Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ablare selettivamente i geni bersaglio durante le fasi discrete del paradigma di preferenza del luogo della condizione per testare il loro contributo a questo comportamento nel tempo. Ciò si ottiene iniettando prima il micro stereotassico del vettore virale ricombinante eno-associato che esprime la ricombinasi Cree. Successivamente, i topi possono riprendersi nella loro gabbia domestica per 10-14 giorni per la massima riattivazione del C.

La terza fase della procedura consiste nel testare i topi in preferenza di luogo condizionata, comprese le fasi di acquisizione, estinzione e reintegrazione. La fase finale della procedura consiste nell'eseguire un esame istologico di micro topi iniettati per convalidare il corretto posizionamento della micro iniezione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti nel comportamento di acquisizione, estinzione e/o reintegrazione in risposta al knockout genico attraverso test comportamentali di preferenza di luogo di condizione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sistema di accoppiamento CRE lock P, è che consente una tempistica più specifica e una specificità anatomica del gene knockout in modo discreto, consentendo lo studio della perdita di gene in ogni fase del comportamento. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento del comportamento di dipendenza perché implica una migliore comprensione delle basi genetiche che possono essere alla base di come l'esposizione a segnali contestuali può innescare ricordi legati alla cocaina che possono provocare desiderio e ricaduta nei tossicodipendenti. Per iniziare, posiziona una gabbia per topi con lettiera su un blocco termico per riscaldarla per il recupero postoperatorio.

Prepara un rasoio elettrico per raderti la testa ed etanolo e iodio per sterilizzare il cuoio capelluto. Usa il 70% di etanolo per pulire le barre auricolari e la presa in bocca degli attacchi stereo usando una siringa Hamilton da cinque microlitri. Prelevare cinque microlitri di vettore virale e posizionarlo in un porta siringa Sugli attacchi stereo.

Posizionare un termoforo a microonde o un elettropad sugli attacchi stereo dopo aver iniettato nel mouse un'iniezione IP di un cocktail di ketamina xilazina. Secondo il protocollo di testo, eseguire un pizzicamento della coda per controllare il livello di sedazione. Successivamente, rasare la testa tra le orecchie e gli occhi e utilizzare applicatori di cotone sterile per pulire l'area con lavaggi alternati di etanolo e iodio.

Quindi trasferire il mouse sul pad riscaldato sullo stereo attacca lo zero. La barra dei denti e la barra delle orecchie si squamano e posizionano i denti del mouse nella barra dei denti, avvitano il muso e le barre auricolari. Se si nota un movimento di oscillazione o di baffi.

Somministrare una dose di richiamo del cocktail di ketamina xilazina. Quindi lubrificare gli occhi per evitare che si secchino. Quindi, usando un taglio a bisturi, apri il cuoio capelluto appena dietro le orecchie.

Posiziona le clip per bulldog sugli angoli del cuoio capelluto per staccare la pelle dal cranio. Assicurarsi che Bgma e Lambda siano facilmente visibili. Assicurarsi che la sutura da bgma a Lambda sia allineata e riposizionare la testa se necessario.

Dopo aver verificato che le impostazioni dell'attacco stereo sono azzerate, posizionare la punta dell'ago su bma. Misurare le coordinate dorsale, ventrale, mediale, laterale e anteriore, posteriore sia per BMA che per lambda. Quindi regolare la testa fino a quando le coordinate ventrali per BMA e lambda non si trovano entro 0,02 millimetri l'una dall'altra.

Centrare nuovamente la punta dell'ago sulla bgma e da quel punto spostarsi in direzione antero-posteriore fino alla coordinata desiderata. Quindi praticare un foro alla coordinata desiderata. Verificando che l'ago sia in grado di entrare ininterrottamente dal cranio, quindi abbassare l'ago alla coordinata ventrale desiderata.

Una volta raggiunta la coordinata, immergersi di 0,015 millimetri sotto di essa per circa 10 secondi per creare una piccola tasca per il vettore virale a una velocità di circa 0,1 microlitri al minuto, iniettare il volume desiderato di vettore virale dopo aver atteso tre minuti per la diffusione del vettore virale, sollevare la punta dell'ago di 0,015 millimetri e attendere altri due minuti. Al termine delle iniezioni, applicare la cera ossea per sigillare entrambi i fori e quindi suturare il cuoio capelluto. Infine, applicare il blocco nervoso sulla zona ferita.

Rimuovi il mouse dagli attacchi stereo e mettilo in una gabbia calda su un blocco termico per riprenderlo da 45 minuti a un'ora. Lasciare che il mouse si riprenda per almeno 10 giorni per consentire la massima riattivazione. Somministrare all'animale acqua e ammorbidire il cibo e la buprenorfina due volte al giorno, se necessario per il dolore dopo il recupero, posizionare i topi nella camera centrale di un apparecchio di preferenza di posizionamento a tre camere per un 62° periodo di assuefazione con le porte a ghigliottina chiuse.

Dopo l'assuefazione, apri le porte della ghigliottina e lascia che i topi esplorino liberamente tutte e tre le camere per 1200 secondi. Utilizza il software Med PC four per registrare il tempo trascorso dall'animale in ogni camera utilizzando le linee guida del protocollo di testo. Assegna i topi alle camere di condizionamento in base alle loro prestazioni durante il pretest.

Durante i tre giorni successivi, iniettare 10 milligrammi per chilogrammo di cocaina durante una sessione mattutina e combinarli immediatamente nella camera assegnata per 1200 secondi. Rimetti i topi nelle loro gabbie domestiche per quattro ore, quindi inietta loro soluzione salina e confina immediatamente i topi nella camera opposta per 1200 secondi. Per testare l'acquisizione, posizionare i topi nella camera centrale con le porte a ghigliottina chiuse per un periodo di 62° assuefazione.

Apri le porte a ghigliottina e consenti l'esplorazione libera per 1200 secondi o la registrazione. Il tempo trascorso in tutte le camere calcola la preferenza sottraendo la quantità di tempo trascorso nella camera di coppia salina dalla quantità di tempo trascorso nella camera di coppia di cocaina. Dopo aver eseguito la CPP su topi microiniettati, si ritiene che abbiano acquisito la preferenza per una particolare camera.

Quando la preferenza per la cocaina è definita come il tempo trascorso nella camera di coppia della cocaina meno il tempo trascorso nella camera della coppia salina è significativamente più alta rispetto al punteggio di preferenza di base. Se, come controllo di coorte, i topi iniettati non mostrano una preferenza per la camera di coppia della cocaina o lo mostrano, il posizionamento dell'avversione viene verificato immediatamente tramite istologia e i topi con posizionamento errato vengono eliminati dallo studio. Se la preferenza viene normalmente acquisita dalla coorte di controllo iniettata, il paradigma viene esteso iniziando l'estinzione.

Si ritiene che i topi abbiano estinto la preferenza indotta dal farmaco per una particolare camera. Quando la preferenza per la cocaina in due giorni consecutivi di estinzione è significativamente più bassa rispetto al punteggio di preferenza per l'acquisizione in questo momento, si può reintegrare con un picco di droga. Se il punteggio di preferenza dopo la somministrazione del farmaco prime è statisticamente indistinguibile da quello al momento dell'acquisizione, allora si dice che quella coorte ha ripristinato la preferenza indotta dal farmaco per la camera accoppiata del farmaco utilizzando la PCR quantitativa.

Questa figura dimostra che il gene di interesse è stato effettivamente eliminato in topi microiniettati a seguito di micro iniezione di RAAV Cree GFP nel nucleo accumbens che ha l'isoforma del canale del calcio di tipo L, CAV 1.2 stormi di RAAV. I punch iniettati con Cree mostrano una significativa diminuzione dell'espressione genica rispetto ai topi iniettati con A-A-V-G-F-P mostrati qui. L'analisi immunoistochimica del nucleo accumbens per GFP rivela il corretto posizionamento bilaterale del RAAV Cree microiniettato Seguendo questa procedura.

Altre tecniche come la PCR quantitativa in tempo reale e il Western bodying possono essere eseguite per rispondere a domande riguardanti l'effetto del knockdown di un gene sui livelli di espressione di altri geni di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come ablare selettivamente i geni bersaglio nel cervello di topo utilizzando vettori virali di microiniezione stereotassica al fine di testare selettivamente il ruolo di questi geni nell'acquisizione, estinzione e ripristino del paradigma di preferenza del luogo della condizione.