Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è acquisire immagini in time-lapse del comportamento delle cellule gliali dopo una lesione del nervo periferico in larve di zebrafish vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto montando larve di zebrafish anestetizzate in agarosio a basso punto di fusione su piastre di Petri con fondo in vetro, posizionandole con un ago da dissezione. Successivamente, le larve montate vengono posizionate sul microscopio confocale.

Viene selezionato un nervo da ablare ed è acquisita un'immagine degli assoni e delle cellule gliali del nervo non lesionato. Successivamente, vengono selezionate delle aree di interesse (ROI) lungo il nervo ed è attivato il laser per ablare le zone selezionate, creando una sezione del nervo. Infine, gli assoni e le cellule gliali vengono ripresi con imaging a intervalli di tempo successivamente alla sezione del nervo.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il comportamento dinamico delle cellule gliali durante la degenerazione e la rigenerazione del nervo, mediante microscopia confocale a intervalli di tempo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della rigenerazione e della biologia delle cellule gliali, come ad esempio: in che modo le cellule gliali rispondono al danno nervoso? E come fanno i diversi sottotipi di cellule gliali a coordinare il proprio comportamento durante i processi di degenerazione e rigenerazione?

Dopo aver incrociato zebrafish adulti contenenti transgeni che marcano in modo fluorescente i neuroni motori e i tipi cellulari gliali di interesse, e aver incubato gli embrioni fino a 24 ore post-fecondazione o HPF, rimuovere l'acqua delle uova e sostituirla con acqua delle uova contenente un pH tooth threa o PTU, quindi reinserire gli embrioni nell'incubatore. A partire da questo momento fino a circa 96 HPF, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per selezionare gli embrioni in cui è presente il gene fluorescente desiderato. Trasferire gli embrioni positivi in acqua delle uova fresca con PTU e reinserirli nell'incubatore.

Quando le larve raggiungono i sei giorni post-fecondazione (DPF), selezionare alcuni embrioni per il montaggio e trasferirli in una piastra più piccola. Rimuovere l'acqua dalla piastra e sostituirla immediatamente con acqua di uova PTU contenente lo 0,02% di trica; incubare le larve nell'anestetico per circa cinque minuti. Collocare un Eloqua di agarosio a basso punto di fusione all'0,8%, precedentemente preparato secondo il protocollo descritto nel testo, in un becher con acqua del rubinetto e riscaldare al microonde.

Per 30 secondi o fino a quando l'agarosio è fuso, lasciare raffreddare il becher finché il tubo di agarosio risulti tiepido al tatto. Successivamente, trasferire una larva anestetizzata in una piastra di vetro da 35 millimetri con fondo in vetro. Rimuovere tutta l'acqua presente nella piastra.

Poi coprire immediatamente le larve con una quantità sufficiente di aros caldo da riempire la parte del piatto con fondo in vetro. Mentre l'agros si solidifica, utilizzare un ago da dissezione per posizionare le larve di lato. Successivamente, inclinarle leggermente sulla schiena, assicurandosi che le larve montate siano a contatto con il vetro sul fondo del piatto, condizione necessaria per provocare lesioni ed effettuare le immagini.

Usare l'ago per mantenere i larvi in posizione finché l'agar non si solidifica e i larvi non sono immobilizzati. Successivamente, pipettare lentamente una quantità sufficiente di acqua trica nella piastra in modo da coprire completamente l'agar e i larvi. Accendere tutti gli strumenti del microscopio confocale, i laser a diodo appropriati per eccitare i transgeni del pesce zebra e il laser a colorante pompato a azoto.

Assicurarsi che il divisore del fascio vuoto sia al suo posto e che la cella di colorante da 435 nanometri sia posizionata correttamente. Aprire completamente l'attenuatore del laser, quindi avviare il software di acquisizione immagini con l'obiettivo ad immersione in acqua 63 x 1,2 na e una lamella di vetro con un lato riflettente. Utilizzare l'illuminazione in campo chiaro per individuare e mettere a fuoco un graffio o un'incisione sullo specchio.

Utilizzando un software di imaging, visualizzare e mettere a fuoco le incisioni sullo schermo del computer dalla finestra che controlla la calibrazione del laser e le impostazioni di potenza. Impostare il numero di impulsi su uno e l'attenuazione al 3% di trasmissione dalla barra degli strumenti principale. Selezionare lo strumento ellisse e fare clic sull'immagine sullo schermo del computer.

Per creare una singola ROI circolare, ripetere il processo altre tre volte fino a ottenere quattro ROI circolari disposte casualmente sull'immagine. Successivamente, attivare il laser. Se il laser funziona correttamente ed è stato calibrato in modo adeguato, verranno create quattro piccole incisioni puntiformi, una all'interno di ciascuna ROI circolare. Rimuovere quindi il vetrino dalla piastra del microscopio e pulire l'obiettivo.

Sostituire il divisore del fascio vuoto con il divisore del fascio al 100% ILL per sezionare un nervo motorio mediante ablazione laser. Applicare una piccola goccia di mezzo ad immersione in acqua all'obiettivo e posizionare la piastra con la larva montata sulla relativa fase utilizzando clip per stabilizzarla, servendosi dell'oculare e dell'illuminazione a campo chiaro. Mettere a fuoco le larve e localizzare i neuroni motori.

Scansionare i nervi negli emisegmenti da 10 a 20 e selezionare un nervo motorio per la sezione trasversale. Successivamente, visualizzare un'immagine in tempo reale del nervo sullo schermo del computer. Selezionare i piani Z e acquisire un'immagine degli assoni e delle cellule gliali del nervo non lesionato.

Quindi preparare le impostazioni per l'acquisizione di immagini in time-lapse per catturare proiezioni Z di tutti i tipi cellulari a intervalli di cinque-trenta minuti. A seconda dell'esperimento, rimuovere il divisore del fascio al 100%ILL e sostituirlo con quello neutro. Tornare alla vista in tempo reale del nervo e utilizzare il canale fluorescente appropriato per visualizzare gli assoni che verranno sezionati.

Utilizzando lo strumento ellisse, creare una ROI ellittica sottile nell'area da ablare. Quindi creare ROI più piccole all'interno della regione selezionata nella finestra che controlla le impostazioni del laser. Impostare il numero di impulsi a due e la piastra di attenuazione al 18% di trasmissione.

Quindi attivare il laser all'interno delle ROI selezionate. Attendere 10 secondi o più e verificare nuovamente la fluorescenza nell'area ablata. Tenere presente che una ROI potrebbe inizialmente apparire ablata quando in realtà è solo fotoblecata e potrebbe essere necessario modificare leggermente le ROI nel corso dell'ablazione per ottenere una sezione completa.

Se la fluorescenza ritorna, aumentare la potenza del laser e attivare il laser. Ripetere nuovamente questo procedimento finché la fluorescenza non scompare all'interno dell'area di interesse (R OIS) e non ricompare entro 10 secondi. Al termine dell'ablazione, iniziare l'acquisizione di immagini in time-lapse non appena il time-lapse è completato.

Utilizzare un software di imaging per raccogliere i dati e creare proiezioni Z composite a colori per ciascun punto temporale. Creare un filmato accelerato per analizzare contemporaneamente il comportamento degli assoni e delle cellule gliali. Il saggio qui descritto può essere impiegato per valutare la risposta delle cellule gliali e di altre popolazioni cellulari associate ai nervi al danno assonale in vivo.

Qui è mostrato un esempio di lesione nervosa creata mediante questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. L'esperimento è stato eseguito in sei zebrafish transgenici DPF che esprimevano EGFP mirato alla membrana nelle ggl perineurali e DS red citosolico nei neuroni motori. La lesione è stata effettuata lungo la proiezione rostrale di un nervo motorio del tronco, che è stato successivamente ripreso con imaging a intervalli di tempo sia nei canali EGFP che DS red.

Questo ha permesso la visualizzazione simultanea dei comportamenti degli assoni e delle cellule gliali immediatamente dopo la lesione. Queste immagini sono punti temporali statici estratti dal filmato in time-lapse. L'ellisse tratteggiata mostra l'area di interesse (ROI) che è stata ablata utilizzando il laser dopo un minuto.

Dopo la sezione o il tempo post-sezione (MPT), l'area ablata non presentava fluorescenza e la zona di lesione misurava circa 3,5 micrometri dal moncone prossimale a quello distale. Il successo della sezione può essere confermato mediante l'osservazione del moncone nervoso distale e la ricerca di segni di degenerazione walleriana, tra cui la frammentazione dell'assone distale e la rapida eliminazione. L'assenza di fluorescenza assonica lungo il moncone distale a 120 MPT indica che questi assoni hanno effettivamente subito una degenerazione walleriana e che la sezione è stata eseguita con successo.

Regolare la potenza del laser su un valore ideale è fondamentale durante esperimenti di ablazione laser. Impostazioni ideali della potenza del laser ablateranno in modo netto il nervo solo all'interno dell'area di interesse selezionata (ROI), mentre potenze troppo basse o troppo elevate produrranno risultati subottimali; qui è mostrato un danno causato da una potenza laser troppo bassa. La fluorescenza è rimasta all'interno dell'area di interesse dopo lo scatto del laser, causando una sezione incompleta.

D'altro canto, come dimostrato in questa figura, una potenza laser troppo elevata ha prodotto un'ablazione estremamente ampia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come montare i pesci zebra per esperimenti di transezione laser. Crea una transezione utilizzando un laser a colorante pompato a azoto e valuta la risposta delle cellule circostanti mediante imaging confocale a intervalli di tempo.