Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare un'ipossia intermittente su scala minuti a isolotti pancreatici su scala micrometrica per studiarne gli effetti di precondizionamento. Questo obiettivo viene raggiunto innanzitutto realizzando un dispositivo microfluidico multimodale dotato di una sottile membrana permeabile ai gas. Il secondo passaggio consiste nella creazione di un sistema computerizzato di modulazione dell'ossigeno.

I successivi eyelet vengono caricati con attenzione nel dispositivo, quindi vengono collegati i microfluidici per il liquido e per l'ossigeno. L'ultimo passaggio consiste nel coordinare la microscopia con i microfluidici multimodali al fine di visualizzare i parametri degli eyelet che cambiano durante la modulazione dell'ossigeno. Infine, la tecnica degli eyelet con ipossia intermittente viene utilizzata per dimostrare che la risposta al glucosio è chiaramente compromessa in condizioni di ipossia.

Mentre le modulazioni temporali dell'ipossia possono allenare gli occhi a rispondere con un minore deterioramento. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'ossigeno disciolto o l'utilizzo di una camera ipossica, è che la concentrazione di ossigeno può essere erogata alle palpebre in intervalli di tempo rapidi e minuti, senza sollecitazioni meccaniche derivanti da flussi complessi.

Consente inoltre il monitoraggio in tempo reale mediante microscopia a pavimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del trapianto Alli, come definire i deficit ipossici nei siti di trapianto o le terapie di condizionamento pre-trapianto per migliorare i risultati del trapianto. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sull'ipossia Alli.

Si può applicare anche ad altri tessuti e sistemi, come il sistema nervoso centrale, i tessuti cardiaci, il rene e altri organi destinati al trapianto. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, poiché molti passaggi riguardano la fabbricazione del dispositivo e la manipolazione dell'occhiello. I passaggi sono difficili da apprendere a causa della natura interdisciplinare innovativa della tecnica, ma intrinsecamente sfidante o da familiarizzare; iniziare fabbricando lo strato superiore del dispositivo microfluidico.

Per raggiungere questo obiettivo, versare le DGAs di PDMS pre-miscelato in un piatto di Petri vuoto fino a un'altezza di 1,5 millimetri e polimerizzare a 80 gradi Celsius per due ore. Successivamente, realizzare lo strato microfluidico per il glucosio con la matrice della camera di profusione mediante rivestimento a centrifuga di due strati spessi 350 micron di SU 8 21 50, formando un singolo strato di 700 micron su una piastrina di silicio da quattro pollici. Quindi esporre alla luce UV utilizzando la maschera fotolitografica dello strato microfluidico per il glucosio, in modo da trasferire il disegno dei microcanali sullo strato di SU 8.

Sciacquare l'area non esposta con il rivelo SU eight. Successivamente, versare il PDMS pre-miscelato DGA sull'MA fino a un'altezza di tre millimetri e polimerizzare a 80 gradi Celsius per due ore. Una volta polimerizzato, ritagliare lo strato microfluidico per il glucosio nella forma desiderata e utilizzare un punzonatore da due millimetri per creare i fori di ingresso e uscita, nonché un punzonatore con diametro di otto millimetri per la camera principale.

Successivamente, realizzare il master del micropozzetto per l'immobilizzazione della palpebra rivestendo mediante centrifugazione uno strato spesso 100 micron di SU 8 2100 su una wafer di silicio pulita da quattro pollici, quindi utilizzare la litografia a raggi UV per trasferire il disegno del micropozzetto su questo strato. Rimuovere con il rivelatore le aree non esposte una volta completato il master del micropozzetto. Aggiungere due strati di PDMS spessi 100 micron mediante rivestimento rotante a 900 giri/min per 30 secondi, quindi polimerizzare per 10 minuti a 80 gradi Celsius per produrre ciascuno strato.

Una volta terminato, perforare i fori di ingresso e di uscita con un diametro di due millimetri. Infine, realizzare il master microfluidico per i gas facendo ruotare l'SU 8 2100 fino a uno spessore di 100 micron, come nel precedente strato, e trasferire nuovamente i pattern microfluidici per i gas mediante litografia UV. Rimuovere con il developer le aree non esposte.

Successivamente, versare uno strato di PDMS spesso 1,5 millimetri sullo stampo master per microfluidica gassosa e polimerizzare a 80 gradi Celsius per due ore. Quindi, ritagliare il PDMS nella forma desiderata utilizzando una lametta. Successivamente, praticare fori di ingresso e uscita del diametro di due millimetri nel livello di copertura, allineandoli con quelli presenti negli altri strati, al fine di unire insieme i diversi livelli.

Per prima cosa, prepararli pulendo le superfici con nastro adesivo, esponendole a un arco a corona e quindi allineando manualmente gli strati nel seguente ordine. Innanzitutto, incollare la membrana allo strato gassoso inferiore con i micro pozzetti rivolti verso l'alto. Successivamente, incollare lo strato microfluidico per il glucosio sopra la membrana dei micro pozzetti.

Infine, incollare lo strato di ingresso e uscita sulla parte superiore, incapsulando l'intero assemblaggio. Favorire la formazione di un collegamento stretto aggiungendo un peso di un chilogrammo sulla sommità dell'assemblaggio e cuocendolo a 100 gradi Celsius per tre ore. Successivamente, verificare la perdita.

Verificare il dispositivo caricando acqua nello strato acquoso, immergendo il dispositivo e facendo passare aria attraverso lo strato gassoso con la siringa, controllando la presenza di perdite. Infine, sterilizzare i dispositivi privi di perdite facendo passare etanolo al 70% attraverso lo strato acquoso per uno o due minuti. Configurare i microerogatori collegando innanzitutto i cavi di controllo dei microerogatori alle unità di comando incluse.

Quindi collegare i driver alla scheda digitale IO in corrispondenza delle porte corrispondenti ai relativi controlli LabVIEW. Successivamente, collegare le alimentazioni in corrente continua da cinque volt e da 20 volt ai contatti corrispondenti sulle unità di comando e connettere la scheda digitale IO a un laptop per eseguire i codici LabVIEW per il controllo dei gas, come descritto nell'appendice del protocollo testuale allegato. Quindi collegare un microdispensatore all'azoto e l'altro all'aria compressa, entrambi contenenti il 5% di anidride carbonica, e regolare entrambi i gas a 2 PS.I collego le uscite dei dispensatori a un giunto a T prima che entrino nel dispositivo microfluidico.

Successivamente, montare il dispositivo sullo stadio riscaldato di un microscopio invertito con ossigeno al 0% e al 21% collegato al dispositivo. Posizionare quindi un sensore di ossigeno a fibra ottica all'uscita del fluido del dispositivo per misurare in tempo reale l'ossigeno disciolto nell'effluente. Collegare poi il dispositivo a una pompa peristaltica e avviare il flusso d'acqua attraverso il dispositivo a 250 microlitri al minuto.

Caratterizzare la risposta transitoria della modulazione dell'ossigeno facendo alternare i microerogatori tra il 5% e il 21% di ossigeno. Collegare una pompa peristaltica al dispositivo microfluidico e posizionare i tubi sopra una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius per riscaldare il liquido prima che entri nel dispositivo microfluidico. Inoltre, collegare il porto di uscita dei microfluidici del glucosio a un raccoglitore frazionato per iniziare a dissezionare i topi C57 Black Six e isolare gli isolotti pancreatici mediante digestione con collaghenasi e separazione su gradiente di densità Ficoll, come descritto nei seguenti video disponibili da JoVE, una volta isolati.

Incubare le porzioni oculari in mezzo RPMI 1640 contenente 10% di FBS, 1% di penicillina-streptomicina e 20 millimolare di HEPES in piastre di Petri per 24-48 ore. Utilizzare le porzioni oculari entro due giorni per garantire risultati costanti. Successivamente, preparare un tampone fresco di Ringer bicarbonato di Krebs come descritto nel protocollo testuale allegato, con una soluzione contenente due millimolare di glucosio e un'altra contenente 14 millimolare di glucosio.

Riscaldare le soluzioni in provette coniche da 50 millilitri ponendole in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Preparare quindi la soluzione colorante per gli anellini isolati aggiungendo cinque micromoli di 4:02 AM e DMSO e 2,5 micromoli di RH 1 23 e etanolo al 100% a due millilitri di tampone di Krebs contenente due millimoli di glucosio. Successivamente, raccogliere gli anellini con una pipetta da 10 microlitri e incubarli nella soluzione colorante per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo la colorazione, caricare circa 20 campioni nell'apparecchio attraverso l'ingresso del microcanale per il glucosio. Indirizzare i campioni nella camera spingendo il buffer dall'uscita verso l'ingresso. Quindi perfondere i campioni e il buffer per 10 minuti al fine di rimuovere i coloranti in eccesso.

Per prima cosa, far passare nel sistema per cinque minuti una soluzione tampone bicarbonato di Krebs ringer a due millimolari per stabilire una baseline normale del battito. Successivamente, stimolare la camera con la soluzione tampone a 14 millimolari di glucosio per 15 minuti, seguita da un lavaggio di 15 minuti con la soluzione tampone a due millimolari di glucosio. Durante questo processo, registrare l'emissione a 510 nanometri eccitando a 340 nanometri e 380 nanometri.

Inoltre, registrare l'emissione a 530 di RH 1 23 eccitando il colorante a 480 nanometri. Per ridurre al minimo le perturbazioni convettive durante la modulazione dell'ossigeno, applicare il flusso del buffer durante i passaggi di stimolazione e di lavaggio, assicurandosi di interrompere il flusso negli altri passaggi durante il test. Raccogliere l'effluente dall'uscita del glucosio a intervalli di un minuto per l'uso in ulteriori analisi. Con l'approccio microfluidico mostrato in questo video, è possibile regolare rapidamente la percentuale di ossigeno che scorre al di là della sottile membrana in PDMS mediante gli iniettori microcomputerizzati.

Ecco un esempio di questa modulazione che varia da un minuto a sei minuti. È inoltre possibile ottenere modulazioni quantitative inferiori al minuto, con livelli di ossigeno compresi tra 2 e 8,5 parti per milione, fornendo ossigeno in una percentuale compresa tra il 5% e il 21%. La linea blu mostra la percentuale di ossigeno erogato, mentre la linea verde rappresenta l'ossigeno disciolto risultante espresso in parti per milione. Quando questo ciclo viene applicato per creare ipossia intermittente nelle camere di percolazione, è possibile osservare i benefici del precondizionamento di queste ultime contro l'ipossia, confrontandole con impulsi normossici irregolari, valutando il miglioramento del rapporto F dopo il trattamento. Gli effetti dell'ipossia e dell'ipossia intermittente possono essere osservati nell'overshoot e nell'attenuazione delle oscillazioni dei transitori di calcio; come mostrato qui, la risposta normossica è in blu.

In rosso è riportata la risposta ipossica, e in verde la risposta ipossica condizionata. Qui vengono mostrate le misurazioni di calcio, potenziale mitocondriale e insulina. Sono i risultati ottenuti mediante microscopia fluorescente in tempo reale e saggio EISA fuori chip, utilizzando l'effluente microfluidico proveniente dal sistema. Nel complesso, questi dati iniziano a delineare una visione multimodale della risposta glucosio-insulina in condizioni di ipossia transitoria.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due giorni se eseguita correttamente: un giorno per la fabbricazione del dispositivo e l'isolamento delle cellule della palpebra e un giorno per gli esperimenti sulla palpebra stessa. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di verificare la concentrazione di ossigeno erogata accoppiando il gas all'interno del dispositivo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nell'ambito dell'outlet fetale e di altre microfisiologie tissutali per esplorare in che modo l'ipossia e i modelli temporanei di ossigeno possano influenzare malattie come il diabete, le patologie cardiovascolari e i disturbi neurologici.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come controllare la modulazione dell'ossigeno, manipolare micro tessuti e generare misurazioni ripetibili e significative dell'ipossia tissutale utilizzando dispositivi microfluidici multimodali.