Name: Permeabilizzazione delle cellule Aderito utilizzo di un gas inerte Jet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Scopri la permeabilizzazione temporanea delle cellule aderenti utilizzando un jet di gas inerte. Questo metodo facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole nelle cellule mammifere aderenti.

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Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), le scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC).

1. Sviluppo di LabView Programma <ol><li> Un controllore di flusso di massa (MKS M100B Mass-Flo Controller) è collegato alla linea di gas elio per garantire una portata gas precisa. Questa unità è controllata da una tensione di ingresso, compreso tra 0 e 5 V. Un circuito di controllo nel programma LabView determina la tensione richiesta in un dato momento. Interfacciamento tra il computer ed il controllore di flusso di massa è eseguita con un dispositivo di acquisizione dati (NI USB-6009), e un alimentatore 12 V fornisce alimentazione al controllore di flusso di massa. </li><li> Due slitte di posizionamento lineari sono usati per controllare il movimento della piastra da 6 pozzetti, uno per ciascuna direzione. Ogni gruppo è costituito da una serie MA15 Velmex Assemblea Unislide accoppiato con un motore passo-passo, ed entrambi i gruppi sono controllati da un unico Velmex VXM Stepping Motor Controller. Il controllore consente pareggiare manuale di ogni motore o accetta una stringa di comandi seriali esterni, la cui combinazione consente di movimento specifico patterns. Diversi modelli possono essere programmati nel programma LabView, richiedere all&#39;utente di fornire solo la velocità torcia desiderato così come le dimensioni di percorso. </li></ol> 2. Preparazione delle attrezzature <ol><li> Aprire sia la bombola di elio e il regolatore. </li><li> Accendere il controller del motore. </li><li> Aprire il programma LabView e verificare tutte le condizioni. </li><li> Assicurarsi che la piattaforma sia centrato. Per controllare, guardare in ogni fase del motore e verificare che ogni carrello non è vicino a entrambe le estremità palco. O hanno al centro del programma le carrozze o regolare manualmente utilizzando i comandi da jogging sul frontale del controller del motore. </li><li> Se questa è la prima corsa della giornata, si consiglia di eseguire il programma una volta senza le cellule, al fine di garantire il setup è corretto. </li></ol> 3. Preparazione del Height Gas Jet capillare Nozzle <ol><li> Rimuovere il capillare dal supporto e azzerare il quadrante altezza. </li><li> Posizionare la piastra da 6 pozzetti on la piattaforma. </li><li> Sostituire e abbassare il capillare getto di gas al fondo del pozzo fino a raggiungere il vetrino. Fissare la capillare nel supporto. </li><li> Utilizzando la manopola di altezza, sollevare il capillare 3 mm. Segnare questa altezza sulla base capillare. </li><li> Sollevare il capillare a un&#39;altezza di sicurezza e quindi rimuovere la piastra da 6 pozzetti. </li></ol> 4. Cella Permeabilization protocollo <ol><li> Culture linea cellulare aderente a confluenza sul coperchio vetro scivola in una piastra da 6 pozzetti utilizzando tecniche di coltura standard. Per le cellule HeLa, sementi 6 pozzetti con 2 x 10 5 cellule per pozzetto e incubare per 48 ore prima del trattamento. </li><li> Preparare appropriato volume di soluzione contenente il vettore desiderato. Per hrGFPII-1, una concentrazione di 50 ng / ml in PBS 1x fornisce un forte segnale fluorescente in cellule HeLa 24 ore dopo la trasfezione. Per gli studi di destrano, si raccomanda di 80 mg / ml di 10 kDa destrano fluorescente verde. D&#39;ora in poi, questa soluzione si farà riferimento ad uns &quot;vettore soluzione&quot;. </li><li> Rimuovere cellule di coltura da bene e sciacquare tre volte con PBS 1x. </li><li> Pipettare 1.370 ml di soluzione di vettore preparati in fase 4.2 nel bene. Ciò dovrebbe tradursi in una profondità liquida di circa 1,3 mm. </li><li> Posizionare il pozzetto contenente il vettore soluzione nel centro della piattaforma. Abbassare l&#39;ugello getto di gas al livello precedentemente contrassegnato indica un&#39;altezza di ugello 3 mm sopra la diapositiva. </li><li> Impostare portata elio nel programma LabView e selezionare il modello di movimento desiderata da utilizzare. Seleziona &quot;Esegui&quot; quando è pronto per iniziare il protocollo di permeabilizzazione. Ci sarà un periodo di ritardo iniziale in cui il controllore di flusso di massa si appresta a fornire la portata necessaria. Una volta portata appropriata è stato raggiunto, il programma LabView attiverà i motori passo-passo per spostare il bene nel modello permeabilizzazione desideri. Una volta che la piattaforma è fermato, attendere circa 30 sec e rimuovere la soluzione vettoriale.Nota: permeabilizzazione ottimale si verifica vicino ad una pressione dinamica di 100 a 200 Pa all&#39;uscita dell&#39;ugello, a seconda del diametro del capillare. </li><li> Lavare ben tre volte con PBS 1x. </li><li> Riempire bene con terreni di coltura fresco. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,6 per il numero desiderato di esperimenti. Nota: Assicurati di includere campioni di controllo che consistono di pozzi essere riempiti con la soluzione di vettore senza il getto di gas che viene eseguito su di loro. Lasciare la soluzione nei pozzetti di controllo per circa 1 minuto poi procedere alle fasi 4.5 e 4.6. </li><li> Se si esegue un esperimento di transfezione hrGFP, ritorno 6 pozzetti di incubatore per 24 ore per permettere il materiale transfettati da trascrivere dalle cellule. Se si esegue un esperimento di permeabilizzazione destrano, ritorno 6 pozzetti di incubatore per 15 min. </li></ol> 5. Imaging cellulare <ol><li> Se lo si desidera, subito prima di imaging, di contrasto con adeguate macchia dal vivo / morto per valutare la morte cellulare. </li><li> Celle di immagine con appropriate microscopio per studiare l&#39;efficacia di trasfezione / permeabilizzazione. </li></ol>

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<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
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<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Getto di gas inerte permeabilizzazione è una tecnica utile per la trasfezione di cellule aderenti. Offre la possibilità di trasferire biomolecole nelle cellule con l&#39;uso di forze meccaniche, che elimina la necessità di prodotti chimici potenzialmente dannosi o vettori virali. La tecnica potrebbe potenzialmente offrire ai ricercatori e medici un modo efficiente e relativamente semplice per transfettare con precisione le cellule. La selettività del permeabilizzazione è unico anche consentendo ai ricercatori di trattar...

Con l&#39;evoluzione della biomedicina e la comprensione della meccanica delle cellule, la consegna di biomolecole nelle cellule è diventato di vitale importanza per molti settori di ricerca e le terapie mediche. Diverse tecniche sono state sviluppate per introdurre molecole estranee attraverso la membrana plasmatica e nel citoplasma cellulare. Questi possono essere generalmente classificati come: tecniche virale, chimici o meccanici. Tecniche virali possono trasfettare materiale genetico come RNA e DNA utilizzando vettori virali 1. Tecniche virali tendono ad avere alte efficienze in certe linee cellulari, tuttavia hanno il potenziale di reazioni immunitarie e infiammatorie 2. I metodi più comuni di transfezione chimici includono precipitazione con fosfato di calcio a 3, esotossine batteriche 4 e lipofezione 5. Queste tecniche hanno dimostrato di essere efficace, tuttavia, alcuni problemi sorgono come tossicità cellulare e non specificità. Inoltre, tecniche come phosphat calcioe precipitazione sono stati trovati per avere efficienze di trasfezione fino al 70%, ma solo in certe linee cellulari, raramente in cellule primarie 6. Questo è da notare come crescenti sforzi di ricerca sono stati messi in cellule primarie, soprattutto nel caso di progettazione di vari trattamenti per uso clinico e lo studio del funzionamento del DNA. Interruzione temporale della membrana cellulare attraverso stimoli meccanici è un&#39;alternativa per introdurre molecole estranee nelle cellule. Tecniche includono: microiniezione di molecole 7, elettroporazione usando un campo elettrico di distruggere la membrana 8,9, sonoporazione utilizzando onde ad ultrasuoni per distruggere la membrana cellulare 10-12, bombardamento di particelle come dimostrato dal &quot;gene gun&quot;, che spara particelle legate con geni nella cella 13, e, più recentemente, l&#39;applicazione di un fluido sforzo di taglio che ha dimostrato di permeabilize temporalmente cellule di mammifero 14,15. Sebbene meccanicometodi AL evitare alcuni dei problemi di cui sopra, sono in genere accompagnati da efficienze inferiori e configurazioni molto complesse e specializzate. Una torcia scarica a bagliore a pressione atmosferica (APGD-t) è stato sviluppato presso la McGill con l&#39;obiettivo iniziale di funzionalizzazione di superfici e staccando le cellule aderenti in vitro 16. Casualmente, si è scoperto che una macchia dal vivo / morto utilizzato era in qualche modo essere presa in dalle cellule senza essere aggiunto un agente permeabile. Inoltre, questo sembrava si sono verificati solo in aree ristrette dei pozzi che è accaduto a corrispondere con il percorso della torcia. Da studi sulle capacità di permeabilizzazione della APGD-t proseguito in studi di controllo, è stato trovato che il gas di trasporto inerte getto di plasma senza eccitazione era anche in grado di permeabilize cellule. Questo contraddice l&#39;ipotesi iniziale che le specie reattive create dal getto di plasma alterati temporaneamente la funzione della membrana e ha suggerito che semplicemente le meccanicheforze CAL erano sufficienti a causare permeabilizzazione cellulare. Da qui, gli studi continuarono nel nostro laboratorio per cercare di quantificare e caratterizzare l&#39;efficienza permeabilizzazione di un getto di gas inerte come pure un&#39;occhiata alle sue capacità di trasfezione 16. Attraverso questi studi, si è scoperto che micropori costituiscano effettivamente nella membrana plasmatica, e questi pori tendono a richiudere entro circa 5 sec 15. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità della tecnica in vitro e in vivo nella membrana corioallantoidea di embrione di pollo.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>Proteina fluorescente verde per esperimenti di trasfezione su cellule HeLa</td></tr><tr><td>Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, Anionic, Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>destrano per esperimenti di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>per la controcolorazione di cellule di mammifero</td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>per il montaggio di vetrini durante l'imaging</td></tr> di <tr><td>Helium ad altissima purezza</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ Terreni ad alto contenuto di glucosio - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>per cellule HeLa</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Per terreni DMEM</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, liquida</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Per terreni DMEM</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Prodotto in laboratorio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari</td></tr><tr><td>Micropiastre trattate con TC trasparenti a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI Dimensionamento delle informazioni</td></tr><tr><td>ID (mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Ordine #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass-Flo Controller</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Regolatore di flusso di massa, serie M100B, richiede un alimentatore esterno da 12 V</td></tr><tr><td>Dispositivo DAQ USB-6009</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gruppo UniSlide con motore passo-passo e controller</td><td>Velmex</td><td></td><td>Due gruppi UniSlide serie MA15, dotati di motori passo-passo Vexta 1.8&deg; forniti da Velmex e controllati da un controller per motori passo-passo VXM</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td>Tabella 2. Elenco delle attrezzature necessarie</td></tr></tbody></table>

permeabilizzazione delle cellule aderito utilizzo di un gas inerte jet

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Esistono varie tecniche di trasfezione cellulare e questi possono essere suddivisi a tre grandi categorie: virale, chimici e meccanici. Questo protocollo descrive un metodo meccanico per permeabilize temporalmente cellule aderenti mediante un getto di gas inerte che può facilitare il trasferimento di normalmente macromolecole non permeabili nelle cellule. Crediamo che questa tecnica funziona impartendo forze di taglio sulla membrana plasmatica di cellule aderenti, causando la formazione temporanea di micropori. Una volta che questi pori sono creati, le cellule sono poi permeabile al materiale genetico e altre biomolecole. Le forze meccaniche coinvolte non corrono il rischio di cellule permanentemente danneggiare o staccano dal loro substrato. Esiste, quindi, una ristretta gamma di dinamica dei gas inerti dove la tecnica è efficace. Un getto di gas inerte è dimostrata efficace in permeabilizzante varie linee cellulari aderenti, compresi HeLa, HEK293 e cellule endoteliali dell&#39;aorta addominale umani. Questo protocollo è appropriato per la permeabilization di cellule aderenti sia in vitro che, come abbiamo dimostrato, in vivo, mostrando esso può essere usato per la ricerca e potenzialmente in future applicazioni cliniche. Essa ha anche il vantaggio di permeabilizzante cellule in modo spazialmente restrittiva, che potrebbe rivelarsi un valido strumento di ricerca.

Permeabilizzazione delle cellule HeLa con 10 kDa destrano fluorescente verde utilizzando un getto di gas elio con un diametro interno di 0,86 millimetri capillare è mostrato in Figura 1. Le cellule sono state contrastate immediatamente dopo permeabilizzazione con 2 microlitri / ml EthD-soluzione 1 (LIVE / DEAD Viabilità / citotossicità Kit) per visualizzarne la morte cellulare. Subito dopo di contrasto, vetrini sono stati montati e ripreso. Questa figura mostra risultati dell&#39;esecuzione del getto di...

Questo protocollo descrive un metodo per la permeabilizzazione temporanea di cellule aderenti mediante un getto di gas inerte. Questa tecnica facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole in cellule di mammifero aderenti mediante l&#39;utilizzo delle forze meccaniche di distruggere la membrana plasmatica.

Permeabilizzazione delle cellule Aderito utilizzo di un gas inerte Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

L'obiettivo generale di questa procedura è permeabilizzare cellule aderenti. Questo viene ottenuto coltivando innanzitutto le cellule sperimentali su coprivetri in piastre a sei pozzetti. Il secondo passaggio consiste nel risciacquare le cellule con 1x PBS e ricoprirle con la soluzione contenente la biomolecola da trasferire all'interno della cellula.Successivamente, si fa passare un getto di gas inerte. Il campione attraversa le cellule. L'ultimo passaggio consiste nel fissare e colorare le cellule, se desiderato.Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare l'efficienza di permeazione e la vitalità cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la proliferazione o le biobalistica, è che essa è facilmente configurabile e consente una permeazione spazialmente limitata delle cellule aderenti. In un contesto di coltura, in generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché potrebbe essere necessario del tempo per ottimizzare determinati parametri, come la portata del gas o il diametro del capillare, al fine di ottenere una permeazione efficiente nelle specifiche applicazioni.Il regolatore di portata utilizzato in questa procedura richiede un'alimentazione esterna a 12 volt ed è collegato a una linea di gas elio per garantire una portata di gas precisa. L'interfacciamento tra il regolatore di portata e il computer avviene tramite un dispositivo di acquisizione dati. Quest'unità è controllata da una tensione in ingresso compresa tra zero e cinque volt. Un ciclo di controllo nel programma LabVIEW determina la tensione necessaria in qualsiasi momento.Due slide lineari di posizionamento vengono utilizzate per controllare il movimento della piastra a sei pozzetti, una per ogni direzione. Ogni assemblaggio è costituito da un'unità slide MA 15 serie Velm X uni abbinata a un motore passo-passo, e entrambi gli assemblaggi sono controllati da un unico controller per motori passo-passo VELM XVXM. Il controller permette lo spostamento manuale di ciascun motore oppure accetta una serie di comandi seriali esterni.La combinazione di questi elementi permette specifici schemi di movimento. Diversi schemi possono essere programmati nel programma LabVIEW, richiedendo all'utente di inserire soltanto la velocità desiderata della torcia e le dimensioni del percorso. Iniziare la preparazione dell'apparecchiatura aprendo sia la bombola di elio sia il regolatore, quindi accendere il controllore del motore.Aprire il programma di visualizzazione del laboratorio e verificare tutte le condizioni. Successivamente, assicurarsi che la piattaforma sia centrata per effettuare il controllo. Osservare ogni stadio del motore e verificare che ciascun carrello non sia vicino a nessuna delle due estremità dello stadio, quindi far centrare i carrelli tramite il programma.Se questa è la prima prova della giornata, si consiglia di eseguire il programma una volta senza cellule per assicurarsi che l'allestimento funzioni correttamente. Per regolare l'altezza della bocchetta capillare del gas Jett, rimuovere il capillare dal supporto e azzerare la scala dell'altezza. Posizionare la piastra a sei pozzetti sulla piattaforma.Sostituire la capillare del getto di gas e abbassarla fino al fondo del pozzetto, fino a quando tocca il coprioggetto. Fissare la capillare nel supporto utilizzando la manopola di regolazione dell'altezza. Alzare la capillare di tre millimetri e segnare questa altezza sulla base della capillare.Infine, sollevare il capillare a una quota sicura e quindi rimuovere la piastra a sei pozzetti. La linea cellulare aderente per questo protocollo deve essere coltivata fino a confluenza su coprioggetti di vetro in una piastra a sei pozzetti, utilizzando tecniche di coltura standard per cellule HELA. Seminare le piastre a sei pozzetti con due volte 10 alla quinta cellule per pozzetto e incubare per 48 ore prima del trattamento.Nel giorno del trattamento, preparare un volume appropriato di soluzione contenente il vettore desiderato. Per gli studi sulle destrine, si raccomanda di utilizzare 80 microgrammi per millilitro di destrina verde fluorescente di 10 chilodalton, come indicato in seguito. Questa soluzione sarà indicata come soluzione del vettore.Rimuovere il terreno di coltura cellulare da un pozzetto e risciacquare tre volte con 1,370 microlitri di soluzione tampone salino fosfato (XPBS). Aggiungere 1,370 microlitri di soluzione del vettore nel pozzetto. Ciò dovrebbe portare a una profondità del liquido di circa 1,3 millimetri. Posizionare il pozzetto contenente la soluzione del vettore al centro della piattaforma.Abbassare l'ugello del getto gassoso fino al livello precedentemente segnato, che indica un'altezza dell'ugello di tre millimetri sopra il vetrino. Impostare la portata dell'elio nel programma della vista del laboratorio e selezionare il modello di movimento desiderato da utilizzare. Selezionare esegui.Quando si è pronti per iniziare il protocollo di permeazione, vi sarà un periodo iniziale di latenza durante il quale il regolatore di portata massica si prepara a fornire la portata necessaria. Per il successo di questo protocollo, è importante ottimizzare le condizioni di flusso al fine di ridurre al minimo la profondità cellulare e il distacco delle cellule. Una volta raggiunta la portata appropriata, il programma LabVIEW attiverà i motori passo-passo per spostare la pozzetta secondo il modello di permeazione desiderato. Dopo che la piattaforma si sarà arrestata, rimuovere la piastra a sei pozzette dalla piattaforma.Attendere circa 30 secondi, quindi rimuovere la soluzione vettoriale. Lavare la pozzetta tre volte con PBS. Dopo il terzo lavaggio, riempire la pozzetta con mezzo di coltura fresco.Ripetere il protocollo di permeazione per il numero desiderato di esperimenti. Assicurarsi di includere campioni di controllo costituiti da pozzetti riempiti con la soluzione vettore, senza che il getto di gas venga fatto passare su di essi. Lasciare la soluzione nei pozzetti di controllo per circa un minuto prima di rimuoverla.Lavaggio delle cellule con PBS e riempimento del pozzetto con mezzo di coltura fresco. Reintrodurre la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore; nel caso della permeazione con destrina, incubare per 15 minuti. Successivamente, acquisire le immagini delle cellule mediante il microscopio appropriato per valutare l'efficacia della permeazione.Qui vengono mostrati i risultati della permeabilizzazione di cellule HELO con destrina verde fluorescente da 10 chilodalton utilizzando un getto di gas elio con un diametro interno di 0,86 millimetri. I pannelli capillari A, B e C mostrano i risultati ottenuti eseguendo il getto di gas elio a tre diverse pressioni di uscita, mentre il pannello D è un controllo a cui è stata aggiunta destrina, ma senza esposizione al getto di gas elio; le cellule sono state colorate successivamente per visualizzare la morte cellulare. In queste immagini, la destrina fluoresce di verde e le cellule morte fluorescono di rosso.Nei pannelli A e B si è osservato che la larghezza e l'efficienza della traccia di permeazione aumentavano con una pressione dinamica più elevata, con solo un lieve incremento della morte cellulare. Tuttavia, una volta raggiunta un'alta pressione dinamica, come osservato nel pannello C, le cellule HeLa venivano rimosse dai coverslip e si verificava una scarsa permeazione periferica, come evidenziato da studi di microscopia elettronica a scansione. Sono stati osservati micropori nella membrana cellulare.In questo esempio, la permeazione delle cellule HeLa &lt;data-jove-entity&gt;PLACEHOLDER_FOR_DATA_JOVE_ENTITY_0&lt;/data-jove-entity&gt; è stata eseguita utilizzando un getto di gas elio con un capillare dal diametro interno di 0,86 millimetri a una pressione in uscita di 300 pascal. Sono state acquisite immagini mediante microscopia elettronica a scansione con un ingrandimento di 50.000 ×. Il pannello A mostra un campione di controllo con superficie cellulare liscia, mentre il pannello B mostra la superficie di una cellula permeata con un poro dal diametro di 84 nanometri. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede da 15 a 30 minuti se eseguita correttamente. Al termine della procedura, possono essere eseguite colorazioni per valutare ulteriori parametri come la vitalità cellulare.

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