2.9: Purificazione del plasmide

I plasmidi sono molecole di DNA circolari, extra cromosomiche, e in biologia molecolare agiscono come vettori, o vettori, per uno specifico frammento di DNA. I batteri vengono utilizzati per replicare i plasmidi, in modo che il DNA di interesse venga prodotto in serie. Il processo attraverso il quale i ricercatori ottengono plasmidi dai batteri è chiamato purificazione plasmidica, che verrà spiegato in questo video.

Ovviamente, la purificazione dei plasmidi comporta la purificazione dei plasmidi, ma cosa significa esattamente? Per purificare i plasmidi, devono essere isolati dal cromosoma batterico, dalle proteine, dalla membrana batterica e dai ribosomi batterici.

Sebbene esistano molti kit diversi per la purificazione dei plasmidi, il principio di base alla base della purificazione dei plasmidi rimane lo stesso per tutti. In primo luogo, la colonia batterica selezionata viene coltivata in un terreno di coltura appropriato che contiene gli antibiotici corretti. Grazie a un gene di resistenza agli antibiotici, codificato dal plasmide, solo i batteri che lo contengono cresceranno in questo mezzo. I batteri vengono raccolti e lisati a pH elevato. Il pH viene neutralizzato, viene aggiunto il sale e quindi la miscela viene centrifugata per rimuovere i detriti e il DNA genomico.

Il lisato cellulare neutralizzato viene aggiunto su una colonna di silice. Si ritiene che il DNA plasmidico aderisca alla colonna tramite un meccanismo chiamato scambio anionico, in cui il DNA, un anione forte, si lega alla colonna caricata negativamente tramite un ponte salino cationico. Altri materiali del lisato, come le proteine, vengono lavati attraverso la colonna con tamponi ad alto contenuto di sale. Infine, il plasmide purificato viene rilasciato dalla colonna quando viene aggiunto un tampone a basso contenuto di sale che interrompe il ponte salino.

Per questa procedura è necessario indossare un camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi.

Le colture batteriche, che vengono trasformate con il DNA plasmidico desiderato, devono essere coltivate durante la notte in terreni di crescita con antibiotico appropriato in un 37? C incubatrice a scuotimento.

Il giorno successivo, la coltura batterica viene pellettata mediante centrifugazione e il surnatante viene rimosso. Il pellet rimanente viene risospeso nel tampone di lisi.

Una volta ririsospesi, i batteri possono essere trasferiti in una provetta più piccola dove viene aggiunto il tampone di lisi. Il tampone di lisi ha un pH elevato e contiene detergenti, come il dodecil solfato di sodio, che distruggono le membrane batteriche, lisando così i batteri. La soluzione diventerà torbida con l'aggiunta del tampone di lisi e dopo la miscelazione la soluzione diventerà più limpida. La miscela non deve essere agitata a causa della possibilità di tranciare o rompere il DNA genomico, che potrebbe quindi contaminare la purificazione del DNA plasmidico.

Quindi, viene aggiunto un tampone di neutralizzazione per neutralizzare le condizioni alcaline e abbassare il pH. Con una miscelazione delicata, il DNA genomico e tutte le proteine ad esso legate precipiteranno, mentre il DNA plasmidico rimarrà in soluzione. Ancora una volta evitate il vortice, in modo che i vostri plasmidi siano privi di contaminazione genomica del DNA.

La miscela viene quindi centrifugata e il precipitato genomico di DNA/proteina viene pellettato. Il surnatante contiene il DNA plasmidico e proteine solubili.

Questo surnatante viene posizionato sulla colonna mediante travaso, un nome di fantasia per versarlo, o pipettaggio. Il pellet può essere scartato.

Successivamente, il tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale passa attraverso la colonna mentre il DNA rimane legato alla silice. Ripetute fasi di lavaggio con tampone ad alto contenuto di sale rimuovono endonucleasi, RNA, proteine, coloranti e impurità a basso peso molecolare. Il flusso delle fasi di lavaggio deve essere eliminato. Dopo l'ultima fase di lavaggio, assicurarsi che il filtro sia completamente asciutto senza residui di tampone. Il DNA plasmidico si trova ancora sul filtro.

Il DNA plasmidico viene eluito con acqua sterile o con un tampone di eluizione. Il DNA è prontamente disponibile per l'uso immediato in un'ampia gamma di applicazioni.

Esistono diversi modi per verificare la purezza dei plasmidi dopo la purificazione. Uno spettrometro può essere utilizzato per confrontare l'assorbanza a diverse lunghezze d'onda per determinare la concentrazione di DNA plasmidico. Un'analisi su gel di agarosio del plasmide purificato può determinare se il plasmide ha le dimensioni corrette e non ci sono contaminanti. Questo passaggio garantisce che non vi sia alcuna contaminazione genomica del DNA e che il plasmide non sia stato modificato nei batteri.

La procedura di purificazione del plasmide può essere modificata per adattarsi a diverse dimensioni del plasmide, numero di copie, volume di coltura e può includere diverse apparecchiature per le fasi di legame, lavaggio ed eluizione. La resa sembra essere una delle distinzioni più importanti tra i preparati plasmidici e sono spesso divisi in minipreparazione, o miniprep, midiprep, maxiprep e megaprep a seconda della resa desiderata.

In termini di applicazioni a valle, una procedura che segue comunemente la purificazione dei plasmidi è la trasfezione, che prevede l'introduzione di DNA plasmidico nelle cellule eucariotiche. Spesso l'obiettivo di un esperimento di trasfezione è quello di visualizzare la struttura di cellule e tessuti con proteine reporter, come quelle che etichettano i neuroni nelle immagini che vedete qui.

A volte più plasmidi purificati da diverse preparazioni di purificazione possono essere introdotti negli stessi batteri, riproducendo così un'intera via biosintetica attraverso la produzione di un numero di enzimi codificati dai plasmidi. Il risultato finale è la produzione di un composto complesso, come l'antibiotico che vedete qui, da parte della cellula.

I plasmidi purificati possono essere reintrodotti nei batteri, al fine di generare grandi quantità di proteine codificate dal plasmide. Qui si vedono le cellule batteriche che vengono omogeneizzate e lisate prima che possa essere eseguita una tecnica chiamata purificazione di affinità per isolare la proteina bersaglio. La proteina purificata viene cristallizzata e la sua struttura viene quindi identificata.

Avete appena visto l'introduzione di JoVE alla purificazione dei plasmidi. In questo video abbiamo discusso i principi di base di questo metodo, la sua descrizione passo dopo passo e una manciata di applicazioni della tua preparazione plasmidica. Come sempre, grazie per la visione!