li><li>Immergere l&#39;ago (se facendo iniezioni angolati) nella direzione opposta. Ancora, registrare la posizione ventrale come riferimento per la parte superiore del cranio. </li><li> Ripetete la stessa procedura sul primo lato di iniettare vettore virale sul lato opposto (se facendo iniezioni bilaterali). </li><li> Applicare la cera ossea per entrambi i fori per sigillarli con il fine di legno di una sterile cotton-fioc. </li><li> Suturare il cuoio capelluto. </li><li> Applicare il blocco del nervo alla zona ferita. </li><li> Rimuovere il mouse da stereotax e mettere in gabbia riscaldata sul blocco di calore per recuperare per 45 min. </li><li> Monitorare i segni di dolore, tra cui: riduzione dell&#39;attività complessiva o irrequietezza, diminuzione del consumo di cibo e acqua o maggiore vocalizzazione. Buprenorfina (0,05 - 0,2 mg / kg) può essere somministrato due volte al giorno per una settimana, se necessario, per il dolore. Alternative accettabili includono: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg). </li></ol> 3. Condizionata Luogo Preferenza: Acquisition, Extinction e Ripristino <ol><li> Topi posto nella camera centrale di un luogo apparato preferenza a tre camere (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) per un secondo periodo di 60 assuefazione con porte a ghigliottina chiusi. </li><li> Dopo assuefazione, porte a ghigliottina aperti e consentire topi libera esplorazione di tutti e 3 camere per 1.200 secondi, con il tempo trascorso in ciascuna camera di essere registrati utilizzando il software MedPC IV (Med Associates, Inc.). </li><li> Assegnare topi per camere di condizionamento in base al loro rendimento durante il pre-test. Usando un disegno di parte, coppia somministrazione del farmaco durante i successivi 3 giorni con il vano che era meno preferito durante la linea di base pre-test. </li><li> Nel corso dei prossimi 3 giorni di condizionamento, iniettare topi con la cocaina (10 mg / kg, ip), durante la sessione del mattino e li limita nella loro camera assegnata per 1.200 sec immediatamente dopo l&#39;iniezione. Topi tornare alle loro gabbie a casa dopo la sessione. Dopo 4 ore, iniettare topi con soluzione salina (0,01 ml / gdi peso corporeo) e relegarli alla camera opposto per il secondo turno pomeridiano 1.200. </li><li> Per eseguire il test per l&#39;acquisizione, posto topi in camera centrale con porte a ghigliottina chiuse per un secondo periodo di adattamento 60. Porte a ghigliottina aperte e consentire l&#39;esplorazione libera per 1.200 secondi, con il tempo trascorso in tutte le camere registrati dal software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcola preferenza sottraendo la quantità di tempo trascorso nella camera salina-accoppiati dalla quantità di tempo trascorso nella camera di cocaina ea coppia. </li><li> Per spegnere la preferenza luogo, esporre topi per due sessioni di 20 min di libera esplorazione quotidiana dello stesso apparato, separati da almeno 2 ore, con inizio 24 ore dopo la prova di acquisto. Tempo trascorso in tutte le camere occorre nuovamente registrata e la grandezza del CPP iniziale deve essere confrontata con quella di ogni sessione estinzione. </li><li> Determinare se i topi hanno spento la preferenza indotta da farmaci da valutare se la preferenza per un parcamera di particolare attraverso due giorni di estinzione consecutivi è significativamente inferiore rispetto al punteggio di preferenza acquisizione. </li><li> Reintegrare topi con una dose primaria di cocaina (5 o 10 mg / kg, ip), e ri-esporre l&#39;apparecchio che consente di esplorazione libera e registrare il tempo trascorso in ogni vano. </li><li> Somministrare soluzione eutanasia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfusione topi con 4% paraformaldeide (PFA) ed effettuare un esame istologico per confermare il posizionamento corretto microiniezione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Regionalmente e temporalmente specifici ablazione genica tramite microiniezione stereotassico di vettori virali combinati con CPP che include estinzione e le fasi di rimessa permette di indagine dei contributi specifici di geni di tre distinte fasi di comportamenti di dipendenza simile. Mentre knockout condizionale che viene realizzato utilizzando il sistema Cre-loxP tradizionale prevede spazio-temporalmente limitato ablazione genica, stereotaxically microinjecting Cre-ricombinasi in aree distinte del cervello di topi f...

La cocaina è uno psicostimolante altamente rinforzo. A seguito di esposizione ripetuta, diversi adattamenti molecolari e cellulari che si verificano in ricompensa rilevanti circuiti cerebrali che si ritiene di provocare compulsivo di droga in cerca di comportamento, provocando alti tassi di recidiva che presentano un grave problema clinico 1. La cocaina esercita questi effetti comportamentali di lunga durata di regolare l&#39;espressione genica. Per studiare gli adattamenti derivanti da uso cronico di cocaina, roditori modelli preclinici sono stati ampiamente utilizzati. Uno di questi modelli è il luogo preferenza paradigma condizionata (CPP). Tale modello prevede lo sviluppo di una associazione tra un ambiente appreso precedentemente neutro e le proprietà gratificanti della cocaina. Dopo diversi abbinamenti di cocaina con una particolare camera, sono ammessi animali di esplorare liberamente gli ambienti di cocaina-accoppiati e non-cocaina-appaiati e se preferiscono il vano droga appaiati, si dice che essi hanno acquisito un cocaina-indotta place preferenza. Inoltre, a seguito di un periodo di formazione estinzione, questo paradigma può essere usato per studiare al contesto specifico ripristino di cocaina comportamento di ricerca. Rispetto ad altri modelli comportamentali di dipendenza comportamento simile, come sensibilizzazione psicomotorio, che viene utilizzato per studiare lungo termine indotta dalla cocaina comportamentale e plasticità molecolare 2,3 e di auto-somministrazione (SA), che si ritiene più esattamente imitare coinvolgente comportamento simile trovato negli esseri umani, il paradigma CPP è una procedura semplice per studiare la cocaina apprendimento contestuale 4. Protocolli CPP possono essere convenientemente estesi per includere l&#39;estinzione e le fasi di reintegrazione, in modo simile a SA, che consentono di studiare i meccanismi alla base di craving e la ricaduta 5-7 e che si ritiene di ricapitolare gli aspetti di ciò che avviene in umana droga in cerca di comportamento e droga - e cue-indotto ricaduta 8-10. Un meccanismo che sta alla base delcocaina-indotta plasticità comportamentale che è caratteristica di ciascuna delle distinte fasi di CPP, compresa l&#39;acquisizione, estinzione e reintegrazione, è l&#39;attivazione di firme uniche di espressione genica in differenti regioni cerebrali. Per testare direttamente quali geni all&#39;interno di regioni cerebrali premio rilevanti mediare cocaina-indotta cambiamenti comportamentali, è utile essere in grado di manipolare selettivamente in maniera regionalmente specifico. Un modo per raggiungere questo obiettivo è quello microinject vettori ricombinanti adenoassociated virali (rAAV) che esprimono la ricombinasi Cre che utilizzano la chirurgia stereotassica, in aree distinte del cervello dei topi che hanno geni bersaglio affiancati da siti LoxP (topi floxed). Questo metodo consente il controllo temporale e regionale molto preciso quando e dove i geni vengono asportate, in entrambi i neuroni divisione e non la divisione, senza indurre risposte immunitarie 11-13. Questo livello di controllo rappresenta un importante vantaggio rispetto tecnologia tradizionale Cre-loxP di allevamento topi floxed with topi esprimenti ricombinasi Cre sotto il controllo di un promotore del gene endogeno, in quanto i tempi e la distribuzione di delezione del gene possono essere più strettamente regolata. Inoltre, virali knockout genico mediata da vettori aggira potenziali effetti compensativi inerenti allo sviluppo che possono verificarsi utilizzando strategie di eliminazione diretta tradizionali. Oltre alla cocaina CPP, che è descritto qui, la microiniezione di rAAV-Cre nel cervello di topi floxed per valutare il ruolo di specifici geni può essere applicato ubiquitariamente a paradigmi comportamentali che coinvolgono fasi distinte, tra cui l&#39;auto-amministrazione e psicomotorio sensibilizzazione. Ad esempio, il nostro laboratorio ha utilizzato la tecnologia rAAV-Cre per studiare il ruolo del Ca v 1.2 di tipo L Ca 2 + canali in cocaina psicomotorio sensibilizzazione 14. In particolare, rAAV-Cre stato microiniettato nel nucleo accumbens (NAc) di topi con il gene che codifica Ca v 1.2 floxed, per dimostrare che Ca v </sub&gt; 1.2 che agisce in questa regione media la fase di espressione di sensibilizzazione psicomotoria 14,15. Tuttavia, la strategia rAAV-Cre non può essere utilizzato se non esistono topi con un gene floxed di interesse, come era la nostra esperienza nel valutare il ruolo del Ca v 1.3 di tipo L Ca 2 + canali di sensibilizzazione psicomotoria. Quindi, una limitazione di utilizzo rAAV-Cre si presenta se non esistono topi condizionali per un particolare gene di interesse. Tuttavia, rAAVs che esprimono siRNA può essere utilizzato per geni bersaglio atterramento, come abbiamo fatto per esaminare il ruolo del Ca V 1.3 canali 14,15. Microinjecting rAAV-Cre in regioni cerebrali discrete di topi floxed e poi testarle nel paradigma CPP permette di indagine i geni specifici che mediano le varie fasi del comportamento di dipendenza, come e dove operano. L&#39;utilizzo di questo paradigma ha aiutato nella nostra comprensione di come la somministrazione ripetuta di cocaina in sostanza dirotta il brains circuito ricompensa causando cambiamenti adattativi nel molecolari di trasduzione del segnale e l&#39;espressione genica che portano allo stato di tossicodipendente 1,16,17.

<table><tbody><tr><td>Camere di attività di preferenza di luogo condizionate</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di allineamento stereotassico per topo</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>modello 900</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Hamilton</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vector BioLabs, Filadelfia, PA, Stati Uniti</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting virali (rAAV) vettori ricombinanti adenoassociated esprimono Cre ricombinasi in distinte regioni del cervello del mouse in modo selettivo i geni knockout di interesse permette maggiore controllo temporalmente e specifici per ogni regione di delezione genica, rispetto ai metodi esistenti. Mentre delezione condizionale può essere ottenuto anche con accoppiamento topi che esprimono ricombinasi Cre sotto il controllo di promotori genici specifici con i topi che portano un gene floxed, microiniezione stereotassico consente per il targeting delle aree cerebrali discrete a sperimentatore-determinati punti di tempo di interesse. Nel contesto di cocaina luogo preferenza condizionata, e altri paradigmi comportamentali della cocaina come l&#39;auto-somministrazione o psicomotorio sensibilizzazione che può coinvolgere recesso, estinzione e / o fasi di rimessa, questa tecnica è particolarmente utile a esplorare il contributo unico di geni bersaglio di questi distinti fasi di modelli comportamentali di cocaina indotta plasticità. Specificamente,Questa tecnica permette di ablazione selettiva di geni bersaglio durante fasi distinte di un comportamento di testare il loro contributo al comportamento nel tempo. In definitiva, questa comprensione permette terapeutica più mirati che sono meglio in grado di affrontare i fattori di rischio più potenti che si presentano nel corso di ogni fase del comportamento di dipendenza.

CPP Dopo aver eseguito CPP sui topi microiniettati, si dovrebbe verificare che il gruppo di controllo a iniezione (rAAV-GFP) topi hanno normalmente acquisito preferenza per la camera di farmaco-accoppiato (Figura 1A, 1B). I topi sono considerati di aver acquisito la preferenza per una particolare camera di preferenza quando la cocaina (tempo trascorso nella camera di cocaina-accoppiato meno tempo trascorso in camera salina-accoppiato) è significativamente più alto rispetto al b...

Questo articolo viene descritto come microinject vettori virali nel cervello di topo e poi prova in un luogo climatizzato preferenza paradigma che comprende una fase di acquisizione, l&#39;estinzione e la reintegrazione.

Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ablare selettivamente geni bersaglio durante fasi distinte del paradigma di preferenza per il contesto, al fine di verificarne il contributo a questo comportamento nel tempo. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante microiniezione stereotassica del vettore virale associato all'eno ricombinante che esprime la ricombinasi Cre. Successivamente, ai topi viene consentito di riprendersi nella gabbia di provenienza per 10-14 giorni, per garantire una massima riattivazione di C.Il terzo passaggio della procedura consiste nel sottoporre i topi al test di preferenza condizionata del posto, inclusi i passaggi di acquisizione, estinzione e ripristino. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'esecuzione di un'esame istologico sui topi microiniettati per verificare la corretta posizione delle microiniezioni. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano modifiche nel comportamento di acquisizione, estinzione e/o ripristino in risposta all'eliminazione genica mediante test comportamentali di preferenza condizionata del posto.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sistema di accoppiamento CRE lock P è che consente una temporizzazione più specifica e una specificità anatomica discreta dell'interruzione genica, permettendo di indagare la perdita di funzione del gene in ciascuna fase del comportamento. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento dei comportamenti addittivi poiché implicano una migliore comprensione della base genetica che potrebbe sottostare al modo in cui l'esposizione a stimoli contestuali può innescare ricordi legati alla cocaina, che potrebbero provocare desiderio e ricadute negli individui dipendenti. Per iniziare, posizionare una gabbia per topi con lettiera su un riscaldatore per riscaldarla in previsione del recupero postoperatorio.Preparare un rasoio elettrico per la rasatura del capo e dell'etanolo e iodio per sterilizzare il cuoio capelluto. Utilizzare etanolo al 70% per pulire le barre auricolari e il supporto per la bocca dello stereotassico utilizzando una siringa Hamilton da cinque microlitri. Aspirare cinque microlitri di vettore virale e posizionarli in un supporto per siringa sullo stereotassico.Posizionare una borsa del caldo microonde o un cerotto elettrico sullo stereotassimetro dopo aver iniettato nel topo una miscela di ketamina e xilazina per via intraperitoneale. Secondo il protocollo descritto, eseguire una pinzatura della coda per verificare il livello di sedazione. Successivamente, rasare la testa tra le orecchie e gli occhi e utilizzare applicatori di cotone sterili per pulire l'area con lavaggi alternati di etanolo e iodio.Quindi trasferire il topo sul pad riscaldato dello stereotassico. Regolare le scale della barra dentale e delle barre auricolari e posizionare i denti del topo nella barra dentale, quindi avvitare la maschera facciale e le barre auricolari. Se si osserva qualsiasi movimento o oscillazione dei baffi.Somministrare una dose di richiamo del cocktail a base di chetamina e xilazina. Quindi lubrificare gli occhi per impedire che si secchino. Successivamente, utilizzando un taglio con bisturi, aprire il cuoio capelluto fino appena dietro le orecchie.Posizionare clip a becco di papera sugli angoli del cuoio capelluto per staccare la pelle dal cranio. Assicurarsi che Bgma e Lambda siano facilmente visibili. Verificare che la sutura da bgma a Lambda sia allineata e riposizionare la testa se necessario.Dopo aver verificato che le impostazioni dell'attacco stereo siano azzerate, posizionare la punta dell'ago a bma. Misurare le coordinate dorsoventrali, mediolaterali e anteroposteriori sia per BMA che per lambda. Successivamente, regolare la posizione della testa finché le coordinate ventrali di BMA e lambda non differiscano tra loro di meno di 0,02 millimetri.Ricentra la punta dell'ago su bgma e, da quel punto, spostati in direzione anteriore-posteriore fino alla coordinata desiderata. Successivamente pratica un foro alla coordinata desiderata. Verifica che l'ago possa entrare senza essere ostacolato dal cranio, quindi abbassa l'ago fino alla coordinata ventrale desiderata.Raggiunta la coordinata, immergere di 0,015 millimetri al di sotto per circa 10 secondi per creare una piccola tasca per il vettore virale, quindi iniettare il volume desiderato di vettore virale a una velocità di circa 0,1 microlitri al minuto dopo aver atteso tre minuti per consentire la diffusione del vettore virale; sollevare la punta dell'ago di 0,015 millimetri e attendere ulteriori due minuti. Al termine delle iniezioni, applicare cera d'osso per sigillare entrambi i fori e successivamente suturare il cuoio capelluto. Infine, applicare un blocco nervoso sulla zona ferita.Rimuovere il topo dallo stereotassico e posizionarlo in una gabbia calda su un blocco riscaldante per farlo riprendere per 45 minuti fino a un'ora. Lasciare il topo in recupero per almeno 10 giorni per permettere una riattivazione massimale. Somministrare all'animale acqua e cibo ammorbidito, e buprenorfina due volte al giorno se necessario per il dolore dopo il recupero; posizionare i topi nella camera centrale di un apparato per il test di preferenza del posto a tre camere per un periodo di abituazione di 62° con le porte a ghigliottina chiuse.Dopo l'abituazione, aprire le porte a ghigliottina e consentire ai topi di esplorare liberamente tutte e tre le camere per 1200 secondi. Utilizzare il software Med PC quattro per registrare il tempo trascorso dagli animali in ciascuna camera seguendo le indicazioni del protocollo testuale. Assegnare i topi alle camere di condizionamento in base alla loro prestazione durante il pretest.Nel corso dei tre giorni successivi, iniettare 10 milligrammi per chilogrammo di cocaina durante una sessione mattutina e immediatamente posizionare i topi nella camera assegnata per 1200 secondi. Riportare i topi nelle loro gabbie di provenienza per quattro ore, quindi iniettare soluzione fisiologica e immediatamente confinare i topi nell'altra camera per 1200 secondi. Per verificare l'acquisizione, posizionare i topi nella camera centrale con le porte a saracinesca chiuse per un periodo di abituazione di 62 secondi.Aprire le porte a ghigliottina e consentire un'esplorazione libera per 1200 secondi o per la registrazione. Il tempo trascorso in tutte le camere permette di calcolare la preferenza sottraendo il tempo trascorso nella camera abbinata al soluto salino dal tempo trascorso nella camera abbinata alla cocaina. Dopo aver eseguito il CPP su topi microiniettati, si ritiene che abbiano acquisito una preferenza per una particolare camera.Quando la preferenza per la cocaina, definita come il tempo trascorso nella camera abbinata alla cocaina meno il tempo trascorso nella camera abbinata al soluto fisiologico, è significativamente più elevata rispetto al punteggio di preferenza basale. Se, come controllo del gruppo, i topi iniettati non mostrano preferenza per la camera abbinata alla cocaina o mostrano un'avversione, la collocazione viene verificata immediatamente mediante istologia, e quei topi con collocazione errata vengono esclusi dallo studio. Se la preferenza viene normalmente acquisita dal gruppo di controllo iniettato, il paradigma viene esteso avviando la fase di estinzione.Si ritiene che i topi abbiano estinto la preferenza indotta dalla droga per una particolare camera. Quando la preferenza per la cocaina in due giorni consecutivi di estinzione è significativamente inferiore rispetto al punteggio di preferenza durante l'acquisizione, è possibile effettuare un recupero mediante una dose di richiamo della droga. Se il punteggio di preferenza dopo l'amministrazione della dose di richiamo non differisce statisticamente da quello registrato durante l'acquisizione, si dice che quella coorte abbia recuperato la preferenza indotta dalla droga per la camera associata alla droga mediante PCR quantitativa.Questa figura dimostra che il gene di interesse &egrave; effettivamente stato eliminato nei topi microiniettati in seguito alla microiniezione di RAAV Cree GFP nel nucleo accumbens che presenta l'isoforma del canale del calcio di tipo L, CAV 1.2 flocks di RAAV. I campioni prelevati dai topi iniettati con Cree mostrano una significativa riduzione dell'espressione genica rispetto ai topi iniettati con A-A-V-G-F-P mostrati qui. L'analisi immunohistochimica del nucleo accumbens per GFP rivela un corretto posizionamento bilaterale del RAAV Cree microiniettato a seguito di questa procedura.Tecniche alternative, come la PCR quantitativa in tempo reale e il Western blotting, possono essere eseguite per rispondere a domande riguardanti l'effetto dell'abbattimento di un gene sui livelli di espressione di altri geni di interesse. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una comprensione migliore di come ablare selettivamente geni bersaglio nel cervello del mouse mediante l'uso di vettori virali iniettati per microiniezione stereotassica, al fine di testare in modo selettivo il ruolo di questi geni nell'acquisizione, nell'estinzione e nel recupero del paradigma della preferenza per il posto condizionato.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Fonte: Chen, S., et al., Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica nelle cellule striatali del cervello di topo neonatale. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un vettore virale che codifica per la Cre ricombinasi e la proteina a fluorescenza verde o GFP nello striato di un cucciolo di topo geneticamente modificato per ottenere la manipolazione genica asportando una cassetta STOP fiancheggiata da loxP, attivando la proteina a fluorescenza rossa o RFP...

Microiniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione genica in uno striato di cucciolo di topo

Fonte: Pereira, M. et. al., Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti in interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un virus adeno-associato nella corteccia cerebrale di un topo transgenico per fornire la riprogrammazione neuronale Cre-dipendente e i geni reporter fluorescenti nelle cellule gliali.

Iniezione stereotassica di vettori virali per la riprogrammazione delle cellule gliali in un modello murino

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i...

Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare...

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l'espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).

L&#39;applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

I roditori sono un modello appropriato per studiare i substrati molecolari del comportamento e dei disturbi psichiatrici complessi. La microiniezione cerebrale nei roditori svegli può essere utilizzata per chiarire i substrati della malattia. Viene presentato un metodo di microiniezione cerebrale efficiente e personalizzabile, nonché l'esecuzione di un paradigma operante che quantifica la motivazione.

Roditore cervello microiniezione di studio molecolare substrati di Motivato Behavior

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.

Usare l'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti

Impara la microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi nel cervello del topo per studiare il ruolo di geni bersaglio nelle fasi di acquisizione, estinzione e reinstatement della condizionata place preference.

Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference (Video) | JoVE Journal

Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

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