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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Il Metodo ELISA

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The ELISA Method

2.7: Bacterial Transformation: Electroporation

2.9: Plasmid Purification

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10:06 min

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April 30, 2023

Overview

Un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) viene in genere eseguito per rilevare la presenza e/o la quantità di una proteina bersaglio di interesse all’interno di un campione sperimentale. Il rilevamento della proteina bersaglio è reso possibile dagli anticorpi, che rendono l’ELISA un test immunologico. Attraverso una serie di fasi di incubazione e lavaggio, questi anticorpi, che sono spesso collegati, o coniugati, a un enzima, rileveranno il rivestimento proteico del fondo di un pozzo su una piastra di microtitolazione. Se esposto a un substrato, l’enzima legato agli anticorpi causerà un cambiamento di colore, indicando così la presenza della proteina di interesse nel campione.

In questo video, viene spiegata la teoria alla base del funzionamento degli ELISA, inclusa una discussione sul legame degli anticorpi primari e secondari e sull’importanza delle fasi di blocco. La teoria è seguita dalla pratica, mentre il video progredisce verso una spiegazione della procedura passo-passo. Infine, vengono introdotte varianti dell’ELISA standard come il sandwich e gli ELISA competitivi e vengono spiegate le applicazioni reali di questo metodo, come nei test di gravidanza da banco.

Procedure

L’ELISA, o saggio immunoassorbente enzimatico, è un metodo ampiamente utilizzato per determinare la presenza o l’assenza di una specifica proteina bersaglio.

Attraverso una serie di fasi di lavaggio e legame, un anticorpo coniugato, o collegato, a un enzima riconoscerà una proteina bersaglio sul fondo di una piastra a 96 pozzetti. Quando il substrato viene aggiunto al campione, si verificherà una reazione enzimatica, causando un cambiamento di colore che consente l’identificazione e la quantificazione della proteina bersaglio.

Prima di discutere su come eseguire un ELISA, familiariamo con le apparecchiature e i reagenti di cui avrai bisogno.

L’impostazione per una reazione ELISA è in genere una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. I fondi piatti dei pozzi contribuiranno a facilitare una distribuzione uniforme del campione sperimentale, nonché gli anticorpi di cattura e rilevamento.

Gli ELISA rilevano la presenza di specifiche proteine bersaglio in soluzioni acquose sperimentali. Urina, mezzi di coltura cellulare e siero sono campioni sperimentali comuni.

In un ELISA, l’anticorpo che si lega direttamente alla proteina bersaglio è l’anticorpo primario. Ha un’alta affinità, cioè un’alta capacità di legarsi strettamente, per un epitopo – una regione specifica – della proteina bersaglio. L’anticorpo primario è di solito non etichettato o non coniugato.

Come accennato, gli anticorpi si legano principalmente alle loro proteine bersaglio attraverso un legame ad alta affinità a un epitopo specifico. Tuttavia, il campione sperimentale può contenere pezzi di cellule che esprimono siti di legame non specifici, siti che possono legare la regione costante o non specifica dell’epitopo degli anticorpi del rivelatore.

Pertanto, l’aggiunta di un buffer di blocco è essenziale in un ELISA per coprire eventuali siti di legame non specifici nei campioni sperimentali. Altrimenti potresti avere reazioni enzimatiche che si verificano in pozzi che non contengono proteine bersaglio, dandoti dati falsi positivi!

L’anticorpo secondario in un ELISA è l’anticorpo utilizzato per riconoscere l’anticorpo primario. Questo anticorpo è solitamente coniugato a un enzima. A volte l’anticorpo secondario ha un nome funky. Ad esempio, se l’anticorpo secondario prodotto, o allevato, in un asino per riconoscere un anticorpo primario allevato in una capra, l’anticorpo secondario sarebbe chiamato anticorpo anti-capra asino. Quando si tratta di nominare gli anticorpi secondari, il primo nome indica l’organismo che ha prodotto l’anticorpo secondario e il secondo nome rappresenta l’organismo che produce l’anticorpo primario.

Sarà inoltre necessario un substrato che si lega al sito attivo dell’enzima legato all’anticorpo secondario. La reazione chimica che si verifica durante questa reazione provoca un cambiamento di colore nel substrato altrimenti incolore. Questo cosiddetto saggio colorimetrico consente l’identificazione e la quantificazione della presenza della proteina bersaglio.

La reazione enzimatica continuerà finché c’è substrato disponibile. Pertanto, dopo un breve periodo di incubazione, una soluzione di arresto, che provoca l’ennesimo cambiamento di colore per indicare che la reazione è stata effettivamente interrotta, viene aggiunta ai pozzezze.

Un lettore di micropiasche verrà utilizzato per quantificare la concentrazione della proteina di interesse in ciascun pozzetto leggendo l’assorbanza, cioè la quantità di prodotto colorato, in ogni pozzetto. L’assorbanza è proporzionale alla quantità di proteina bersaglio presente.

Ora che hai tutta la tua attrezzatura pronta, eseguiamo un ELISA!

Per eseguire un ELISA standard, o diretto, prima rivestire i pozzetti della piastra a 96 pozzetti con la proteina bersaglio di interesse diluita nel tampone di rivestimento. Placca i tuoi controlli positivi e negativi anche in questo momento.

Dopo aver incubato la piastra rivestita abbastanza a lungo da dare alla proteina il tempo di assorbire completamente, o attaccare, al fondo della piastra, scaricare la soluzione di rivestimento in eccesso con un rapido movimento del polso.

Quindi bloccare qualsiasi possibile legame non specifico o segnale di fondo incubando ogni pozzo nel buffer di blocco.

Ora scarica il tampone di blocco e lava i pozzezze con una breve incubazione a temperatura ambiente in soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e 1% BSA.

Mentre i pozzetto vengono risciacquati con PBS, preparare diluizioni di una concentrazione nota della proteina bersaglio per creare una curva standard. L’assorbanza dei pozzetto a curva standard, che contengono concentrazioni note della proteina bersaglio, verrà utilizzata per calcolare la concentrazione di proteina bersaglio nei pozzetto campione sperimentali sulla base di un confronto tra l’assorbanza dei pozzetto campione e l’assorbanza dei pozzetto a curva standard.

Ora è il momento di aggiungere il rilevamento o l’anticorpo primario!

La piastra viene quindi incubata, di solito a temperatura ambiente, per consentire una quantità sufficiente di anticorpi di legarsi alla proteina bersaglio per una successiva rilevazione e quantificazione della proteina.

Dopo questa incubazione, l’anticorpo in eccesso viene rimosso e i pozzi vengono brevemente lavati con PBS.

L’anticorpo secondario viene quindi aggiunto alla piastra e la piastra viene nuovamente incubata , in genere su una piattaforma rotante – per consentire all’anticorpo secondario di legarsi. Le fasi di lavaggio vengono ripetute come prima.

Quindi, aggiungi il substrato alla piastra per vedere quali pozzetti contengono la tua proteina bersaglio. Coprire la piastra per proteggere la reazione dalla luce, quindi dopo una breve incubazione, arrestare la reazione con la soluzione di arresto.

Infine, posizionare la piastra nel lettore di micropiasche per misurare l’assorbanza o la quantità di soluzione colorata, in ciascun pozzo. Dovrai selezionare quali pozzi vuoi che il lettore analizzi. Quando lo strumento ha finito di leggere la piastra, verrà visualizzata una lettura dell’assorbanza per ciascun pozzo.

È importante notare che ogni kit ELISA ha un limite di rilevamento. Cioè, solo le concentrazioni proteiche al di sopra e al di sotto dei limiti specifici possono essere determinate con precisione. Concentrazioni molto piccole di proteine sono di solito troppo vicine ai livelli di fondo di colorazione non specifica, mentre concentrazioni molto elevate possono indicare che l’eccesso di proteine o anticorpi non è stato adeguatamente lavato via in quel pozzo campione.

Allora perché potresti eseguire un ELISA? Diamo un’occhiata ad alcune applicazioni comuni.

Probabilmente il tipo più comune di ELISA eseguito è il sandwich ELISA.

In un SANDWICH ELISA, una piastra a 96 pozzetti viene rivestita prima con un anticorpo primario che riconosce la proteina bersaglio di interesse.

In questo esperimento, i mezzi di coltura cellulare raccolti da linee cellulari che producono anticorpi umani, sono stati placcati da un sistema automatizzato su piastre a 96 pozzetti pre-rivestite con un anticorpo primario che riconosce gli anticorpi umani.

Dopo aver lavato via il campione in eccesso con PBS, viene aggiunto un anticorpo secondario legato all’enzima, seguito da un substrato colorimetrico.

L’assorbanza viene quindi misurata allo stesso modo di un tipico ELISA. Ad esempio, in questo esperimento, questi dati ELISA saranno utilizzati per determinare quali linee cellulari producono l’anticorpo umano con la più alta affinità per – che è la migliore capacità di legarsi accuratamente – al suo antigene bersaglio.

Il test di gravidanza da banco è un tipo di sandwich ELISA.

Quando l’urina della donna potenzialmente incinta viene aggiunta al test, gli anticorpi primari enzimatici collegati al test legheranno l’ormone della gravidanza hCG se è presente. Se la donna è incinta, si verificherà una reazione substrato-enyzme quando gli anticorpi primari sono riconosciuti dagli anticorpi secondari legati al substrato nel sito del test e apparirà una linea colorata.

Un altro tipo di ELISA è l’ELISA competitivo, che può essere utilizzato per rilevare la presenza di anticorpi.

Se gli anticorpi di interesse sono presenti nel campione, si legheranno alla proteina bersaglio attaccata al fondo della piastra. Successivamente, quando gli anticorpi di rilevamento legati all’enzima vengono aggiunti alla piastra, gli anticorpi legati all’enzima troveranno poche o nessuna proteina da legare; saranno stati “superati” dagli anticorpi di interesse nel campione sperimentale.

In un ELISA competitivo, poi, i pozzeggi colorati indicano i campioni che in realtà non contengono l’anticorpo di interesse! I campioni di plasma del paziente vengono in genere eseguiti in un ELISA competitivo al fine di determinare se gli anticorpi per determinati agenti patogeni, come il virus HIV, sono presenti nel campione.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE all’esecuzione di un ELISA. In questo video abbiamo recensito: cos’è un ELISA e come funziona; quali attrezzature e reagenti dovrai eseguire ed ELISA; e alcune diverse applicazioni del test. Grazie per aver guardato, e ricorda di non lasciare che il tuo substrato si sviluppi troppo!

Transcript

The ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, is a widely used method for determining the presence or absence of a specific target protein.

Via a series of washing and binding steps, an antibody conjugated, or linked, to an enzyme will recognize a target protein at the bottom of a 96-well plate. When substrate is added to the sample, an enzymatic reaction will occur, causing a color change that allows the identification and quantification of the target protein.

Before we discuss how to perform an ELISA, let’s get familiar with the equipment and reagents that you will need.

The setting for an ELISA reaction is typically a 96-well flat bottom plate. The flat bottoms of the wells will help facilitate an even distribution of your experimental sample, as well as your capture and detection antibodies.

ELISAs detect the presence of specific target proteins in experimental aqueous solutions. Urine, cell culture media, and serum are common experimental samples.

In an ELISA, the antibody that directly binds to the target protein is the primary antibody. It has high affinity, that is, a high ability to bind tightly, for an epitope – a specific region – of the target protein. The primary antibody is usually unlabeled, or un-conjugated.

As mentioned, antibodies mostly bind to their target proteins through high affinity binding to a specific epitope. However, the experimental sample may contain pieces of cells that express nonspecific binding sites, sites that can bind the constant, or non-epitope specific, region of your detector antibodies.

Therefore, addition of a blocking buffer is essential in an ELISA to cover any nonspecific binding sites in your experimental samples. Otherwise you may have enzymatic reactions occurring in wells that do not contain target protein, giving you false positive data!

The secondary antibody in an ELISA is the antibody used to recognize the primary antibody. This antibody is usually conjugated to an enzyme. Sometimes the secondary antibody has a funky name. For example, if the secondary antibody made, or raised, in a donkey to recognize a primary antibody raised in a goat, the secondary antibody would be called a donkey anti-goat antibody. When it comes to naming secondary antibodies, the first name indicates the organism that produced the secondary antibody, and the second name represents the organism that produces the primary antibody.

A substrate, which binds to the active site of the enzyme linked to the secondary antibody, will also be needed. The chemical reaction that occurs during this reaction causes a color change in the otherwise-colorless substrate. This so-called colorimetric assay allows the identification and quantification of the presence of the target protein.

The enzymatic reaction will continue as long as there is available substrate. Therefore, after a brief incubation period, a stop solution, which causes yet another color change to indicate the reaction has in fact been halted, is added to the wells.

A microplate reader will be used to quantify the concentration of the protein of interest in each well by reading the absorbance, that is, the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the amount of target protein present.

Now that you have all your equipment ready, let’s run an ELISA!

To perform a standard, or direct, ELISA, first coat the wells of the 96-well plate with your target protein of interest diluted in coating buffer. Plate your positive and negative controls at this time as well.

After incubating the coated plate long enough to give the protein time to completely adsorb, or attach, to the bottom of the plate, dump off the excess coating solution with a quick flick of your wrist.

Then block any possible non-specific binding or background signal by incubating each well in blocking buffer.

Now dump off the blocking buffer and wash the wells with a brief room temperature incubation in phosphate buffered saline, or PBS, and 1% BSA.

While the wells are being rinsed with PBS, prepare dilutions of a known concentration of the target protein to create a standard curve. The absorbance of the standard curve wells, which contain known concentrations of the target protein, will be used to calculate the concentration of target protein in your experimental sample wells based on a comparison of the absorbance of the sample wells to the absorbance of the standard curve wells.

Now it’s time to add the detection or primary antibody!

The plate is then incubated, usually at room temperature, to allow a sufficient amount of antibody to bind to the target protein for later detection and quantification of the protein.

After this incubation, excess antibody is removed and the wells are briefly washed with PBS.

Secondary antibody is then added to the plate, and the plate is once again incubated – typically on a rotating platform – to allow secondary antibody to bind. Washing steps are repeated as before.

Next, add the substrate to the plate to see which wells contain your target protein. Cover the plate to protect the reaction from light, and then after a brief incubation, halt the reaction with stop solution.

Finally, place your plate in the microplate reader to measure the absorbance or amount of colored solution, in each well. You will need to select which wells you want the reader to analyze. When the instrument is finished reading the plate, a readout of the absorbance for each well will be displayed.

It is important to note that each ELISA kit has a detection limit. That is, only protein concentrations above and below specific limits can be accurately determined. Very small concentrations of protein are usually too close to the background levels of non-specific staining, while very high concentrations may indicate that excess protein or antibody was not properly washed away in that sample well.

So why might you perform an ELISA? Let’s take a look at a few common applications.

Probably the most common type of ELISA performed is the sandwich ELISA.

In a sandwich ELISA, a 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein of interest.

In this experiment, cell culture media harvested from human antibody-producing cell lines, were plated by an automated system onto 96-well plates pre-coated with a primary antibody that recognizes human antibodies.

After washing away the excess sample with PBS, an enzyme-linked secondary antibody is added, followed by a colorimetric substrate.

The absorbance is then measured in the same way as for a typical ELISA. For example, in this experiment, this ELISA data will be used to determine which cell lines produce the human antibody with the highest affinity for – that is best ability to bind accurately to – its target antigen.

The over-the-counter pregnancy test is one type of sandwich ELISA.

When the potentially pregnant woman’s urine is added to the test, enzyme-linked primary antibodies attached to the test will bind the pregnancy hormone hCG if it is present. If the woman is pregnant, a substrate-enyzme reaction will occur when the primary antibodies are recognized by substrate-bound secondary antibodies at the test site, and a colored line will appear.

Another type of ELISA is the competitive ELISA, which can be used to detect the presence of antibodies.

If the antibodies of interest are present in the sample, they will bind to the target protein attached to the bottom of the plate. Later, when enzyme-linked detection antibodies are added to the plate, the enzyme-linked antibodies will find few to no proteins to bind; they will have been “out-competed” by the antibodies of interest in the experimental sample.

In a competitive ELISA, then, the colored wells indicate the samples that actually do not contain the antibody of interest! Patient plasma samples are typically run in a competitive ELISA in order to determine if antibodies for certain pathogens, like the HIV virus, are present in the sample.

You’ve just watched JoVE introduction to performing an ELISA. In this video we reviewed: what an ELISA is and how it works; what equipment and reagents you will need to perform and ELISA; and some different applications of the assay. Thanks for watching, and remember not to let your substrate overdevelop!