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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Purificazione del plasmide

Plasmid Purification

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Plasmid Purification

2.8: The ELISA Method

2.10: Gel Purification

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08:16 min

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April 30, 2023

Overview

La purificazione del plasmide è una tecnica utilizzata per isolare e purificare il DNA plasmidico dal DNA genomico, dalle proteine, dai ribosomi e dalla parete cellulare batterica. Un plasmide è un DNA piccolo, circolare, a doppio filamento che viene utilizzato come vettore di specifiche molecole di DNA. Quando introdotto in un organismo ospite attraverso la trasformazione, un plasmide verrà replicato, creando numerose copie del frammento di DNA in studio.

In questo video, viene descritta una procedura generalizzata passo-passo su come eseguire la purificazione del plasmide. La purificazione del plasmide comprende tre fasi fondamentali: crescita della coltura batterica, raccolta e lisi dei batteri e purificazione del DNA plasmidico. Il video contiene una spiegazione in cui il plasmide può essere trovato in ogni fase del protocollo e per analizzare quantitativamente e qualitativamente il DNA del plasmide con uno spettrofotometro e / o un’elettroforesi su gel. Esistono diversi tipi di metodi di purificazione del plasmide disponibili, che sono orientati verso la resa desiderata, il numero di copie del plasmide e il volume della coltura batterica.

Procedure

I plasmidi sono molecole circolari, extra cromosomiche, di DNA e in biologia molecolare fungono da vettori, o vettori, per uno specifico frammento di DNA. I batteri vengono utilizzati per replicare i plasmidi, in modo che il DNA di interesse sia prodotto in serie. Il processo attraverso il quale i ricercatori ottengono plasmidi dai batteri è chiamato purificazione dei plasmidi, che sarà spiegato in questo video.

Ovviamente, la purificazione dei plasmidi comporta la purificazione dei plasmidi, ma cosa significa esattamente? Per purificare i plasmidi, devono essere isolati dal cromosoma batterico, dalle proteine, dalla membrana batterica e dai ribosomi batterici.

Sebbene esistano molti kit diversi per purificare i plasmidi, il principio di base alla base della purificazione dei plasmidi rimane lo stesso per tutti. In primo luogo, la colonia batterica selezionata viene coltivata in un mezzo di coltura appropriato che contiene gli antibiotici corretti. Grazie a un gene di resistenza agli antibiotici, codificato dal plasmide, solo i batteri contenenti il plasmide cresceranno in questo mezzo. I batteri vengono raccolti e llisi sotto un pH elevato. Il pH viene neutralizzato, viene aggiunto sale e quindi la miscela viene filata verso il basso per rimuovere detriti e DNA genomico.

Il lisato cellulare neutralizzato viene aggiunto su una colonna di silice. Si ritiene che il DNA plasmidico aderisca alla colonna attraverso un meccanismo chiamato scambio anionico, in cui il DNA, un anione forte, si lega alla colonna caricata negativamente attraverso un ponte di sale cationico. Altri materiali del lisiato, come le proteine, vengono lavati attraverso la colonna con alti tamponi salini. Infine, il plasmide purificato viene rilasciato dalla colonna quando viene aggiunto un tampone a basso contenuto di sale interrompendo il ponte di sale.

Per questa procedura è necessario indossare un cappotto da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi.

Le colture batteriche, che vengono trasformate con il DNA plasmidico desiderato, devono essere coltivate durante la notte in mezzi di crescita con un antibiotico appropriato in un incubatore vibrante a 37 ° C.

Il giorno successivo, la coltura batterica viene pellettata mediante centrifugazione e il surnatante viene rimosso. Il pellet rimanente viene riconsospendato nel tampone di lisi.

Una volta riconsegati, i batteri possono essere trasferiti in un tubo più piccolo dove viene aggiunto il tampone di lisi. Il tampone di lisi ha un pH elevato e contiene detergenti, come il sodio dodecil solfato, che interrompono le membrane batteriche, lysando così i batteri. La soluzione diventerà torbia con l’aggiunta del tampone di lisi e dopo la miscelazione la soluzione diventa più chiara. La miscela non deve essere vortexata a causa della possibilità di tosare, o rompere, il DNA genomico, che potrebbe quindi contaminare la purificazione del DNA plasmidico.

Quindi, viene aggiunto un tampone di neutralizzazione per neutralizzare le condizioni alcaline e abbassare il pH. Con una delicata miscelazione il DNA genomico e tutte le proteine ad esso legate precipiteranno, mentre il DNA plasmidico rimarrà in soluzione. Ancora una volta evita il vortice, in modo che i tuoi plasmidi siano privi di contaminazione genomica del DNA.

La miscela viene quindi centrifugata e il precipitato genomico DNA/proteina viene pellettato. Il surnatante contiene il DNA plasmidico e proteine solubili.

Questo surnatante viene posizionato sulla colonna decantando, un nome di fantasia per versarlo o pipettare. Il pellet può essere scartato.

Successivamente, il tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale passa attraverso la colonna mentre il DNA rimane legato alla silice. Le ripetute fasi di lavaggio con tampone salino alto rimuovono endonucleasi, RNA, proteine, coloranti e impurità a basso peso molecolare. Il flusso delle fasi di lavaggio deve essere scartato. Dopo l’ultima fase di lavaggio assicurarsi che il filtro sia completamente asciutto senza che rimanga alcun tampone. Il DNA plasmidico si trova ancora sul filtro.

Il DNA del plasmide viene eluito con acqua sterile o un tampone di eluizione. Il DNA è facilmente disponibile per l’uso immediato in una vasta gamma di applicazioni.

Esistono diversi modi per verificare la purezza dei plasmidi dopo la purificazione. Uno spettrometro può essere utilizzato per confrontare l’assorbanza a diverse lunghezze d’onda per determinare la concentrazione di DNA plasmidico. Un’analisi del gel di agarose del plasmide purificato può determinare se il plasmide ha le dimensioni corrette e non ci sono contaminanti. Questo passaggio garantisce che non vi sia alcuna contaminazione genomica del DNA e che il plasmide non sia stato modificato nei batteri.

La procedura di purificazione del plasmide può essere modificata per adattarsi a diverse dimensioni del plasmide, numero di copie, volume di coltura e può includere diverse attrezzature per le fasi di legatura, lavaggio ed eluizione. La resa sembra essere una delle distinzioni più importanti tra i preparati plasmidici e sono spesso divisi in minipreparazione, o miniprep, midiprep, un maxiprep e un megaprep a seconda della resa desiderata.

In termini di applicazioni a valle, una procedura che segue comunemente la purificazione dei plasmidi è la trasfezione, che comporta l’introduzione del DNA plasmidico nelle cellule eucariotiche. Spesso l’obiettivo di un esperimento di trasfezione è quello di visualizzare la struttura di cellule e tessuti con proteine reporter, come quelle che etichettano i neuroni nelle immagini che vedete qui.

A volte più plasmidi purificati da diversi prep di purificazione possono essere introdotti negli stessi batteri, riproducendo così un’intera via biosintetica attraverso la produzione di un numero di enzimi codificati dai plasmidi. Il risultato finale è la produzione di un composto complesso, come l’antibiotico che vedete qui, da parte della cellula.

I plasmidi purificati possono essere reintrodotti nei batteri, al fine di generare grandi quantità di proteine codificate dal plasmide. Qui si vedono le cellule batteriche omogeneizzate e lizzate prima che una tecnica chiamata purificazione dell’affinità possa essere eseguita per isolare la proteina bersaglio. La proteina purificata viene cristallizzata e la sua struttura viene quindi identificata.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla purificazione dei plasmidi. In questo video abbiamo discusso i principi di base alla base di questo metodo, la sua descrizione passo passo e una manciata di applicazioni della preparazione del plasmide. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Plasmids are circular, extra chromosomal, DNA molecules and in molecular biology they act as carriers, or vectors, for a specific DNA fragment. Bacteria are used to replicate plasmids, so that your DNA of interest is mass-produced. The process by which researchers obtain plasmids from bacteria is called plasmid purification, which will be explained in this video.

Obviously, plasmid purification involves purifying plasmids, but what does that mean exactly? To purify plasmids, they must be isolated from the bacterial chromosome, proteins, the bacterial membrane, and bacterial ribosomes.

Though many different kits exist for purifying plasmids, the basic principle behind plasmid purification remains the same for all. First, the selected bacterial colony is grown in an appropriate culture media that contains the correct antibiotics. Thanks to an antibiotic resistance gene, encoded by the plasmid, only bacteria containing the plasmid will grow in this media. The bacteria are harvested and lysed under a high pH. The pH is neutralized, salt is added, and then the mixture is spun down to remove debris and genomic DNA.

Neutralized cell lysate is added onto a silica column. Plasmid DNA is believed to adhere to the column via a mechanism called anion exchange, where DNA, a strong anion, binds to the negatively charged column via a cation salt bridge. Other material from the lysate, such as proteins, are washed through the column with high salt buffers. Finally, purified plasmid is released from the column when a low salt buffer is added disrupting the salt bridge.

For this procedure a lab coat, disposable gloves and protective goggles should be worn.

The bacterial cultures, which are transformed with the desired plasmid DNA, should be grown overnight in growth media with appropriate antibiotic in a 37°C shaking incubator.

The next day, the bacteria culture is pelleted by centrifugation and the supernatant is removed. The remaining pellet is resuspended in lysis buffer.

Once resuspended, bacteria can be transferred to a smaller tube where lysis buffer is added. Lysis buffer has a high pH and contains detergents, such as sodium dodecyl sulfate, which disrupt the bacterial membranes, thereby lysing the bacteria. The solution will turn cloudy with the addition of the lysis buffer and after mixing the solution becomes more clear. The mixture should not be vortexed due to the possibility of shearing, or breaking apart, genomic DNA, which could then contaminate plasmid DNA purification.

Then, neutralization buffer is added to neutralize the alkaline conditions and lower the pH. With gentle mixing genomic DNA as well as any proteins bound to it will precipitate, while plasmid DNA will stay in solution. Once again avoid vortexing, so as your plasmids are free of genomic DNA contamination.

The mixture is then centrifuged and the genomic DNA/protein precipitate is pelleted. The supernatant contains the plasmid DNA as well as soluble proteins.

This supernatant is placed onto the column by decanting, a fancy name for pouring it off, or pipetting. The pellet can be discarded.

Next, high salt washing buffer passes through the column while the DNA remains bound to the silica. Repeated washing steps with high salt buffer removes endonucleases, RNA, proteins, dyes, and low-molecular weight impurities. The flow-through of the wash steps should be discarded. After the final washing step make sure the filter is completely dry without any buffer remaining. The plasmid DNA is still located on the filter.

The plasmid DNA is eluted with sterile water or an elution buffer. The DNA is readily available for immediate use in a wide range of applications.

There are a number of ways to verify the purity of plasmids after purification. A spectrometer can be used to compare absorbance at different wavelengths to determine the concentration of plasmid DNA. An agarose gel analysis of the purified plasmid can determine if the plasmid is the correct size and there are no contaminants. This step ensures there is no genomic DNA contamination and the plasmid was not modified in bacteria.

The plasmid purification procedure can be modified to accommodate different plasmid sizes, copy number, culture volume, and can include different equipment for the binding, washing, and elution steps. Yield happens to be one of the most prominent distinctions between plasmid preparations and they are often divided into the minipreparation, or miniprep, the midiprep, a maxiprep, and a megaprep depending on the yield desired.

In terms of downstream applications, one procedure that commonly follows plasmid purification is transfection, which involves the introduction of plasmid DNA into eukaryotic cells. Often the goal of a transfection experiment is to visualize the structure of cells and tissues with reporter proteins, such as those labeling the neurons in the images you see here.

Sometimes multiple plasmids purified by several purification preps can be introduced into the same bacteria, thereby reproducing an entire biosynthetic pathway through the production of a number of enzymes encoded by the plasmids. The end result is the manufacturing of a complex compound, like the antibiotic you see here, by the cell.

Purified plasmids may be reintroduced into bacteria, in order generate large amounts of protein encoded by the plasmid. Here you see bacterial cells being homogenized and lysed before a technique called affinity purification can be performed to isolate the target protein. Purified protein is crystallized and its structure then identified.

You’ve just watched JoVE’s introduction to plasmid purification. In this video we discussed the basic principles behind this method, its step by step description, and a handful of applications of your plasmid prep. As always, thanks for watching!