Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare l'ipossia intermittente in scala minuti agli occhielli pancreatici in micro scala per studiare gli effetti del precondizionamento. Ciò si ottiene fabbricando prima un dispositivo microfluidico multimodale con una sottile membrana permeabile ai gas. Il secondo passo è quello di creare un sistema computerizzato di modulazione dell'ossigeno.

Successivamente gli occhielli vengono caricati con cura nel dispositivo, quindi vengono collegati i microfluidici liquidi e ossigeno. Il passo finale consiste nel coordinare la microscopia con la microfluidica multimodale per visualizzare i parametri dell'occhiello che vengono modificati durante la modulazione dell'ossigeno. In definitiva, la tecnica dell'ipossia intermittente con occhiello viene utilizzata per dimostrare che la risposta al glucosio è chiaramente compromessa nell'ipossia.

Mentre le modulazioni temporali dell'ipossia possono addestrare gli occhielli a rispondere con meno compromissione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'ossigeno disciolto o l'utilizzo di una camera ipossica, è che è accurata. La concentrazione di ossigeno potrebbe essere erogata alle palpebre in intervalli di tempo rapidi e minuscoli senza lo stress dovuto a flussi complicati.

Consente inoltre il monitoraggio in tempo reale con pavimento e microscopia. Questo master può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei trapianti di Alli, come la definizione delle menomazioni ipossiche nei siti di trapianto o i regimi di precondizionamento per migliorare i risultati del trapianto. Quindi questo metodo può fornire informazioni sull'ipossia di Alli.

Può anche essere applicato ad altri tessuti e sistemi come il sistema nervoso centrale, i tessuti cardiaci, i reni e altri organi di trapianto. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, poiché molti dei dispositivi sono stati realizzati e maneggiati con occhielli. I passaggi sono difficili da apprendere a causa della nuova natura interdisciplinare della tecnica, ma inerenti alla sfida o alla familiarizzazione Iniziare fabbricando lo strato di copertura del dispositivo microfluidico.

Per ottenere ciò, versare i DGA premiscelati PDMS a un'altezza di 1,5 millimetri in una capsula di Petri vuota e polimerizzarla a 80 gradi Celsius per due ore. Successivamente, fabbricare lo strato microfluidico di glucosio con il master della camera di profusione mediante rivestimento di rotazione di due strati spessi 350 micron di SU 8 21 50 per formare un singolo strato di 700 micron su un wafer di silicone da quattro pollici. Quindi esporlo alla luce UV utilizzando la maschera fotografica dello strato microfluidico di glucosio per trasferire il modello di microcanali sullo strato SU otto.

Risciacquare l'area non esposta con lo sviluppatore SU eight. Successivamente, versare i DGA premiscelati PDMS sulla MA fino a un'altezza di tre millimetri e polimerizzare a 80 gradi Celsius per due ore. Una volta indurito, tagliare lo strato microfluidico di glucosio per modellare e utilizzare un punzone da due millimetri per formare le porte di ingresso e uscita, nonché un punzone da otto millimetri di diametro per la camera principale.

Successivamente, fabbricare il micro pozzetto master per l'immobilizzazione delle palpebre mediante spin coating di uno strato spesso 100 micron di SU 8 2100 su un wafer di silicio pulito da quattro pollici, quindi utilizzare la litografia UV per trasferire il modello di micro pozzetti su questo strato. Sciacquare le aree non esposte con lo sviluppatore quando il master per micropozzetti è completo. Aggiungere due strati da 100 micron di PDMS mediante rivestimento a rotazione a 900 giri/min per 30 secondi, quindi polimerizzare per 10 minuti a 80 gradi Celsius per produrre ogni strato.

Una volta terminato, perforare l'ingresso di due millimetri di diametro nelle porte di uscita. Infine, fabbricare il master microfluidico del gas ruotando SU 8 da 2100 a 100 micron di spessore come nello strato precedente e trasferire nuovamente i modelli microfluidici del gas utilizzando la litografia UV. Risciacquare l'area non esposta con lo sviluppatore.

Successivamente, versare uno strato di PDMS spesso 1,5 millimetri sul master microfluidico del gas e polimerizzare a 80 gradi Celsius per due ore. Quindi tagliare il PDMS in forma con la lametta. Quindi perforare le porte di ingresso e uscita di due millimetri di diametro nello strato di copertura per allinearle con il punto in cui si trovano sugli altri strati per unire i più strati.

Per prima cosa, preparali pulendo le superfici con dello scotch, esponendole a un arco di Corona e poi allineando gli strati a mano nell'ordine seguente. Innanzitutto, incollare la membrana allo strato di gas inferiore con i micro pozzetti rivolti verso l'alto. Quindi incollare lo strato microfluidico di glucosio sopra la membrana del micropozzetto.

Infine, incollare lo strato di ingresso e uscita sulla parte superiore, incapsulando l'intero gruppo. Aiuta a formare un legame stretto aggiungendo un peso di un chilogrammo sopra l'assemblaggio e cuocendolo a 100 gradi Celsius per tre ore. Poi perdita.

Testare il dispositivo caricando l'acqua nello strato acquoso, immergendo il dispositivo e facendo fluire l'aria attraverso lo strato di gas con la siringa mentre si cercano perdite. Infine, sterilizzare i dispositivi senza perdite facendo passare il 70% di etanolo attraverso lo strato acquoso per uno o due minuti. Configurare i micro erogatori collegando prima i cavi di controllo dei micro erogatori alle unità driver incluse.

Quindi collegare i driver alla scheda IO digitale alle porte corrispondenti ai controlli della vista del laboratorio. Quindi, collegare gli alimentatori da cinque volt e 20 volt CC ai contatti corrispondenti sulle unità di azionamento e collegare l'IO digitale a un laptop per eseguire i codici di visualizzazione del laboratorio per il controllo del gas, come descritto nell'appendice del protocollo di testo allegato. Quindi collegare un micro erogatore all'azoto e l'altro all'aria compressa, entrambi contenenti il 5% di anidride carbonica, e impostare entrambi i gas su due PS. Collego le uscite dell'erogatore in una giunzione a T prima di entrare nel dispositivo microfluidico.

Quindi, montare il dispositivo sul tavolino riscaldato di un microscopio invertito con 0% e 21% di ossigeno collegato al dispositivo. Successivamente, posizionare un sensore di ossigeno a fibre ottiche all'uscita del fluido per misurare l'ossigeno disciolto all'interno dell'uscita in tempo reale. Quindi collegare il dispositivo a una pompa peristaltica e iniziare a far fluire l'acqua attraverso il dispositivo a 250 microlitri al minuto.

Caratterizzare la risposta transitoria della modulazione dell'ossigeno facendo scorrere i micro erogatori tra il 5 e il 21% di ossigeno. Collegare una pompa peristaltica al dispositivo microfluidico e posizionare il tubo su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius per riscaldare il fluido prima che entri nel dispositivo microfluidico. Inoltre, collegare la porta di uscita della microfluidica del glucosio a un collettore di frazioni per iniziare a sezionare i topi C 57 black six e isolare gli occhielli pancreatici mediante digestione collagenasi e separazione del gradiente di densità F ccale, come descritto nei seguenti video disponibili da JoVE una volta isolati.

Incubare gli occhielli in terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS, l'1% di penicillina streptomicina e 20 cumuli millimolari in piastre di Petri per 24-48 ore. Utilizzare gli occhielli entro due giorni per garantire risultati coerenti. Successivamente, preparare il tampone bicarbonato Krebs ringer fresco come descritto nel protocollo di testo allegato con una soluzione contenente due millimolari di glucosio e un'altra contenente 14 millimolari di glucosio.

Scaldare le soluzioni in tubi conici da 50 millilitri mettendoli in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi preparare la colorazione per gli occhielli isolati aggiungendo cinque micromolari di 4:02 AM e DMSO e 2,5 micromolari di RH 1, 23 e 100% di etanolo a due millilitri del tampone Krebs contenente due millimolari di glucosio. Quindi, raccogliere gli occhielli con una pipetta da 10 microlitri e incubarli in colorante per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Una volta colorato, caricare circa 20 occhielli nel dispositivo attraverso l'ingresso del microcanale del glucosio. Dirigere gli occhielli nella camera adescando il tampone dall'uscita all'ingresso. Quindi perfondere gli occhielli e il tampone per 10 minuti per lavare via i coloranti in eccesso.

Innanzitutto, aspirare due millimolari di tampone bicarbonato Krebs ringer attraverso il sistema per cinque minuti per stabilire una normale linea di base del polso. Quindi stimolare la camera con il tampone glicemico da 14 millimolari per 15 minuti, seguito da un lavaggio di 15 minuti con il tampone glicemico da due millimolari. Durante questo processo, registrare il 510 nanometro per due emissioni eccitando la dieta 340 nanometri e 380 nanometri.

Inoltre, registrare l'emissione 530 di RH 1 23 eccitando il colorante a 480 nanometri. Per ridurre al minimo i disturbi convettivi durante la modulazione dell'ossigeno, applicare il flusso tampone durante le fasi di stimolazione e lavaggio e assicurarsi di interrompere il flusso nelle altre fasi durante il test. Raccogliere l'effluenza dall'uscita del glucosio a intervalli di un minuto per utilizzarla in ulteriori analisi utilizzando l'approccio microfluidico mostrato in questo video, è possibile regolare rapidamente la percentuale di ossigeno che scorre oltre la sottile membrana PDMS utilizzando i micro iniettori computerizzati.

Ecco un esempio di questa modulazione che va da un minuto a sei minuti. È anche possibile fornire modulazioni quantitative inferiori al minuto di ossigeno tra due e 8,5 parti per milione, erogando ossigeno tra il 5 e il 21%: la linea blu mostra la percentuale di ossigeno erogato e il verde è l'ossigeno disciolto risultante in parti per milione. Quando questo ciclo viene applicato per creare ipossia intermittente agli occhielli, si possono osservare i benefici del precondizionamento degli occhielli contro l'ipossia rispetto all'impulso normossico irregolare osservando il miglioramento del rapporto dopo il trattamento degli effetti dell'ipossia e l'ipossia intermittente può essere osservata nell'overshoot e nello smorzamento dell'oscillazione dei transitori di calcio come mostrato qui in blu è la risposta normossica.

In rosso c'è la risposta ipossica e la linea verde è la risposta ipossica condizionata. Qui sono mostrate la misura del calcio, del potenziale mitocondriale e dell'insulina. Sono i risultati della microscopia fluorescente in tempo reale e del test EISA off chipp che utilizza l'effluenza microfluidica dal sistema insieme, questi iniziano a costruire una visione multimodale della risposta insulino-glucosio in condizioni transitorie ipossiche.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due giorni se eseguita correttamente, un giorno per la fabbricazione del dispositivo e per isolare le cellule palpebrali e un giorno per gli esperimenti palpebrali stessi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare la concentrazione di ossigeno erogata sposando l'atore di gas del dispositivo dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nello sbocco fetale e in altre microfisiologie tissutali per esplorare come l'ipossia e i modelli temporanei di ossigeno possono influenzare malattie come il diabete, i disturbi cardiovascolari e neurologici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come controllare la modulazione dell'ossigeno, manipolare i microtessuti e generare misurazioni ripetibili e significative dell'ipossia tissutale utilizzando dispositivi microfluidici multimodali.