Name: Lisolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Impara l'isolamento di epatociti umani tramite perfusione a due passaggi con collagenasi. Questo metodo garantisce alta vitalità e resa cellulare per studi di rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

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Questo lavoro è stato reso possibile dal tessuto e Cell Research Foundation umano, che rende i tessuti umani disponibili per la ricerca. Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato ricevuto dal Ministero Federale dell&#39;Educazione e della Ricerca (nome di sovvenzione: Virtual Network Fegato, numero di concessione: 0.315.759) e Hepacult GmbH. I nostri ringraziamenti vanno anche agli assistenti tecnici della Banca dei tessuti Grosshadern Hospital per la raccolta dei campioni di fegato e gli assistenti tecnici del isolamento delle cellule Nucleo Fondo per l&#39;esecuzione della perfusione epatica e l&#39;isolamento degli epatociti. In particolare, vorremmo ringraziare Natalja Löwen per dimostrare questa procedura nel video. Infine, vorremmo ringraziare Natalja Löwen e Edeltraud Hanesch per creare le illustrazioni per la figura 1 e le figure nella panoramica schematica del video.

1. Preparazione di perfusione e di isolamento Solutions <ol><li> Preparare le soluzioni richieste per la perfusione del fegato pezzo e l&#39;isolamento di epatociti secondo la Tabella 1. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Filtro sterile tutte le soluzioni utilizzando un filtro di 0,22 micron. </li><li> Tutte le soluzioni che vengono a contatto con il fegato devono essere sterili. </li></ol> 2. Preparazione di perfusione apparecchiature e soluzioni <ol><li> L&#39;apparecchiatura per la perfusione del fegato pezzo deve essere montata come mostrato nella Figura 1. </li><li> Il bagno d&#39;acqua dovrebbe essere impostato ad una temperatura appropriata, che è differente in ogni particolare set-up sperimentale, tale che le soluzioni sono alla temperatura di 37 ° C quando raggiungono il pezzo fegato. In questo caso, il bagno di acqua è impostata a 41 ° C per riscaldare le soluzioni 1, 2 e 3 e il condensatore in vetro con camicia. Soluzione 4 deve essere riscaldato fino a37 ° C in un bagno d&#39;acqua separato da utilizzare per ridurre la perdita di attività collagenasi. </li><li> Poco prima di perfusione epatica, accendere il regolatore del serbatoio di gas contenente il 95% O 2/5% di CO 2 a gas l&#39;apparato di ossigenazione (Figura 1E). </li></ol> 3. Perfusione del fegato <ol><li> Un pezzo di fegato con tanto capsula integra di Glisson possibile e idealmente con superficie di 1 solo taglio deve essere ottenuto da un patologo per la perfusione. </li><li> Posizionare questo pezzo fegato sulla imbuto Büchner contenente un filtro a disco forato (Figura 1B). </li><li> Il sistema di perfusione deve essere innescato con Soluzione 1. </li><li> Con una portata bassa, curvo cannule irrigazione con punte oliva deve essere inserito nei vasi sanguigni più grandi sulla superficie di taglio del pezzo fegato. Mentre il sangue vampate dal fegato, il tessuto diventa più chiaro in zone con buona perfusione. Il numero di cannule utilizzati per vari formatidi fegati è mostrato in Figura 2A. La dimensione relativa scelta dovrebbe tradursi in una perfetta aderenza che si terrà il cannule in posizione. I vasi sanguigni più piccoli devono essere lasciati aperti per il buffer di perfusione a fuoriuscire del pezzo fegato. </li><li> Aumentare la portata della pompa peristaltica a tra 110-460 ml / min a seconda delle dimensioni del fegato (Figura 2B). Ciò si traduce in una portata media di 44 ± 16 ml / min per cannula (Figura 2C). La velocità scelta dipende dal pezzo fegato e dovrebbe comportare una lieve plumping up del pezzo fegato. In alcuni casi, può essere necessario bloccare chiuse alcune delle navi aperte con pinze vascolari Micro per ottenere la leggera volumizzante cui sopra. Una buona perfusione può essere osservata quando il pezzo fegato è un colore più chiaro in tutto. </li><li> Tenere il pezzo di fegato umido durante la perfusione coprendolo con un pezzo di garza imbevuta di soluzione fisiologica. </li><li> Profumato con 1 L di soluzione di 1 a stanare ogni remaining sangue nel pezzo fegato. </li><li> Cambiare il liquido di perfusione alla Soluzione 2 e profumato per 10 min. </li><li> Passare il liquido di perfusione alla Soluzione 3 e profumato con 0,5 L. </li><li> Sostituzione del liquido di perfusione alla Soluzione 4, che contiene 0,1-0,15% di collagenasi (Tabella 2). </li><li> Per questo passaggio, perfusione deve essere effettuata in maniera ricircolo per 9-12 minuti o fino a che il fegato è sufficientemente digerito; tessuto epatico dovrebbe apparire a spezzarsi leggermente sotto la capsula di Glisson grafico ammorbidito quando provata con il lato smussato di un bisturi. </li></ol> 4. Isolamento degli epatociti <ol><li> Spegnere la pompa peristaltica e rimuovere cannule dal pezzo di fegato. </li><li> Posizionare il pezzo di fegato in un piatto di cristallizzazione contenente 100-200 ml di soluzione 5. </li><li> Rimuovere la capsula di Glisson con attenzione e scuotere delicatamente le cellule. Se ci sono regioni che non sono ben perfusi, un bisturi può essere usato per tagliarequeste regioni per liberare le cellule contenute all&#39;interno. Aggiungere più Soluzione 5 come necessario durante il processo. </li><li> Aggiungere più Soluzione 5 fino a raggiungere un volume finale di 500 ml. </li><li> Filtro sospensione cellulare due volte prima attraverso una maglia di 210 micron nylon seguita da una rete di nylon 70 micron. Successivamente, versare la sospensione di cellule in 200 ml provette da centrifuga. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 72 g per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e pellet cellulare delicatamente risospendere delicatamente in 200 ml di soluzione 5. </li><li> Ripetere il numero fase di lavaggio 4.6 tre volte. Nella fase centrifuga finale, risospendere le cellule in soluzione di storage a freddo (vedi elenco dei materiali). Le cellule dovrebbero essere di circa 2,5 milioni di epatociti per millilitro per la valutazione del rendimento e della redditività con un saggio di esclusione trypan blu a base di emocitometro. </li><li> Per eseguire un saggio trypan blue exclusion, aggiungere 0,1 ml di cellule opportunamente diluiti (≈ 2,5 milioni / ml) in una provetta da microcentrifuga contenente 0,5 ml di soluzione molto trypan blu(0.4% blu tripano sciolto in tampone fosfato salino (PBS)) e 0,4 ml di PBS. Dopo aver miscelato accuratamente la sospensione cellulare, caricare un emocitometro con la sospensione ed esaminare al microscopio ad ingrandimento 100X. Sotto microscopio, le cellule morte saranno colorate blu, mentre le cellule vive appaiono senza macchia. Contare il numero di cellule vive e totale indicato in ciascuna 1 mm 2 griglie marcati sul emocitometro. Redditività (%), resa di cellule vive (milioni di epatociti per soluzione di conservazione a freddo ml (CSS) o milioni di epatociti per g di fegato) può essere calcolato utilizzando le formule seguenti. </li></ol><img alt="Equazione 1" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> Nota: In questo caso, il fattore di diluizione trypan blu è 10 e il fattore emocitometro è 10.000.

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</ol>

Ottimizzazione di questo protocollo è stato parzialmente finanziato da una sovvenzione Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler è uno dei fondatori di Hepacult GmbH e rimane uno dei membri del consiglio di amministrazione di questa società. L&#39;impiego di Maresa Demmel è parzialmente da Hepacult. Maria Hauner è impiegato da Hepacult GmbH. Hepacult è uno spin-off ditta biotecnologica presso l&#39;Università, che offre epatociti umani con il consenso e aprire l&#39;accesso a fini di ricerca.

Questo protocollo comporta l&#39;isolamento di epatociti umani con alta vitalità e purezza. Per conseguire questi risultati, è importante iniziare con un pezzo adatto di fegato. Il pezzo di fegato dovrebbe avere capsula integra di Glisson su tutte le superfici tranne per 1 superficie di taglio. Un altro fattore importante è la particolare lotto di collagenasi utilizzato, come gruppi differenti possono provocare notevoli differenze Viabilità di epatociti dopo digestione 11. Pertanto, diversi lotti di collagena...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Una sospensione di cellule di fegato può essere preparato dal fegato con metodi meccanici o enzimatici. Metodi meccanici utilizzati per preparare le cellule del fegato includono intere costringendo il fegato attraverso una garza 2, agitando un pezzo di fegato con perle di vetro in uno shaker Kahn 3, utilizzando omogeneizzatori vetro con pestelli sciolti 4,5 ecc Nel corso degli anni, metodi meccanici sono caduti fuori favorire causa dei danni alle membrane cellulari e la perdita della funzione degli epatociti isolati 6,7. Di conseguenza, l&#39;uso di un metodo enzimatico è attualmente il metodo principale per l&#39;isolamento di epatociti. Isolamento di epatociti utilizzando un metodo enzimatico è stata notevolmente migliorata quando Berry e Friend 8 perfusi collagenasi e ialuronidasi attraverso il fegato attraverso la vena porta nei ratti. Questo processo perfusione utilizzato il sistema vascolare per consentire gli enzimi di entrare in stretto contatto con la maggior parte delle cellule, portando adun aumento di 6 volte della resa degli epatociti 8. Inoltre, questo metodo ha prodotto cellule che mantenevano la loro integrità strutturale, praticamente senza trasformazione del reticolo endoplasmatico in vescicole isolate e nessun danno mitocondriale 8. Questo metodo è stato modificato da Seglen 1, che ha aperto una procedura di perfusione in due fasi per l&#39;isolamento delle cellule epatiche. In questa procedura, il fegato di ratto è perfuso con un Ca 2 + tampone privo seguita da perfusione con collagenasi un tampone contenente Ca 2 + 1. La rimozione di Ca 2 + nel primo passaggio consente di interrompere desmosomi, mentre è necessaria l&#39;aggiunta di Ca 2 + nel secondo passo per un&#39;attività ottimale collagenasi 1,9. Dato che il lavoro pubblicato sopra descritto è stato eseguito su ratti, questo articolo si propone di dimostrare una procedura modificata che può essere utilizzato per l&#39;isolamento di epatociti con alta vitalità da Humun fegati. L&#39;uso di epatociti umani rimane importante per la ricerca traslazionale e per validare gli esperimenti su modelli animali. I pezzi di fegato umano utilizzati in questo studio sono stati acquisiti con il consenso della governance attraverso il tessuto umano e Cell Research Foundation, una controllata dallo Stato fondazione non-profit 10. Dopo un patologo rimosso a quanto necessario per la diagnosi, pezzi di fegato sono stati raccolti dal tessuto rimanente. Il tessuto sezionato fuori dal patologo era morfologicamente il tessuto sano ottenuto da margini di resezione dopo resezione epatica.

<table><tbody><tr><td>Trappola a bolle</td><td>Ga&szlig; ner Glastechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Condensatore con rivestimento in vetro</td><td>Ga&szlig; ner Glastechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>41 gradi C Bagnomaria</td><td>Julabo</td><td>35723-H24/EG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 gradi C Bagnomaria</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bombola di gas compresso (95 % O2/5 % CO2)</td><td>Linde</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tubo permeabile ai gas</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piuma di bisturi</td><td></td><td>320010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Omnilab</td><td>5171014</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiaschi conici 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiasche coniche 5 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bicchieri</td><td>Schott Duran</td><td>2110654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 200 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352075</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piatto di cristallizzazione</td><td>Omnilab</td><td>5144063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cannule di irrigazione curve con punte sferiche</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Morsetti microvascolari</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; Imbuto chner</td><td>Carl Roth</td><td>HT38.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Maglia di nylon 210 &mu; m</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Maglia di nylon 70 &mu; m</td><td>Neolab</td><td>4-1419</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtri sterili</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bottiglie da 500 ml</td><td>Schott Duran</td><td>2180144</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bottiglie da 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2180154</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubi da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubi conici da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Neolab</td><td>1508454</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette sterili Pasteur</td><td>Marca</td><td>747715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Riempitrice per pipette motorizzata (Pipette boy acu)</td><td>Integra</td><td>155017</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cassaforte a flusso laminare</td><td>Kendro</td><td>Hera-KS9</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aspiratore (Aspiratore chirurgico a bassa portata)</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bruciatore a Gas da Laboratorio</td><td>Integra</td><td>Fire Boy eco</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Camice da laboratorio monouso</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mascherina chirurgica con visiera</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cappuccio chirurgico</td><td>Barrier</td><td>42072</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Guanti in lattice</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenasi (Numero di lotto NB 4G)</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Merck</td><td>2382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth</td><td>9105.3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Serva</td><td>26868</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Biomol</td><td>01400-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Serva</td><td>22700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio</td><td>Serva</td><td>30180</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,4% soluzione di blu di tripano</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di conservazione a freddo</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento di epatociti umani da un two-step collagenase perfusione procedura

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Il fegato, un organo con una capacità di rigenerazione eccezionale, svolge un&#39;ampia gamma di funzioni, quali la disintossicazione, il metabolismo e l&#39;omeostasi. Come tale, gli epatociti sono un modello importante per una grande varietà di domande di ricerca. In particolare, l&#39;uso di epatociti umani è particolarmente importante nel campo della farmacocinetica, tossicologia, rigenerazione epatica e ricerca traslazionale. Così, questo metodo presenta una versione modificata di una procedura in due fasi perfusione con collagenasi per isolare epatociti come descritto da Seglen 1. In precedenza, gli epatociti sono stati isolati con metodi meccanici. Tuttavia, i metodi enzimatici hanno dimostrato di essere superiore come epatociti mantengono la loro integrità e la funzione strutturale dopo l&#39;isolamento. Questo metodo qui presentato si adatta il metodo precedentemente progettata per fegati di ratto a pezzi di fegato umano ed i risultati in un grande rendimento di epatociti con agibilità di 77 ± 10%. Il principaledifferenza di questa procedura è il processo di cannulization dei vasi sanguigni. Inoltre, il metodo qui descritto può essere applicato anche ad fegati da altre specie con malattie epatiche o vaso sanguigno dimensioni comparabili.

Setup perfusione Il materiale necessario per la perfusione epatica deve essere impostato secondo la figura 1. La vitalità e rendimento di isolati epatociti umani La redditività media di isolati epatociti umani è stata del 77 ± 10% e il rendimento medio degli epatociti era di 13 ± 11 milioni di epatociti / g di fegato, con i valori espressi come media ± deviazione standard. Il numero di isolamenti epatociti svolto per ottene...

A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l&#39;isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare epatociti umani mediante una perfusione in due fasi con collagenasi. Questo viene ottenuto cannulando innanzitutto i vasi sanguigni in un frammento di fegato con una cannula per irrigazione. Successivamente si procede alla perfusione e alla digestione del frammento di fegato utilizzando collagenasi.Il terzo passaggio consiste nella rimozione della capsula glistens, che rilascia le cellule epatiche dissociate. L'ultimo passaggio è una centrifugazione a bassa velocità che isola gli epatociti. Alla fine, gli epatociti possono essere identificati mediante microscopia a contrasto di fase o mediante colorazione dell'albumina usando immuno citochimica, mentre la vitalità e il rendimento degli epatociti vengono determinati mediante saggio di esclusione del triam blu.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di cannullazione e digestione sono difficili da apprendere. Questo perché la cannullazione richiede una certa abilità manuale e il completamento della digestione può essere difficile da identificare. Per chi è alle prime armi con la tecnica, la procedura sarà dimostrata da Natalie Lun, una tecnica del mio la

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Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere alta attuabilità e ad alto rendimento di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali dal fegato. Ciò avviene mediante che irrora il fegato con una soluzione di collagenasi tipo IV tramite la vena portale, seguita da centrifugazione differenziale per ottenere gli epatociti e le cellule endoteliali sinusoidali.

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

Questo è un protocollo per isolare le vesciche extracellulari del tessuto (EV) dal fegato. Il protocollo descrive un processo in due fasi che coinvolge la perfusione di collagenasi seguito da ultracentrifugazione differenziale per isolare gli EV del tessuto epatico.

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Presentato qui è un protocollo per l'isolamento degli epatociti del topo dai fegati di topo adulti utilizzando una tecnica di perfusione di collagenasi modificata. È stata inoltre descritta la cultura a lungo termine degli epatociti in un sandwich di collagene 3D, nonché l'immunolabeling dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta al trattamento.

Isolamento e 3D Collagen Sandwich Cultura del topo primario Epatociti per studiare il ruolo del citoscheletro nella formazione canalicolare bile in vitro

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.

Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Impara l'isolamento di epatociti umani tramite perfusione a due passaggi con collagenasi. Questo metodo garantisce alta vitalità e resa cellulare per studi di rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

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