Name: Protocolli ottimizzati per Mycobacterium leprae Strain Management: congelata Stock Conservazione e Manutenzione in topi nudi atimici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Impara a preparare sospensioni vitali di Mycobacterium leprae per la ricerca sulla lebbra. Questo protocollo dettaglia l'omogeneizzazione, la valutazione della vitalità e la conservazione criogenica del batterio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro e Claudia PM Carvalho per l&#39;assistenza tecnica. Ringraziamo Pranab K. Das per sostenere la creazione della struttura animale. Ringraziamo Lais RR Costa per la revisione del manoscritto. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Fundação Paulista contra Hanseníase e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

1. Preparazione del Mycobacterium leprae sospensione <ol><li> Prima di eutanasia il atimico topo nudo (NU-Foxn1 nu), preparare la soluzione tripsina e terreni di coltura (protocollo dei reagenti - protocolli 1, 2, e 3). Euthanize il topi nudi 4-5 mesi dopo l&#39;inoculazione con M. leprae secondo le Linee Guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali: 2013 Edizione 10 (gli esperimenti e l&#39;uso di immagini di animali sono stati approvati e condotti in conformità con le linee guida del Comitato Animal Care di Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). All&#39;interno di un armadio di sicurezza biologica usata per la movimentazione di animali, pulire l&#39;intera mouse con alcool al 70% di etanolo. </li><li> Tenere la zampa posteriore con pinza emostatica distale al giunto tarsale. Tagliare la zampa fuori con le forbici sotto la pinza ed immergere la zampa in 2% di iodio per 20 min. Quindi, ripetere la procedura per l&#39;altra zampa posteriore. </li><li> Trasferire le zampe ad uncappa di sicurezza biologica pulita per ulteriori lavori. Prendere zampe di iodio 2%, asciugarle con garza sterile e poi raccogliere i due piedini con il numero 22 o 23 lame bisturi, eliminando tutti i tessuti molli (derma, epidermide, tendini e nervi), vicino all&#39;osso. Rimuovere i metatarsi ossa e il 1 ° e 5 ° falangi. Posizionare il materiale in una piastra di Petri sterile e rimuovere l&#39;epidermide, raschiando via con il bisturi. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi con le forbici e trasferirli in una provetta a fondo tondo. Peso del tessuto e aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS). Mantenere la provetta in ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione. </li><li> Aggiungere altre 1 ml di HBSS e omogeneizzare il campione utilizzando un omogeneizzatore tessuto. <ol><li> Primo ciclo omogeneizzazione: 3 impulsi di 15 secondi a velocità 4 (14.450 rpm). </li><li> Trasferire il supernatante in una provetta conica da 50 ml sterile, passando attraverso un colino cella per eliminare i detriti rimanenti. Lasciare che la soluzione per passare da gravità. </li><li> Aggiungere un ulteriore 2 ml di HBSS, e ripetere il ciclo di omogeneizzazione (sezione 1.4.1), e passare i campioni attraverso il filtro delle cellule di nuovo. </li><li> Risciacquare il filtro aggiungendo HBSS per portare il volume a 9 ml. Eliminare il filtro cella. </li></ol></li><li> Scongelare una aliquota di soluzione di tripsina 0,5%. Aggiungere 1 ml di tripsina ai 9 ml di sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 0,05% tripsina. Eliminare restante tripsina scongelati. Incubare per 60 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 °. Dopo l&#39;incubazione, portare il volume a 40 ml con l&#39;aggiunta di soluzione salina sterile per diluire la tripsina. </li><li> Centrifugare a 1700 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatante capovolgendo con attenzione il tubo. Risospendere il pellet toccando il tubo e poi aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica sterile. Trasferire la sospensione in un tubo conico misurando il volume finale della sospensione (per calcolare il rendimento / grammo di tessuto). </li><li> Omogeneizzare la sospensione bacillare utilizzando un 1 ml siringa da insulina con un ago G 26 durante il trasferimento della sospensione in una nuova provetta. </li><li> Eseguire il controllo microbiologico della sospensione mettendo 2 gocce (50 ul) di esso in ciascun mezzo: 7H9 e Lowenstein-Jensen medio e incubare a 37 ° C per 30 giorni, per il rilevamento di contaminanti micobatteri. Analogamente, inoculare un medium Brain Heart Infusion (BHI) e incubare per 24 ore a 37 ° C, per il rilevamento di contaminanti batteri aerobi. </li><li> Aliquota la sospensione in provette per la colorazione: 35 microlitri per Cold Ziehl-Neelsen (protocollo 2), e 200 ml per la determinazione della redditività (protocollo 3). </li><li> Dopo Ziehl-Neelsen (ZN), calcolare il numero di bacilli acido / ml (AFB / ml). Per nudo topi inoculazione, preparare una AFB / sospensione 1 x 10 8 ml, assicurarsi di avere abbastanza volume per inoculare 30 ml / footpad / animale (protocollo 5), e mantenere il freddo sospensione fino inoculazione. Per il congelamento, preparare un 1 x 10 7 AFB / ml suspensione (protocollo 4). </li></ol> 2. Freddo Ziehl-Neelsen <ol><li> Prima di iniziare la colorazione, preparare la soluzione siero / fenolo e le soluzioni ZN colorazione (Protocollo dei reagenti - Protocolli 4 e 5). Disegnare tre cerchi (diametro interno 10 mm) su tre vetrini utilizzando una penna immunoistochimica. Identificare le diapositive: (1) normali o non diluiti, (2) 01:10, e (3) 1:100 utilizzando una matita numero 2 (Nota: alcuni grafite svanisce dopo ZN colorazione). </li><li> Diluire la sospensione bacillare (punto 1.10) a 1:10 e 1:100 diluizioni seriali, cioè aggiungere 5 ml di sospensione non diluito e 45 ml di soluzione fisiologica, poi 5 ml di 1:10 e aggiungere 45 ml di soluzione fisiologica. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione di siero / fenolo e 10 ml di sospensione bacillare a cerchio. Omogeneizzare e diffondere uniformemente intorno alla zona del cerchio con il manico di un ciclo monouso. Attendere che la sospensione ad asciugare su un tavolo livellata. </li><li> Dopo drying, fissare lo striscio passando il vetrino 3 volte sopra la fiamma blu di un becco Bunsen (circa 20 sec totale) 11. </li><li> Per la colorazione, coprire l&#39;intera superficie del vetrino con filtrato carbofuchsine Ziehl-Neelsen (circa 5 ml) per 20 min. </li><li> Sciacquare il vetrino in acqua (flusso lento) in esecuzione. </li><li> Coprire il vetrino con una soluzione alcolica acida 10% per circa 20 sec. </li><li> Lavare nuovamente il vetrino in acqua corrente. </li><li> Coprire il vetrino con una soluzione di blu di metilene per 5 min. </li><li> Sciacquare il vetrino in acqua corrente e lasciare asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Conta 20 campi / cerchio (totale 60 campi / slide) con un obiettivo ad immersione in olio 100X. Il calcolo degli acidi bacilli / ml (AFB / ml) viene fatto come segue, secondo la descrizione delle tecniche di laboratorio per la lebbra 12: AFB / field = numero totale di bacilli si trovano nei 3 cerchi (60 campi) diviso per 60. AFB / ml = AFB / campo x costante (area del cerchiox 100 diviso per area dell&#39;apertura lente dell&#39;obiettivo), e se il conteggio una sospensione diluita, moltiplicare il numero di AFB / ml per il fattore di diluizione (10 o 100). </li></ol> 3. Viabilità Determinazione <ol><li> Prima di iniziare, preparare il M. autoclavato leprae sospensione (protocollo dei reagenti - Protocollo 7). Utilizzare l&#39;apposito kit (vedi tabella di reagenti e attrezzature) per la determinazione qualitativa di M. leprae vitalità nella sospensione. Diluire le soluzioni come segue (in tutte le procedure devono essere eseguite sotto la luce fioca): diluita A di un fattore 10 in soluzione fisiologica (1 ml magazzino più 9 ml di soluzione salina), diluita B 20 di un fattore in soluzione salina (1 ml magazzino più 19 ml di soluzione salina). </li><li> Aggiungere 3,6 ml di soluzione diluita A e 6 ml di soluzione diluita B a 200 microlitri della sospensione bacillare da testare (passo 1.10). A M. precedentemente autoclavato sospensione leprae viene normalmente utilizzato comecontrollo egative per la vitalità colorazione. </li><li> Incubare le sospensioni per 15 minuti, a temperatura ambiente al buio. </li><li> Centrifugare la provetta a 10.600 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 15 ml di glicerolo al 10%. Applicare 8 microlitri alla superficie di un vetrino pulito e coprirlo con una piccola copertura antiscivolo. Analizzare il vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza, che contiene i filtri appropriati (vedere le raccomandazioni sonde molecolari). Valutare i risultati confrontando Syto 9 (Sy) colorazione di ioduro di propidio (PI) colorazione. Nota: macchia Sy penetra il 100% di entrambi i batteri vivi e morti, e macchia PI penetra solo i batteri con membrane danneggiate. La sospensione autoclavato (controllo negativo) può formare blocchi di batteri dovuti alla presenza di detriti cellulari. La scala semiquantitativa utilizzato per la valutazione vivo / morto varia da 0 a 2 +, 0 indica che meno del 30% delle cellule sono positive alla colorazione PI; 1 + significa tra 30 -50% delle cellule sono positive alla colorazione PI; 2 + significa più del 50% delle cellule sono positive alla colorazione PI. Un punteggio di 0 è considerato più adeguato per l&#39;uso. </li></ol> 4. Congelamento / scongelamento M. leprae Sospensione <ol><li> Prima di iniziare, preparare il terreno di congelamento (protocollo dei reagenti - Protocollo 6). Per il congelamento, utilizzare le procedure descritte di seguito: <ol><li> Aggiungere 150 microlitri della sospensione contenente 1 x 10 7 AFB / ml ad una esageratamente sterile con 1 ml di mezzo congelamento. </li><li> Posizionare il esageratamente in un contenitore di congelamento e conservare il recipiente a -80 ° C per 24 ore. </li><li> Trasferire il flacone congelato per una scatola e conservarlo a -80 ° C. </li></ol></li><li> Per lo scongelamento, utilizzare le procedure descritte di seguito: <ol><li> Rimuovere il esageratamente con la sospensione congelata da -80 ° C e inserirlo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per iniziare lo scongelamento sospensione. </li><li> Versare la sospensione in una provetta contenente 20 ml di soluzione sterilesalina. Mescolare la sospensione delicatamente fino scongelamento è completo. </li><li> Centrifugare la sospensione per 30 min, a 1.700 xg, a 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatante e aggiungere abbastanza salina sterile per raggiungere il volume desiderato. Omogeneizzare la sospensione mediante passaggio su una siringa (passo 1.8). </li><li> Per ZN colorazione, la determinazione vitalità e inoculazione, seguire protocolli 2, 3 e 5. </li></ol></li></ol> 5. Topo inoculazione <ol><li> Due persone sono necessarie per questa procedura, uno a frenare il mouse e un altro per amministrare l&#39;inoculo. L&#39;animale deve essere inoculato dovrebbe essere gestito secondo le linee guida e le norme etiche e tutte le procedure devono essere approvati dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale. Trattenere il mouse nudo per la collottola del collo con le zampe verso l&#39;alto. </li><li> Omogeneizzare la sospensione passando attraverso un ago G 26. Con una siringa da 1 ml, aspirare abbastanza sospensione bacillare da inoculite due piedini (30 microlitri / zampa). </li><li> Tenere la zampa posteriore pulire la zampa con il 70% di alcol etanolo prima dell&#39;iniezione intradermica e introdurre l&#39;ago con il bisello dell&#39;ago indicate up, dall&#39;estremità prossimale verso il lato distale della zampa. Iniettare 30 ml di sospensione. Le iniezioni Footpad possono essere effettuate in topi anestetizzati. </li><li> Attendere 5 secondi prima di estrarre l&#39;ago dalla pelle per evitare il reflusso di inoculo. I topi dovrebbero essere ospitati sul morbido palo biancheria da letto inoculazione, e la deambulazione e segni di auto-mutilazione devono essere monitorati. </li></ol>

<ol><li>Saúde, M. inistérioda, Brasil, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretaria+de+Vigil%C3%A2ncia+em+Sa%C3%BAde%3A+situa%C3%A7%C3%A3o+epidemiol%C3%B3gica+da+hansen%C3%ADase+no+Brasil.+Informe+epidemiol%C3%B3gico+2008%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+challenges+of+leprosy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The continuing challenges of leprosy.</a> Clin. Microbiol. Rev. 19 (2), 338-381 (2006).</li>
<li>Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration+may+replace+skin+biopsy+for+the+collection+of+material+for+experimental+infection+of+mice+with+Mycobacterium+leprae+and+Lacazia+loboi%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi.</a> Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).</li>
<li>Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((leprae+as+a+research+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Lepr.+Other+Mycobact.+Dis%22%5BJournal%5D)">leprae as a research reagent.</a> Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69 (1), 1-12 (2001).</li>
<li>Levy, L., Ji, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+foot-pad+technique+for+cultivation+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22Lepr.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae.</a> Lepr. Rev. 77 (1), 5-24 (2006).</li>
<li>Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+viability-staining+method+for+Mycobacterium+leprae+derived+from+the+athymic+%28nu%2Fnu%29+mouse+foot+pad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad.</a> J. Med. Microbiol. 54 (3), 235-242 (2005).</li>
<li>Katoch, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contemporary+relevance+of+the+mouse+foot+pad+model+for+cultivating%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating.</a> 80 (2), 2-120 (2009).</li>
<li>Colston, M. J., Hilson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+freezing+and+storage+in+liquid+nitrogen+on+the+viability+and+growth+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae.</a> J. Med. Microbiol. 12 (1), 1-137 (1979).</li>
<li>Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+freezing+and+thawing+on+the+viability+and+the+ultrastructure+of+in+vivo+grown+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Lepr.+Other+Mycobact.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria.</a> Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56 (4), 580-587 (1988).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Veterinary+Medical+Association%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22%5BJournal%5D)">American Veterinary Medical Association.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).</li>
<li>Saúde, M. inistérioda, Brasil, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guia+de+procedimentos+t%C3%A9cnicos+-+Baciloscopia+em+hansen%C3%ADase%2C+S%C3%A9rie+A%3A+Normas+e+manuais+t%C3%A9cnicos%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos.</a> , (2010).</li>
<li>Health Organization, W. orld, Geneva, , Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una descrizione dettagliata di una ben illustrato, protocollo di successo per la propagazione di M. leprae è grandemente necessario. Il nostro studio dimostra che il protocollo di preparazione inoculo mediante filtrazione e tripsina digestione permette l&#39;inoculo di ottenere con poco detriti cellulari e con alta sostenibilità dei bacilli (punteggio 0 +). Idrossido di sodio è stato utilizzato per disaggregare il tessuto per la purificazione di bacilli 6. Studi condotti nel nostro laboratorio utilizzando idrossido di sodio per la purificazione di M. leprae provocato la formazione di grumi di bacilli, ostacolando l&#39;omogeneizzazione della sospensione per la determinazione vitalità e inoculazione animale (dati non mostrati). Potenziali problemi incontrati con la preparazione dell&#39;inoculo per filtrazione e tripsina digestione includono grande quantità di detriti cellulari e contaminazione dell&#39;inoculo con agenti batterici o fungini. In caso di grandi quantità di debr cellularesi sono osservati dopo purificazione, sia la tripsina non è più attivo o vi è una quantità eccessiva di materiale biologico. L&#39;attività enzimatica della soluzione stock tripsina deve essere valutata. Se si sospetta eccessiva quantità di materiale biologico iniziale, il materiale deve essere suddiviso in aliquote e il protocollo deve essere effettuata in lotti separati. Per evitare la contaminazione dell&#39;inoculo con agenti batterici o fungini, bisogna fare attenzione per elaborare il materiale in condizioni asettiche. Se vengono rilevati funghi e / o contaminazione batterica la sospensione deve essere eliminata. Una limitazione del nostro protocollo è la soggettività della valutazione fattibilità con il metodo semi-quantitativo descritto. Viabilità valutato semi-quantitativamente è più pratico, anche se meno preciso rispetto al metodo quantitativo pubblicato 6. Viabilità punteggio di 0 + e 1 + sono soddisfacenti per la manutenzione di propagazione e il congelamento deiM. leprae. Lahiri et al. hanno già dimostrato che topi nudi inoculati con 80-90% inoculo vitale, producono cuscinetti plantari adatti per la raccolta (alta redditività bacilli) ai 4-5 mesi di inoculazione. Pertanto, infezione precoce (circa 4 mesi) è il miglior tempo di raccolta. Per la raccolta di inoculi congelati, i topi nel presente protocollo sono stati mantenuti inoculata per periodi più lunghi (7 mesi) per garantire curve di crescita. Un passaggio fondamentale per garantire un&#39;adeguata redditività è l&#39;uso di sospensioni freschi bacilli, preferibilmente entro 24 ore dopo il prelievo di materiale biologico dall&#39;host e lavorazione. Inoltre, la qualità dei reagenti, soluzioni coloranti preparati al momento tripsina e vitalità diluiti, sono necessarie per garantire risultati riproducibili. Un altro limite di questo protocollo è che la finale M. sospensione leprae non è libero di DNA ospite, RNA, proteine, etc. Pertanto, altre fasi di purificazione devono essere aggiunti to ottenere una M. leprae sospensione priva di componenti della cellula ospite. Un metodo per il mantenimento bacilli vitali mediante congelamento esemplari interi tessuto di M. lesioni leprae è stata riportata 9. Tuttavia, lo studio da Portaels et al. dimostrato la significativa perdita di vitalità, che spaziano tra il 65-97% dopo il congelamento e lo scongelamento di M. leprae infettato campioni di tessuto ottenuti da armadillo 9. Il nostro protocollo ha dimostrato che l&#39;indice di vitalità osservato in M. sospensioni leprae dopo congelamento e scongelamento sceso rispetto alla aliquota che non era stato congelato (Tabella 1). Infatti, il congelamento M. sospensione leprae nei media congelamento prodotto redditività vanno dal 50-70%, con vitalità punteggio di 1 +, mentre la redditività punteggio di 0 + è stato ottenuto nella sospensione scongelato. Tuttavia, la moltiplicazione di M. leprae è stato soddisfacente dopo 7 mesi dopo l&#39;inoculazione di topi nudi ( <strong&gt; Tabella 1). L&#39;inoculazione di topi nudi con campioni ricostituiti mantenuto congelato per 60 giorni indotto in media 100 volte aumento del numero di bacilli rispetto al inoculo iniziale. Sembra che il congelamento del M. sospensione leprae nei media congelamento, invece di campioni di tessuto infetto, è più efficiente. Un punto critico del nostro protocollo è il lento congelamento del AFB in un contenitore di congelamento, occorre mantenere il bacilli vitali, come dimostrato da Colston e Hilson 8. Futuri esperimenti saranno condotti per valutare la fattibilità di bacilli dopo periodi di congelamento più lunghi. In sintesi, perché M. leprae non cresce in vitro, nostro protocollo permette un facile e veloce alternativa a manutenzione di inoculo vitale, e la fase di congelamento successo rende possibile il mantenimento di ceppi senza passaggio continuo di animali, permettendo così la creazione di una banca di ceppi definiti. Questa sezione contiene istruzioni per la preparazione di reagenti per eseguire questo protocollo. 1. Tripsina <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tripsina </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> fino a 100 ml </td></tr></tbody></table> Filtro sterilizzare. Conservare a -20 ° C. 2. 7H9 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 7H9 base di brodo </td><td> 4.7 g </td></tr><tr><td> 40% di glicerolo magazzino </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> fino a 900 ml </td></tr></tbody></table> Miscelare la base con acqua poi aggiungere il glicerolo agitando. Autoclave a 121 ° C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 ° C. 3. Brain Heart Infusion (BHI) <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> BHI </td><td> 37 g </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> fino a 1.000 ml </td></tr></tbody></table> Autoclave a 121 ° C per 15 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 ° C. 4. Siero fenolo 4.1) 5% fenolo <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fenolo </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> fino a 100 ml </td></tr></tbody></table> 4.2) fenolo Serum <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> siero fetale bovino </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 5% fenolo </td><td> 98 ml </td></tr></tbody></table> Conservare a 4 ° C. 5. Soluzioni per freddo Ziehl-Neelsen Stain 5.1) CarboFuchsin <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody&gt; <tr><td> Fuchsin </td><td> 1 g </td></tr><tr><td> Fenolo cristalli fusi a 60 ° C </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Alcole etilico puro </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> fino a 100 ml </td></tr></tbody></table> Filtrare prima di ogni utilizzo. 5.2) blu di metilene Base <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Blu di metilene </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> 95% di alcol etilico </td><td> fino a 200 ml </td></tr></tbody></table> 5.3) L&#39;acido alcol <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 70% di alcol </td><td> 990 ml </td></tr><tr><td> acido cloridrico </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> 6. Piano per il congelamento: <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OADC </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> 7H9 medio </td><td> fino a 100 ml </td></tr></tbody></table> Autoclave glicerolo prima dell&#39;uso e sterilizzare OADC per filtrazione. 7. Autoclavato M. sospensione leprae Autoclave a 121 ° C per 20 min. Conservare a -20 ° C.

La lebbra, una malattia causata dal Mycobacterium leprae, costituisce un importante problema di salute pubblica in molti paesi in tutto il mondo 1,2. Nonostante sia conosciuta come una malattia infettiva che colpisce la pelle e nervi periferici, ci sono ancora diverse lacune nelle conoscenze sui meccanismi coinvolti nel complesso immunopatogenesi della malattia. Tra le caratteristiche difficili di M. leprae che ostacolano il suo studio sono la sua incapacità di crescere in mezzi di coltura artificiale e il suo tempo relativamente lungo raddoppio (circa 14 giorni) 3,4. La maggior parte delle procedure sperimentali che utilizzano M. leprae sono istituiti con bacilli purificate da lesioni della pelle di malati di lebbra o da modelli sperimentali animali, come armadilli e diversi ceppi di topi 5,6. Per molti anni, i ricercatori hanno dipendeva purificazione del M. leprae da lesioni cutanee di LEPR multibacillarepazienti Osy per l&#39;uso in procedure sperimentali. Diverse condizioni di laboratorio per la coltivazione in vitro o la manutenzione di live M. leprae è stato tentato, ma fino ad oggi, modelli animali hanno dimostrato di essere più adatto per scopi di ricerca. Negli anni 1960 e 1970, i ricercatori hanno iniziato ad usare mouse e armadilli per la rilevazione e la valutazione di M. leprae vitalità, monitoraggio della crescita batterica in risposta anti-M. farmaci leprae, e nella crescita e mantenimento di ceppi micobatterici 2,4. I modelli animali hanno alcune limitazioni, soprattutto in armadilli e primati non umani, comprese le questioni etiche, costi di manutenzione, infrastrutture speciali per la manutenzione degli animali, e la scarsa riproducibilità dei risultati e rendimenti finali. Attualmente, i topi sono il preferito modello animale per la ricerca lebbra. Le condizioni di laboratorio per l&#39;utilizzo di topi sono facilmente disponibili, facile da eseguire, e permettono protocolli standardizzati <sup&gt; 7,8,9. Topi nudi sono stati utilizzati nella manutenzione di M. leprae ceppi perché, anche con carichi bassi bacillari vitali, la risposta immunitaria carente T-cellule porta alla formazione di granulomi esuberante e di buona moltiplicazione bacillare. Quindi, questo modello animale ha guadagnato un&#39;ampia accettazione all&#39;interno della comunità di ricerca lebbra. Nel presente rapporto, descriviamo un semplice protocollo per la purificazione enzimatica di bacilli da footpads nude topo, destinati alla preparazione di un M. sospensione leprae con detriti cellulari minimo e con alto indice di vitalità batterica. La vitalità è determinata mediante microscopia a fluorescenza, che può essere rapidamente eseguita in laboratorio. Abbiamo anche dimostrare una modifica al metodo standard per il conteggio bacillare dal freddo colorazione Ziehl-Neelsen e microscopia ottica. Inoltre, presentiamo un protocollo alternativo per la manutenzione e la conservazione di M. ceppi leprae, che consente di congelamento e scongelamento dei bacillare stocks.

<table><tbody><tr><td>BacLight Kit per la vitalità batterica</td><td>Invitrogen; Sonde molecolari</td><td>L7007</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Cryo 1 &deg; C Contenitore di congelamento</td><td>Nalgene</td><td>5100001</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen medio</td><td>LB Laborclin</td><td>901122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>TEK Nova Inc</td><td>S5812</td><td></td></tr><tr><td>Pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga 50 ml/base conica</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare&nbsp; - 40 &; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T-7409</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Brodo Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0178 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Gibco BRL</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Cervello infuso di cuore (BHI)</td><td>Oxoid LTDA</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin</td><td>Merck Millipore</td><td>1159370025</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15509037</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>Merck Millipore</td><td>EX02764</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>1131349010</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook OADC (acido oleico-albumina-destrosio-catalasi)</td><td>Becton Dickinson</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco; LifeTechnologies</td><td>26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolli ottimizzati per<em&gt; mycobacterium leprae</em&gt; strain management: congelata stock conservazione e manutenzione in topi nudi atimici

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

La lebbra, causata dal Mycobacterium leprae, è una malattia infettiva importante che è ancora endemica in molti paesi del mondo, tra cui il Brasile. Non ci sono metodi noti per la coltivazione di M. leprae in vitro, presentando un grave ostacolo nello studio di questo patogeno in laboratorio. Pertanto, il mantenimento e la crescita di M. ceppi leprae sono preferibilmente effettuati in topi nudi atimici (NU-Foxn1 nu). Le condizioni di laboratorio per l&#39;utilizzo di topi sono facilmente disponibili, facile da eseguire, e consentire la standardizzazione e lo sviluppo di protocolli per ottenere risultati riproducibili. Nel presente rapporto, descriviamo un semplice protocollo per la purificazione dei bacilli da piedini nudi del mouse utilizzando tripsina, che produce una sospensione di detriti minimo cellulare e con alto indice di vitalità batterica, come determinato dalla microscopia a fluorescenza. Una modifica al metodo standard per il conteggio bacillare da Ziehl-Neelsencolorazione e la microscopia ottica è inoltre dimostrato. Inoltre, si descrive un protocollo per congelamento e scongelamento stock bacillare come un protocollo alternativo per la manutenzione e la conservazione di M. ceppi leprae.

Il successo del protocollo può essere valutata in tre modi. In primo luogo, la valutazione della qualità dell&#39;inoculo è determinata dalla quantità di detriti cellulari e la percentuale risultante di bacilli vitali nella sospensione finale (Vedi protocollo 3). Come mostrato nelle figure 1 e 2, la sospensione bacillare finale conteneva pochissimo detriti cellulari e alta vitalità (punteggio 0 +); notare che la maggior parte dei bacilli colorati con il colorante fluorescente Syto 9 verde (macchia penetra 100% di entrambi i batteri vivi e morti, Figura 1) e solo pochi bacilli colorati con il colorante fluorescente PI rosso (macchia penetra solo i batteri con membrane danneggiate, Figura 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1.jpg" /> Figura 1. Syto 9 colorazione<html> M. leprae sospensione. Fluorescenza verde dimostra la presenza di vivi e morti M. leprae. 400X. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2.jpg" /> Figura 2. PI colorazione di M. leprae sospensione. Red fluorescenza che mostra il piccolo numero di morti M. leprae. 400X. In secondo luogo, un inoculo con alta vitalità influirà sulla moltiplicazione di bacilli nei piedini di animali dopo 4-5 mesi dopo l&#39;inoculazione, con sviluppo di evidente lesione macroscopica, come mostrato nel video (protocollo 1). Il terzo modo per valutare il successo del protocollo è quello di valutare la sopravvivenza e la moltiplicazione di AFB in piedini del mouse inoculati con bacilli che erano stati congelati per diversi periodi (vedi protocollo 4). &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Experiment (animale) </td><td> Numero di AFB / ml congelata al giorno 0 </td><td> Punteggio Viabilità / giorno 0 </td><td> Periodo di congelamento (giorni) </td><td> Numero di AFB inoculato dopo il congelamento </td><td> Punteggio di vitalità dopo il congelamento </td><td> Numero di AFB / ml recuperati dopo 7 mesi </td></tr><tr><td> 1 (1) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2,3 x 10 8 </td></tr><tr><td> 1 (2) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3.8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 1 (3) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8.5 x 10 7 </td></tr><tr><td> 1 (4) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td> &lt;td&gt; 1 + </td><td> 4,6 x 10 7 </td></tr><tr><td> 2 (1) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4,2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,7 x 10 7 </td></tr><tr><td> 2 (2) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4,2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 4,8 x 10 6 </td></tr><tr><td> 2 (3) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4,2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8,6 x 10 6 </td></tr><tr><td> 3 (1) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.2 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (2) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (3) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td&gt; 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (4) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2.6 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (5) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3,7 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Risultati di M. leprae moltiplicazione utilizzando sospensioni di post congelamento. Tabella 1 illustra i risultati di M. crescita leprae utilizzando sospensioni dopo il congelamento. Il punteggio vitalità delle sospensioni dopo lo scongelamento era 1 +. Il protocollo di congelamento è stato effettuato in tre esperimenti indipendenti per testare diversi periodi di congelamento. In entrambi gli esperimenti con inoculi congelato per 15 o 60 giorni, il risultato è stato simile, propagation dopo il congelamento prodotto 10-1,000 volte aumentano il numero di AFB recuperato da ciascun piedino dopo 7 mesi di inoculazione (Tabella 1). Pertanto, il congelamento di M. sospensioni leprae in 7H9 medio integrato con OADC (acido oleico-albumina-destrosio-catalasi) portato nella manutenzione della redditività. Tre inoculi sono stati utilizzati per valutare M. leprae moltiplicazione dopo due diversi periodi di congelamento (15 e 60 giorni). Dopo 7 mesi, bacilli sono stati recuperati dai polpastrelli di topi inoculati e contate dopo Ziehl-Neelsen. Semiquantitativa scala vitalità: 0 significa assenti fino al 30% di cellule colorate PI; 1 + significa che il 30-50% delle cellule colorate PI; 2 + significa sopra del 50% di cellule colorate PI. AFB: acido bacilli.

Mycobacterium leprae, l&#39;agente eziologico della lebbra, non cresce in vitro. Descriviamo un facile seguire protocollo per preparare una sospensione bacillare per assicurare il mantenimento di grandi quantità di M. leprae per una varietà di applicazioni. Protocolli per la propagazione tramite mouse zampa inoculazione, la valutazione della vitalità, il congelamento e lo scongelamento magazzino bacillare sono descritte in dettaglio.

Protocolli ottimizzati per<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: congelata Stock Conservazione e Manutenzione in topi nudi atimici

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Lo scopo di questo lavoro è mostrare come preparare una sospensione lipidica di micobatteri altamente vitale. Per iniettare in topi nudi. Preleveremo la vita batterica da un topo infetto, preferibilmente durante la fase iniziale dell'infezione.Per garantire rese di arie altamente vitali, eutanasia l'animale all'interno della cappa a sicurezza biologica. Trattenere la zampa posteriore con pinze emostatiche. Recidere le zampe con forbici e immergerle in Iodio al 2% per 20 minuti a scopo di decontaminazione, mantenendo la posizione del piede con la pianta rivolta verso l'alto.Raccogliere il tessuto molle. Utilizzando una lama di bisturi, rimuovere le ossa della prima e della quinta falange per facilitare l'omogeneizzazione del tessuto. Posizionare il tessuto in una piastra di Petri sterile. Raschiare via l'epidermide.Tagliare il tessuto granulomatoso in piccoli pezzi con le forbici e attendere il calcolo successivo del rendimento del programma del tessuto. Trasferire i pezzetti in una provetta contenente un ml di soluzione salina equilibrata di Hank. Aggiungere un ulteriore ml di Hank e omogeneizzare il tessuto tre volte per 15 secondi ciascuna volta alla velocità quattro.Posizionare un filtro cellulare in un tubo conico sterile da 50 ml. Pipettare la sospensione sul filtro e lasciare che la soluzione passi per gravità. Per eliminare i detriti, aggiungere altri due ml di Hank's alla sospensione e omogeneizzare nuovamente.Utilizzando lo stesso ciclo, far passare la sospensione attraverso questo setaccio. Ruotare il setaccio aggiungendo ciocche. Per portare il volume totale della sospensione a nove ml, aggiungere un ml di soluzione di tripsina al 0,5% alla sospensione per ottenere una concentrazione finale dello 0,05%.Miscelare capovolgendo delicatamente il tubo e incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, portare il volume della sospensione a quattro mL aggiungendo soluzione salina sterile, quindi centrifugare a 1700 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet battendo leggermente il tubo. Aggiungere un mL di soluzione salina sierosa e mescolare.Trasferire la sospensione in un nuovo tubo. Omogeneizzare la sospensione vascolare utilizzando una siringa da un ml per insulina con ago da 26 gauge mentre si trasferisce la sospensione in un nuovo tubo. Eseguire il controllo microbiologico della sospensione posizionando due gocce di mezzo 18, sette H nove infusione cerebrale cardiaca.Incubare 11 Stein Genesen a 37 gradi Celsius. Quindi seguire le procedure di controllo microbiologico di routine. Per la colorazione con codice Z.Preparare una diluizione da uno a dieci e una da uno a cento della sospensione S in soluzione salina. Omogeneizzare ogni diluizione prima di preparare questi vetrini per il conteggio; preparare tre vetrini tracciando tre cerchi di 10 millimetri di diametro interno sulla superficie di ciascun vetrino utilizzando un pennarello a inchiostro permanente.Ora delimitate i cerchi con una penna per immunohistochimica. Etichettate questi vetrini utilizzando una matita con punta numero due, preparando vetrini per le tre concentrazioni sieriche: non diluito, uno a dieci e uno a cento.Pipettare cinque microlitri di soluzione fenolica sierica e 10 microlitri di sospensione salivare in ogni cerchio, omogeneizzare e distribuire uniformemente la sospensione in tutta l'area del cerchio. Utilizzando l'impugnatura di un’ansa monouso, posizionare questi vetrini su un tavolo piano per farli asciugare dopo l'essiccazione. Fissarli passando i vetrini tre volte sopra la fiamma blu con le sospensioni batteriche rivolte verso l'alto.Eseguire un code Zuni di mantenimento. Esaminare questi vetrini. Le tre diluizioni.Scegliere la diluizione più appropriata per il conteggio delle cellule. Preparare 200 microlitri di sospensione di cellule uccise sottoponendo la sospensione vascolare ad autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius. Utilizzare il kit di vitalità batterica L 7 0 0 7 live dead a retroilluminazione fluorescente per la colorazione dei lipidi microbatterici.Preparare una diluizione 1:10 della soluzione A e una diluizione 1:20 della soluzione B appena prima dell'uso. Aggiungere a ciascuni 200 microlitri di sospensione vascolare originale non diluita e uccisa, 3,6 microlitri della soluzione A diluita e 6 microlitri della soluzione B diluita. Dopo 15 minuti di incubazione al buio, centrifugare la sospensione a 10.600 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante con la pipetta ricaricabile.Sospendere il pellet in 50 microlitri di glicerolo al 10%, omogeneizzare aspirando e dispensando con una pipetta. Applicare otto microlitri di ciascuna sospensione su un vetrino e coprire con un coprioggetto piccolo. Proteggere dalla luce.Osservare i sospensioni al microscopio a fluorescenza. Preparare una sospensione con una concentrazione da 10 a sette lip BA per ml, che corrisponde a un ml di mezzo di congelamento in ogni provetta criogenica. Quindi aggiungere 150 microlitri della sospensione S a un ml del mezzo di congelamento e omogeneizzare invertendo il tubo.Posizionare il vial criogenico all'interno del contenitore di congelamento. Mantenere il contenitore a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Trasferire i tubi in una scatola di stoccaggio e mantenerli a meno 80 gradi Celsius per la scongelazione.Scongelare la sospensione congelata in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione in un tubo conico contenente 20 mL di soluzione salina sterile. Centrifugare per concentrare.Le baline hanno seguito il protocollo Z per il conteggio e il protocollo di colorazione fluorescente per la determinazione della variabilità. Preparare una sospensione contenente da 10 a 8 BA per pasto, omogeneizzare la sospensione prima di inoculare ogni animale. Aspirare cento microlitri in una siringa per insulina e inoculare 30 microlitri nei cuscinetti plantari posteriori di ciascun animale per la determinazione della vitalità.La fluorescenza verde viene osservata in tutti i BAI, mentre la fluorescenza rossa solo in quel bai. Quando quei BAI sono controlli inerti, si osserva la stessa intensità di luce BAI verde e rossa. L'inoculazione di M Lepar congelato per periodi diversi porta a un aumento da 10 a 1000 volte del numero di BAI recuperati dopo sette mesi.Come osservazione finale, desideriamo aggiungere che, poiché IL leid non cresce in vitro, questo protocollo consente un metodo rapido e semplice per mantenere disponibili forme vitali di yl Leid per ulteriori utilizzi in laboratorio.

optimized-protocols-for-mycobacterium-leprae-strain-management-frozen

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per studiare la patogenesi Hc e fornire il modello migliore. Stiamo esplorando i potenziali benefici dell'immunità umorale contro questo fungo e ha generato anticorpi monoclonali diversi [di istone H2B e 60kDa Heat Shock Protein] che abbiamo testato per la loro efficacia protettiva dopo la somministrazione intraperitoneale.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Preparazione di un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune

Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino di uveite micobatterica innescata (PMU) per lo studio dell'uveite post-infettiva. Dopo l'induzione della PMU mediante iniezione intravitreale di Mycobacterium tuberculosis ucciso con il calore in un topo precedentemente immunizzato con lo stesso immunogeno, la progressione dell'infiammazione cronica nell'occhio viene analizzata mediante imaging ed esame...

Un modello murino di uveite micobatterica innescata per studiare l'uveite post-infettiva

Questo video mostra un test per il monitoraggio della migrazione delle cellule dendritiche a seguito di infezione del piede con Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG nei topi. In caso di infezione batterica, le cellule DC cutanee attivate vengono marcate con un colorante a base di carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) permeabile alle cellule. Dopo un intervallo adeguato per la migrazione delle DC al linfonodo popliteo drenante, le cellule linfonodali vengono...

Un test basato su CFSE per monitorare la migrazione delle cellule dendritiche cutanee verso i linfonodi drenanti nei topi infetti

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Qui sono descritti tre approcci sperimentali per studiare la dinamica dell'infezione da HIV nei topi umanizzati. Il primo consente lo studio di eventi di infezione cronica, mentre i due ultimi consentono lo studio di eventi acuti dopo l'infezione primaria o la riattivazione virale.

Infezione da HIV cronica, acuta e riattivata in modelli di topo immunodeficienti umanizzati

Questo protocollo delinea i passaggi per indurre l'uveite micobatterica innescata (PMU) nei topi. Questo metodo delinea i passaggi per aiutare a produrre un'infiammazione oculare affidabile e robusta nel sistema modello murino. Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato occhi uveitici e occhi non infiammati da singoli animali per ulteriori valutazioni con saggi immunologici, trascrittomici e proteomici.

Uveite micobatterica innescata (PMU) come modello per l'uveite post-infettiva

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

I topi sono generalmente resistenti alle infezioni da Mycobacterium abscessus, il che complica la scoperta e lo sviluppo di antibiotici tanto necessari contro le infezioni polmonari. Qui, descriviamo un metodo di preparazione dell'inoculo e dell'infezione intratracheale che ha dimostrato di fornire un'infezione prolungata nei topi immunocompetenti.

Preparazione di Mycobacterium abscessus incluso nella perla di agar per inoculare topi immunocompetenti per via intratracheale

Impara a preparare sospensioni vitali di Mycobacterium leprae per la ricerca sulla lebbra. Questo protocollo dettaglia l'omogeneizzazione, la valutazione della vitalità e la conservazione criogenica del batterio.

Protocolli ottimizzati per Mycobacterium leprae Strain Management: congelata Stock Conservazione e Manutenzione in topi nudi atimici (Video) | JoVE Journal

Protocolli ottimizzati per

Esplora altri video