Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare i lisati di singole cellule utilizzando la fluorescenza o i saggi immunologici. Ciò si ottiene creando prima un dispositivo microfluidico e rivestendo la camera interna con anticorpi. Quindi le singole cellule vengono immobilizzate nelle trappole e vengono esposte a vari reagenti per stimolare una risposta cellulare in una seconda fase.

Una valvola a forma di anello viene chiusa rapidamente e il tampone di lisi viene fatto scorrere attraverso il dispositivo. La valvola a forma di anello viene aperta per un breve periodo e le cellule vengono lisate all'interno della microcamera, consentendo alle proteine rilasciate di legarsi agli anticorpi ad alta concentrazione a causa del piccolo volume. Successivamente, viene aperta la valvola a forma di anello.

La camera viene lavata e i reagenti di rilevamento vengono introdotti nella microcamera chiusa. L'aumento dell'intensità della fluorescenza viene monitorato nel tempo utilizzando un microscopio a fluorescenza, i risultati dimostrano la capacità di questo sistema di rilevare quantitativamente e in modo affidabile un analita di interesse rilasciato dalle singole cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'analisi delle singole cellule A.

In particolare, sono state condotte indagini sistematiche sulla risposta cellulare alle variazioni dell'ambiente chimico. Possiamo vedere regolazioni su o giù delle molecole intracellulari come risultato dello stimolo chimico. Ci sono due vantaggi principali di questa tecnica.

Il primo è che possiamo esporre le cellule immobilizzate a un ambiente chimico definito che è costante o cambia periodicamente. In secondo luogo, possiamo riformare un'analisi altamente sensibile e specifica dello stato senza alcuna contaminazione incrociata o perdita di analiti dovuta al trasporto. Per iniziare, fabbricare i tre diversi wafer master SU, come descritto nel protocollo di testo allegato.

Uno verrà utilizzato per creare lo strato fluidico, uno per lo strato di controllo e un terzo per il micro timbro a contatto. Quindi fabbricare i chip microfluidici iniziando con la preparazione di una miscela 10 a uno di PDMS e un agente indurente. Mescolare energicamente entrambe le parti e degassare la soluzione per 30 minuti o fino a quando la miscela non sarà priva di bolle.

Quindi, posiziona il wafer all'interno dello strato di controllo all'interno di una capsula di Petri e fissalo sul fondo. Versare sopra circa 50 grammi di PDMS per creare uno strato spesso da quattro a cinque millimetri e posizionare il wafer per almeno due ore in forno a 80 gradi Celsius per garantire la completa polimerizzazione del PDMS. Ripetere la stessa procedura per il wafer di stampa a micro contatto, ma utilizzare circa 20 grammi di PDMS invece di 50, ottenendo uno strato di PDMS spesso da quattro a cinque millimetri.

Per preparare lo strato inferiore, centrifugare uno strato PDMS alto 40 micron sul wafer con lo strato microfluidico. Utilizzando una velocità di rotazione di 2000 giri/min per 60 secondi. Polimerizzare lo strato PDMS in forno per un'ora a 80 gradi Celsius quando tutte le parti si sono indurite.

Rimuovere lo strato di controllo dalla cialda e tagliarla a pezzi con l'aiuto della lama del rasoio. Quindi praticare i fori di collegamento a pressione utilizzando una puntura per biopsia da un millimetro e coprire i canali con nastro adesivo per la conservazione. Quindi, rimuovere il PDMS dal wafer di stampa a micro contatto e preparare timbri delle dimensioni dell'area della camera.

Conservali senza polvere in un cassetto fino al momento dell'uso. Quindi posizionare il wafer rivestito di centrifuga e lo strato di controllo spesso da quattro a cinque millimetri in un pulitore al plasma. Esporre i pezzi a 18 watt per 45 secondi utilizzando ossigeno al plasma a 0,75 millibar.

Dopo il trattamento al plasma, allineare rapidamente entrambi gli strati al microscopio con un'ampia distanza di lavoro. Aggiungere un po' di PDMS di ricambio attorno alle parti superiori posizionate per facilitare la rimozione del PDMS dal wafer. Mettete poi la cialda in forno a 80 gradi per almeno un'ora.

Una volta indurito, utilizzare un bisturi per rimuovere con cura il PDMS dal wafer e per ritagliare i microchip fori di accesso per le connessioni fluidiche con una puntura bioptica da 1,5 millimetri. Inoltre, creare un serbatoio nel microchip tagliando la parte superiore di un puntale per pipette da 200 microlitri e utilizzando alcuni PDMS semi polimerizzati di ricambio. Incollalo sopra.

Quindi polimerizzare la patatina in forno a 80 gradi Celsius per almeno un'ora. Iniziare pulendo una slitta di vetro e le parti del PDMS. Pulisci un vetrino con sapone.

Sciacquarlo con acqua distillata e poi di nuovo con etanolo. Asciugare il vetrino con un getto di azoto. Utilizzare del nastro adesivo per rimuovere eventuali detriti e particelle di polvere dal PDMS.

Quindi posizionare la parte PDMS e il vetro pulito. Far scorrere nel pulitore al plasma per 45 secondi a 18 watt per garantire un incollaggio stretto, posizionare il chip su una piastra calda per cinque minuti dopo il trattamento al plasma Dopo l'incollaggio, tagliare la parte inferiore di alcuni puntali per pipette da 200 microlitri. Riempili con 10-15 microlitri di PBS filtrato con il 4% di BSA e inseriscili negli ingressi del dispositivo.

Quindi utilizzare le punte tagliate con l'aggiunta di 10-15 microlitri di PBS e inserirle nei canali di controllo. Quindi, posizionare i chip nella centrifuga e farli girare a 800 volte la gravità per cinque minuti per riempire i canali di fluido. Se l'aria rimane in uno qualsiasi dei canali, ripetere questo passaggio fino a quando i canali non sono completamente pieni.

Incubare la soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare la soluzione dallo strato fluido con PBS a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto. Utilizzando una pompa a siringa, il dispositivo è ora pronto per gli esperimenti cellulari per prestampare il vetrino per i saggi immunologici incubare i timbri di stampa a micro contatto PDMS con BSA biotinilato allo 0,5% in una capsula di Petri pulita.

Dopo mezz'ora, pulire accuratamente e rapidamente i timbri con acqua distillata e asciugare il timbro sotto un getto di azoto. Una volta asciutti, posizionare rapidamente i timbri su un vetrino pulito per depositare il BSA biotinilato modellato. Non spostare il timbro dopo averlo posizionato e verificare che il timbro sia a contatto con il vetrino.

In caso contrario, picchiettare leggermente il timbro, ma non premere con forza. Quindi posizionare il timbro insieme alla parte superiore del chip microfluidico nella camera al plasma ed esporli al plasma di ossigeno a 18 watt per 45 secondi. Dopo il trattamento al plasma, rimuovere il timbro dal vetrino.

Respirare sulla superficie renderà visibile il motivo. Allineare le microcamere sulla parte superiore della superficie stampata. Una volta allineato, posizionare il chip su una piastra calda a 50 gradi Celsius per 30 minuti per bloccare la superficie rimanente, introdurre una soluzione BSA filtrata sterile al 4% in PBS nel chip con una centrifuga come mostrato in precedenza, incubare il microchip per almeno 30 minuti e quindi lavare la soluzione dallo strato fluido con PBS a una portata di 10 microlitri al minuto.

Utilizzando una pompa a siringa, utilizzare il chip direttamente o conservarlo per un massimo di due settimane a quattro gradi Celsius in una scatola umida. Quindi, creare una superficie di legame completamente funzionale introducendo avadon in PBS nel serbatoio. Far scorrere la soluzione per aspirare l'avadon attraverso i canali del fluido in seguito.

Sciacquare accuratamente il serbatoio e sciacquare i canali con PBS. Quindi aggiungere la proteina G al serbatoio e tirarla attraverso i canali. Lavare via le proteine G in eccesso sciacquando il serbatoio e la patatina con PBS.

Quindi, aggiungi l'anticorpo di interesse al serbatoio e fallo fluire attraverso i canali. Quindi arrestare il flusso per consentire il legame prima di lavare i canali con PBS fluorescente, gli analoghi etichettati possono essere utilizzati per verificare la qualità del processo di stampa prima di introdurre le celle nei canali. Raccogliere le cellule aderenti come le cellule HE 2 9 3 mostrate qui utilizzando un tampone di dissociazione privo di enzimi, quindi filtrarle per ridurre il numero di cluster cellulari una volta filtrate, caricarle in una siringa.

A 300.000 cellule per millilitro, caricare le celle sul chip utilizzando il flusso in avanti sulla pompa a siringa per circa tre minuti a una velocità compresa tra 10 e 20 microlitri al minuto per celle adesive come queste al fine di prevenire l'attaccamento non specifico delle celle quando le trappole sono riempite, chiudere le camere pressurizzando lo strato superiore con tre barre. Quindi esaminare le camere utilizzando un microscopio. Se si scopre che molte cellule hanno aderito in modo non specifico alla superficie all'interno delle camere, aprirle rapidamente e provare a lavarle via con un tampone di dissociazione cellulare a una velocità di flusso da 10 a 30 microlitri al minuto.

Per il test della glucosio sei fosfato deidrogenasi o G sei PDH, aggiungere due millimolari di glucosio, sei fosfati 0,5 millimolari e un DP 0,5 unità per millilitro di DIA e 0,3 millimolari RIN a un tampone di lisi e assicurarsi che sia ben miscelato. Una volta liberati i canali, aspirare il tampone di lisi G six PDH attraverso il chip a una velocità di flusso di 30 microlitri al minuto. Mentre il tampone di lisi scorre, aprire e chiudere rapidamente le camere, lasciandole aperte per 500 millisecondi per consentire alla lisi di entrare nella camera immediatamente dopo l'inizio della lisi per monitorare la reazione cinetica.

In questo esempio, un prodotto fluorescente può essere monitorato nel tempo. Qui è mostrata una serie di camere che sono state riempite con colorante alimentare arancione e poi chiuse pressurizzando lo strato di controllo sopra le micro camere. Dopo la chiusura della camera, il colorante alimentare verde veniva risciacquato attraverso i canali per mostrare la tenuta delle camere.

Ogni camera contiene un volume di soli 625 picolitri di fluido che mantiene la concentrazione di molecole rilasciate dalle cellule di lisi sufficientemente alta per l'analisi. Inoltre, le valvole possono essere aperte e chiuse in modo da eliminare la contaminazione incrociata tra le camere. All'interno di queste camere è possibile misurare analiti come la quantità di lisosoma rilasciata da una singola cellula U 9 37 attivata da PMA, in quanto catalizza enzimaticamente la produzione di una molecola fluorescente all'interno della camera.

Le linee verdi rappresentano la variazione dell'intensità della fluorescenza nel tempo per le camere occupate da una cella. Viene mostrata anche l'intensità di fluorescenza per una camera senza celle rappresentata dalla linea tratteggiata nera. Per confronto, questo test mostra l'effetto di una molecola tossica sull'integrità della membrana misurando un enzima intracellulare G 6 PDH.

La linea nera rappresenta i campioni di controllo senza influenza tossica, mentre la linea arancione rappresenta le cellule influenzate dalla tossina mostrata. Ecco un esempio di test immunologico per la proteina intracellulare. Gli anticorpi GFP anti GFP sono stati immobilizzati sulla superficie e una volta che le cellule sono state lisate, la cinetica di legame delle proteine GFP è stata visualizzata utilizzando la microscopia per tappeto erboso.

Il tempo 0,1 segna l'introduzione del tampone di lisi nel momento in cui la GFP 0,2 inizia ad accumularsi sulla superficie, il che significa che la lisi cellulare si è verificata e la GFP si è diffusa sulla superficie. Il legame della GFP agli anticorpi è completato al tempo 0,3. In questo esempio finale, sono stati aggiunti gli anticorpi di rilevamento GA DH liberati per catturare gli anticorpi sulla superficie e quindi gli anticorpi di rilevamento accoppiati a HRP.

Una volta che tutti gli anticorpi di rilevamento non legati sono stati lavati via, è stato introdotto il reagente di rilevamento e la reazione è avvenuta nel tempo. Ecco un confronto della quantità di GA DH precedentemente intracellulare in quantità animali tra U 9 37 e HEC 2 93 cellule misurate con questo metodo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i chip microfluidici, come modificare la superficie per consentire i saggi immunologici e, infine, come utilizzare il dispositivo per l'analisi di singole cellule A.

Questo metodo può essere impiegato per aiutare a rispondere a molte domande nel campo della biologia delle singole cellule.