Protocolli ottimizzati per

Lo scopo di questo lavoro è mostrare come preparare una sospensione lipidica di micobatteri altamente vitale. Per iniettare in topi nudi. Preleveremo la vita batterica da un topo infetto, preferibilmente durante la fase iniziale dell'infezione.

Per garantire rese di arie altamente vitali, eutanasia l'animale all'interno della cappa a sicurezza biologica. Trattenere la zampa posteriore con pinze emostatiche. Recidere le zampe con forbici e immergerle in Iodio al 2% per 20 minuti a scopo di decontaminazione, mantenendo la posizione del piede con la pianta rivolta verso l'alto.

Raccogliere il tessuto molle. Utilizzando una lama di bisturi, rimuovere le ossa della prima e della quinta falange per facilitare l'omogeneizzazione del tessuto. Posizionare il tessuto in una piastra di Petri sterile. Raschiare via l'epidermide.

Tagliare il tessuto granulomatoso in piccoli pezzi con le forbici e attendere il calcolo successivo del rendimento del programma del tessuto. Trasferire i pezzetti in una provetta contenente un ml di soluzione salina equilibrata di Hank. Aggiungere un ulteriore ml di Hank e omogeneizzare il tessuto tre volte per 15 secondi ciascuna volta alla velocità quattro.

Posizionare un filtro cellulare in un tubo conico sterile da 50 ml. Pipettare la sospensione sul filtro e lasciare che la soluzione passi per gravità. Per eliminare i detriti, aggiungere altri due ml di Hank's alla sospensione e omogeneizzare nuovamente.

Utilizzando lo stesso ciclo, far passare la sospensione attraverso questo setaccio. Ruotare il setaccio aggiungendo ciocche. Per portare il volume totale della sospensione a nove ml, aggiungere un ml di soluzione di tripsina al 0,5% alla sospensione per ottenere una concentrazione finale dello 0,05%.

Miscelare capovolgendo delicatamente il tubo e incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, portare il volume della sospensione a quattro mL aggiungendo soluzione salina sterile, quindi centrifugare a 1700 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet battendo leggermente il tubo. Aggiungere un mL di soluzione salina sierosa e mescolare.

Trasferire la sospensione in un nuovo tubo. Omogeneizzare la sospensione vascolare utilizzando una siringa da un ml per insulina con ago da 26 gauge mentre si trasferisce la sospensione in un nuovo tubo. Eseguire il controllo microbiologico della sospensione posizionando due gocce di mezzo 18, sette H nove infusione cerebrale cardiaca.

Incubare 11 Stein Genesen a 37 gradi Celsius. Quindi seguire le procedure di controllo microbiologico di routine. Per la colorazione con codice Z.

Preparare una diluizione da uno a dieci e una da uno a cento della sospensione S in soluzione salina. Omogeneizzare ogni diluizione prima di preparare questi vetrini per il conteggio; preparare tre vetrini tracciando tre cerchi di 10 millimetri di diametro interno sulla superficie di ciascun vetrino utilizzando un pennarello a inchiostro permanente.

Ora delimitate i cerchi con una penna per immunohistochimica. Etichettate questi vetrini utilizzando una matita con punta numero due, preparando vetrini per le tre concentrazioni sieriche: non diluito, uno a dieci e uno a cento.

Pipettare cinque microlitri di soluzione fenolica sierica e 10 microlitri di sospensione salivare in ogni cerchio, omogeneizzare e distribuire uniformemente la sospensione in tutta l'area del cerchio. Utilizzando l'impugnatura di un’ansa monouso, posizionare questi vetrini su un tavolo piano per farli asciugare dopo l'essiccazione. Fissarli passando i vetrini tre volte sopra la fiamma blu con le sospensioni batteriche rivolte verso l'alto.

Eseguire un code Zuni di mantenimento. Esaminare questi vetrini. Le tre diluizioni.

Scegliere la diluizione più appropriata per il conteggio delle cellule. Preparare 200 microlitri di sospensione di cellule uccise sottoponendo la sospensione vascolare ad autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius. Utilizzare il kit di vitalità batterica L 7 0 0 7 live dead a retroilluminazione fluorescente per la colorazione dei lipidi microbatterici.

Preparare una diluizione 1:10 della soluzione A e una diluizione 1:20 della soluzione B appena prima dell'uso. Aggiungere a ciascuni 200 microlitri di sospensione vascolare originale non diluita e uccisa, 3,6 microlitri della soluzione A diluita e 6 microlitri della soluzione B diluita. Dopo 15 minuti di incubazione al buio, centrifugare la sospensione a 10.600 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante con la pipetta ricaricabile.

Sospendere il pellet in 50 microlitri di glicerolo al 10%, omogeneizzare aspirando e dispensando con una pipetta. Applicare otto microlitri di ciascuna sospensione su un vetrino e coprire con un coprioggetto piccolo. Proteggere dalla luce.

Osservare i sospensioni al microscopio a fluorescenza. Preparare una sospensione con una concentrazione da 10 a sette lip BA per ml, che corrisponde a un ml di mezzo di congelamento in ogni provetta criogenica. Quindi aggiungere 150 microlitri della sospensione S a un ml del mezzo di congelamento e omogeneizzare invertendo il tubo.

Posizionare il vial criogenico all'interno del contenitore di congelamento. Mantenere il contenitore a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Trasferire i tubi in una scatola di stoccaggio e mantenerli a meno 80 gradi Celsius per la scongelazione.

Scongelare la sospensione congelata in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione in un tubo conico contenente 20 mL di soluzione salina sterile. Centrifugare per concentrare.

Le baline hanno seguito il protocollo Z per il conteggio e il protocollo di colorazione fluorescente per la determinazione della variabilità. Preparare una sospensione contenente da 10 a 8 BA per pasto, omogeneizzare la sospensione prima di inoculare ogni animale. Aspirare cento microlitri in una siringa per insulina e inoculare 30 microlitri nei cuscinetti plantari posteriori di ciascun animale per la determinazione della vitalità.

La fluorescenza verde viene osservata in tutti i BAI, mentre la fluorescenza rossa solo in quel bai. Quando quei BAI sono controlli inerti, si osserva la stessa intensità di luce BAI verde e rossa. L'inoculazione di M Lepar congelato per periodi diversi porta a un aumento da 10 a 1000 volte del numero di BAI recuperati dopo sette mesi.

Come osservazione finale, desideriamo aggiungere che, poiché IL leid non cresce in vitro, questo protocollo consente un metodo rapido e semplice per mantenere disponibili forme vitali di yl Leid per ulteriori utilizzi in laboratorio.