L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli epatociti umani utilizzando una procedura di perfusione della collagenasi in due fasi. Ciò si ottiene incannulando prima i vasi sanguigni in un pezzo di fegato con una cannula di irrigazione. Segue la perfusione e la digestione del pezzo di fegato utilizzando la collagenasi.

Il terzo passo è la rimozione della capsula luccica, che rilascia le cellule epatiche dissociate. Il passaggio finale è una centrifugazione a bassa velocità che isola gli epatociti. Infine, gli epatociti possono essere identificati con la microscopia a contrasto di fase o mediante colorazione con albumina utilizzando l'immunocitochimica con la vitalità e la resa degli epatociti determinate utilizzando un saggio di esclusione del blu triam.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di incannulamento e digestione sono difficili da imparare. Questo perché l'incannulamento richiede una certa finezza e il completamento della digestione può essere difficile da identificare. Per le persone che non conoscono la tecnica, a dimostrare la procedura sarà Natalie Lun, un tecnico del mio laboratorio.

In questa dimostrazione, utilizzeremo un pezzo di fegato di lampada al posto di un pezzo di un essere umano, Avere l'attrezzatura per la perfusione del pezzo di fegato impostata come segue, impostare il bagno d'acqua a una temperatura appropriata in modo tale che le soluzioni siano di 37 gradi Celsius quando raggiungono il fegato. Pezzo. 41 gradi Celsius è buono per le soluzioni uno, due e tre, e per la soluzione quattro del condensatore di vetro incamiciato, tuttavia, dovrebbe essere a 37 gradi Celsius per ridurre la perdita di attività della collagenasi. Poco prima della profusione accendere il regolatore del gas Per l'apparato di ossigenazione da un patologo, ottenere un pezzo di fegato che idealmente abbia una capsula luccicante per lo più o completamente intatta e un solo punto di superficie tagliata.

Questo pezzo di fegato sull'imbuto di Buchner che contiene un disco filtrante perforato, il sistema di perfusione deve ora essere innescato con la soluzione uno utilizzando una cannula di irrigazione curva a bassa portata con punte di oliva nei vasi sanguigni più grandi sulla superficie tagliata del pezzo di fegato. Man mano che il sangue fuoriesce dal fegato, il tessuto diventa più leggero nelle aree con una buona perfusione. Il numero di cannule utilizzate varia per fegati di dimensioni diverse.

In generale, da quattro a otto cannule dovrebbero essere utilizzate per fegati che vanno da meno di 20 grammi a oltre 80 grammi. Seleziona il calibro della cannula per avere una vestibilità aderente e sicura. Lasciare aperti i vasi sanguigni più piccoli per far defluire il tampone dal tessuto.

Ora, aumentare la portata della pompa peristaltica da 110 a 460 millilitri al minuto. È una buona perfusione se il pezzo di fegato è di un colore più chiaro per tutta la velocità di flusso utilizzata. Dipende dalle dimensioni del fegato con tassi di perfusione più elevati utilizzati per fegati più grandi.

In generale, una velocità media di perfusione di 44 millilitri al minuto per cannula è ideale in una gamma di pesi epatici diversi. La portata scelta dovrebbe comportare un leggero rimpolpamento del pezzo di fegato. Mantieni umido il pezzo di fegato durante la perfusione coprendolo con un pezzo di garza imbevuto di soluzione salina.

Dopo aver perfuso il tessuto con un litro di soluzione, uno per eliminare il sangue rimasto nel pezzo di fegato. Cambiare il liquido di perfusione in soluzione due e perfondere per 10 minuti. Quindi, passare il fluido di perfusione alla soluzione tre e perfondere con mezzo litro.

Ora cambia il liquido di perfusione con la soluzione quattro, che contiene collagenasi. Effettuare questa perfusione in modo ricircolante per 9-12 minuti o fino a quando il fegato non è sufficientemente digerito. Il tessuto epatico dovrebbe sembrare rompersi leggermente sotto la capsula luccicante.

Il fegato dovrebbe anche sentirsi ammorbidito quando viene sondato con il lato smussato di un bisturi. È importante digerire il pezzo di fegato per il giusto periodo di tempo, poiché una digestione eccessiva può portare a una bassa vitalità degli epatociti e una digestione insufficiente può portare a una bassa resa di epatociti. Inizia spegnendo la pompa peristaltica e rimuovendo la cannula dal pezzo di fegato.

Quindi porre il tessuto in una capsula di cristallizzazione contenente da 100 a 200 millilitri di soluzione. Cinque. Rimuovere con cura la capsula luccicante e scuotere delicatamente le cellule. Se ci sono regioni che non sono ben perfuse, un bisturi può essere utilizzato per tagliare queste regioni per rilasciare le cellule contenute all'interno.

Aggiungere più soluzione cinque se necessario durante il processo e infine portare il volume della soluzione cinque a 500 millilitri. Ora filtra due volte la sospensione cellulare. Per prima cosa, filtra le cellule attraverso una rete di nylon da 210 micron in un pallone conico da un litro.

Quindi filtrare le cellule attraverso una rete di nylon da 70 micron in un pallone conico da un litro. Versare due volumi uguali della sospensione cellulare in provette da centrifuga da 200 millilitri. Quindi centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 72 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare la bocchetta e risospendere delicatamente il pellet cellulare in circa 200 millilitri di soluzione. Cinque. Ripetere la centrifugazione e la sospensione di resus tre volte dopo la centrifugazione finale, risospendere le cellule in una soluzione di conservazione a freddo per una concentrazione finale da due a 5 milioni di epatociti per millilitro. Un test triam blue può essere utilizzato per misurare con precisione la conta cellulare utilizzando un emocitometro.

Qui sono mostrati epatociti trian colorati in blu da 648 isolamenti. La vitalità media degli epatociti umani isolati era di 77 più o meno il 10%La resa media degli epatociti era di 13 più o meno 11 milioni di epatociti per grammo di fegato per mezzo dell'immunofluorescenza. Gli epatociti isolati che si sono colorati positivamente per l'albumina in verde avevano una purezza di 94 più o meno l'1% per determinare la purezza degli epatociti.

La colorazione con immunofluorescenza è stata condotta quattro volte con cinque repliche per studio. La microscopia a contrasto di fase mostra le caratteristiche morfologiche degli epatociti, come le grandi dimensioni delle cellule e la forma poligonale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare gli epatociti umani utilizzando una procedura di perfusione della collagenasi in due fasi.