Name: Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri il comportamento dinamico delle cellule gliali dopo lesione del nervo periferico in larve di zebrafish trasparenti. Questo metodo di imaging time-lapse aiuta a comprendere i meccanismi cellulari della rigenerazione nervosa in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare il Lab Kucenas per preziosi discussioni e Quorum Technologies, Inc. per il superbo supporto tecnico. Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo UVa per l&#39;eccellenza nella scienza e la tecnologia (FEST) (SK).

1. Preparazione e montaggio di embrioni di zebrafish per l&#39;ablazione e vivo Imaging <ol><li> Preparare uno stock di 0,8% basso punto di fusione agarosio in acqua uovo. Aliquota in 13X 100 millimetri tubi cultura usa e getta e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Croce zebrafish adulto contenenti transgeni integrati stabilmente per etichettare fluorescenti i neuroni motori e tipi di cellule gliali di interesse. Raccogliere embrioni di zebrafish in acqua uovo e mettere in 28,5 ° C incubatore per la corretta messa in scena più tardi 3. </li><li> A circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), rimuovere l&#39;acqua uovo e aggiungere 0,002% 1-fenil 2-tiourea (PTU) in acqua uovo. Embrioni Rientro in incubatrice. </li><li> Tra 24 e 96 HPF, embrioni devono essere sottoposti a screening per la presenza di transgeni desiderati su un fluorescente ambito dissezione. Mettere gli embrioni selezionati in acqua dolce PTU uovo e tornare alla incubatrice. </li><li> Quando le larve hanno raggiunto i 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) (o l&#39;età desiderata), rimuoverli dalla incubatrice, Selezionare un paio di larve per il montaggio, e trasferirli in un piatto più piccolo. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua dal piatto e sostituire immediatamente con circa il 0,02% Tricane in acqua uovo PTU. Permettere alle larve di sedersi in anestesia circa 5 min. </li><li> Trasferire un&#39;aliquota del 0,8% a bassa fusione agarosio in un bicchiere con acqua di rubinetto e forno a microonde per 30 secondi, o fino a quando l&#39;agarosio si è sciolto. Lasciare che il bicchiere si raffreddi fino a quando l&#39;agarosio nel tubo cultura sente tiepido al tatto (non bollente). </li><li> Selezionare una larva anestetizzato e trasferirlo da 35 mm piatto fondo singolo o multi-bene vetro. Rimuovere l&#39;acqua che si è trasferito con la larva, quindi coprire immediatamente la larva con abbastanza caldo agarosio per riempire la porzione di fondo di vetro del piatto, ma non creare una grande cupola. </li><li> Come l&#39;agarosio indurisce, utilizzare un ago da dissezione per posizionare la larva sul lato in basso del piatto, quindi inclinare la larva solo leggermente sul dorso. E &#39;imperativo per lesioni e successive di imaging, chela larva essere montato contatto con la lastra sul fondo del piatto. Utilizzare l&#39;ago di dissezione per mantenere la larva in questa posizione fino a quando l&#39;agarosio si è solidificato e la larva è immobilizzato. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio è completamente indurito, pipettare lentamente acqua Tricane abbastanza (questo può essere la stessa Tricane utilizzato per anestesia) nella capsula per coprire completamente l&#39;agarosio e larva. </li></ol> 2. Calibrazione laser e test <ol><li> Accendere tutte le strumentazioni microscopio confocale, adeguati laser a diodi per emozionanti transgeni zebrafish, e l&#39;azoto pompato laser a colorante. Assicurarsi che il fascio di &quot;vuoto&quot; splitter è a posto, il laser attenuatore è completamente aperta, e la cella di colorante 435 nm cumarina è a posto. Sul computer, aprire il software di imaging. </li><li> Spostare un obiettivo ad immersione in acqua 1.2NA 63x in posizione e applicare una piccola goccia di mezzo di immersione per gli obiettivi di acqua sulla oggettiva. Un obiettivo 63x consentirà una buona precisione ablazione laser, e acqua immersion consente una maggiore distanza di lavoro, che è necessaria quando si lavora con 6-7 dpf zebrafish larve. </li><li> Ottenere un vetrino con un lato specchiato utilizzare per la calibrazione del laser. Posizionare la diapositiva, lato specchio verso il basso, sul palco microscopio. </li><li> Usando l&#39;oculare sotto illuminazione campo chiaro, trovare e concentrarsi su un graffio o etch nello specchio. La luce brightfield sarà splendente verso il basso sulla lastra di vetro, ma passa solo attraverso l&#39;obiettivo in luoghi dove lo specchio è stato graffiate o incise via, causando lo specchio per guardare nero attraverso l&#39;oculare, e le incisioni a guardare come macchie o linee di luce. </li><li> Visualizza e fuoco le incisioni sullo schermo del computer utilizzando un software di imaging. Aprire la finestra che controlla la calibrazione laser e impostazioni di alimentazione. Impostare il numero di impulsi da &quot;1&quot; e la piastra di attenuazione di trasmissione &quot;3&quot;%. Il numero di impulsi rappresenta il numero di volte che il laser si azionerà all&#39;interno di ciascuna regione di interesse (ROI) e la trasmissione% rappresenta la potenza del laser. Assicurarsi che l&#39;impostazione di calibrazione corretto sia selezionato per l&#39;obiettivo ad immersione dell&#39;acqua 1.2NA 63x. </li><li> Selezionate lo strumento Ellisse dalla barra degli strumenti principale, e clicca l&#39;immagine sullo schermo del computer per creare un unico ROI circolare. Fate questo altre 3 volte fino a quando ci sono 4 ROI circolare distanziati in modo casuale sopra l&#39;immagine. </li><li> Alcuni sistemi possono includere una funzione di sicurezza che non permetterà il laser al fuoco se il percorso della luce per gli oculari è aperto. Se questo è il caso, chiudere manualmente il percorso ottico verso gli oculari in questo momento. </li><li> Sparare il laser. Questo creerà 4 piccole incisioni spot, uno all&#39;interno di ogni ROI circolare. Se il laser non si accende, controllare per essere sicuri che il laser sia acceso e collegato correttamente, e che il percorso della luce per gli oculari è chiuso. Se si aziona il laser, ma senza incisione è visto, controllare per essere sicuri che il &quot;vuoto&quot; beam splitter è a posto. Se tutto è a posto, aumentare la potenza del laser e &quot;FRAP&quot; fino a quando il acqueforti are visibile. Se un&#39;impostazione maggiore di 10 potenza del laser è necessaria per incidere il vetro, questo può indicare la cartuccia plasma laser deve essere sostituita. </li><li> Se le macchie incise appaiono centrati all&#39;interno della ROI selezionata, non è necessaria alcuna calibrazione (procedere a 2.12). Se le macchie non sono centrate, l&#39;impostazione di calibrazione deve essere aggiornato. </li><li> Per calibrare, fare clic sull&#39;aggiornamento l&#39;impostazione di calibrazione. Il laser scatta e l&#39;immagine apparirà contenente un singolo punto acidato. Se il punto non appare, annullare la calibrazione, aumentare la potenza del laser, e riavviare la calibrazione. </li><li> Fare clic al centro della macchia. Il laser sparare di nuovo, e apparirà un altro punto. Fare clic su quel punto, e ripetere questo processo fino a quando la calibrazione è completa e 9 punti di apparire in modo griglia. Ripetere i passaggi 2,6-2,9 per verificare che la calibrazione è stata eseguita correttamente. </li><li> Rimuovere il vetrino dal palco microscopio e pulire l&#39;obiettivo. Aprire il percorso ottico verso il OCULars, e sostituire il &quot;vuoto&quot; divisore di fascio con il &quot;100% ILL&quot; divisore di fascio. </li></ol> 3. Resezione del nervo Utilizzando ablazione laser e time-lapse imaging confocale di comportamenti delle cellule gliali <ol><li> Rimuovere il palco utilizzato per contenere il vetrino e sostituire con un palcoscenico adatto per lo svolgimento di 35 millimetri di vetro piatti di fondo. Continuare a utilizzare l&#39;obiettivo ad immersione dell&#39;acqua 1.2NA 63x. </li><li> Applicare una piccola goccia d&#39;acqua mezzo di immersione con l&#39;obiettivo, e posizionare il piatto con larva montato sul palco. Stabilizzare il piatto con clip. </li><li> Usando l&#39;oculare e l&#39;illuminazione widefield, si concentrano la larva e localizzare i nervi motori. Scansione i nervi hemisegments 10-20 e selezionare un nervo motore per la resezione. </li><li> Portare un live-view del nervo sullo schermo del computer utilizzando un software di imaging. Selezionare Z-aerei e di acquisire una immagine degli assoni e cellule gliali del nervo illeso. </li><li> Preparare le impostazioni di time-lapse imaging nel software di imaging di catturareZ-proiezioni di tutti i tipi cellulari in intervalli di 5-30 min, a seconda dell&#39;esperimento. E &#39;meglio per creare tutte le impostazioni necessarie per il time-lapse prima di eseguire l&#39;ablazione, per cui non vi è alcun ritardo nella partenza del time-lapse una volta che il danno è completo. </li><li> Togliere il &quot;100% ILL&quot; divisore di fascio e sostituire con il &quot;vuoto&quot;. Chiudere il percorso della luce per gli oculari. </li><li> Tornare al live-view del nervo. Utilizzare il canale fluorescente appropriato per visualizzare gli assoni che sarà attraversata. </li><li> Utilizzando lo strumento ellisse, creare una ROI ellittica sottile nella zona da asportare, quindi creare ROIs piccola all&#39;interno della regione selezionata. </li><li> Nella finestra che controlla le impostazioni laser, impostare il numero di impulsi da &quot;2&quot; e la piastra di attenuazione di trasmissione &quot;18&quot;%. Sparare il laser all&#39;interno della ROI selezionata. Se resti fluorescenza all&#39;interno del ROI, aumentare la potenza del laser, attendere circa 10 secondi, e sparare di nuovo il laser. Fate questo fino a raggiungere una posizione che provoca FLUORESCENTEce a scomparire all&#39;interno della ROI. </li><li> Attendere 10 secondi o più e controllare l&#39;area ablated ancora per fluorescenza. Attenzione che un ROI può apparire inizialmente ablated, quando in realtà è fotodecolorate. Se ritorna fluorescenza, aumentare la potenza del laser e sparare di nuovo il laser. Ripetere questa operazione fino fluorescenza scompare all&#39;interno del ROI e non restituisce entro 10 sec. E &#39;meglio cominciare con un laser di potenza minore e aumentare la potenza necessaria. La potenza del laser necessaria può variare a seconda dei sistemi individuali di microscopia, l&#39;età di colorante cumarina, montaggio del campione, l&#39;età delle larve, e lo spessore del tessuto. Una volta che è stata stabilita una potenza laser ideale, questa impostazione di alimentazione può essere riutilizzato nelle successive nervi lo stesso esperimento. </li><li> Una volta che l&#39;ablazione è completato, inizierà time-lapse imaging. </li><li> Quando il time-lapse è completo, utilizzare il software di imaging per compilare i dati e creare il colore composito Z-proiezioni per ogni punto di tempo. Creare un filmato QuickTime per analizzare il comportamentodi assoni e cellule gliali simultaneamente. </li></ol>

<ol><li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%3A+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li>
<li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129(2009).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li>
<li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+injury%2C+axonal+degeneration+and+neural+regeneration%3A+basic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li>
<li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19(2012).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog%2C+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche di questo disegno sperimentale sono: 1) correttamente larve montaggio per lesioni e successive imaging in vivo e 2) calibrare il laser e selezionando le impostazioni di alimentazione corrette per poter creare una transezione del nervo pulita che provoca danni extra-tessuto minimal . Per contribuire a garantire un assotomia successo per l&#39;imaging in vivo e successiva analisi, montare larve multiplo in entrambi i singoli piatti con fondo di vetro o in un piatto fondo di vetro con...

Zebrafish sono stati ampiamente utilizzati per studiare sviluppo del sistema nervoso a causa della loro trasparenza ottica e facilità di transgenesi, che, se accoppiato, permettere spettacolare imaging comportamenti delle cellule dinamiche in un embrione vivente. Inoltre, poiché zebrafish e mammiferi condividono quasi tutti i geni necessari per la formazione del sistema nervoso, informazione cellulare e molecolare raccolte in questo organismo modello è direttamente riferibile ad altre specie di vertebrati. Anche se incredibilmente potente per gli studi sullo sviluppo neurale, il pesce zebra ed i suoi attributi unici hanno il potenziale per chiarire anche i meccanismi che mantengono e ricostruire il sistema nervoso dopo l&#39;infortunio. Zebrafish larve di mantenere la loro traslucenza in stadio avanzato larvali e la pigmentazione può essere efficacemente bloccato sia con l&#39;uso di inibitori farmacologici della produzione di melanina o mutanti genetici che mancano di cellule del pigmento. Così, con questo organismo modello per studiare lesioni e Rigeneranteione negli animali più vecchi è possibile e offre l&#39;opportunità unica di studiare direttamente i meccanismi cellulari e molecolari che ricostruire il sistema nervoso. In questo manoscritto, si descrive come ferire in modo efficiente e riproducibile nervi delle PNS di larve di zebrafish. Questo paradigma lesioni si presta a studiare non solo degenerazione, ma anche le risposte di cellule gliali periferico e cellule immunitarie nonché le interazioni tra queste popolazioni durante la rigenerazione. SNP è una rete complessa di nervi motori e sensori che è necessario per passare informazioni tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la cute, organi e muscoli del corpo, permettendo un organismo di interagire con l&#39;ambiente e sopravvivere. Lungo questi nervi, glia periferica, comprese le cellule mielinizzanti e non mielinizzanti Schwann e glia perineurale, così come tessuto connettivo, racchiudono gli assoni e infine formare il nervo maturo. Infortunio di questi nervi avvia un processo di Known come walleriana degenerazione 10. Questo meccanismo di frammentazione assonale, reclutamento immunitario, la clearance detriti e la rigenerazione è molto stereotipata e geneticamente regolato 1. Studi precedenti in sistemi di mammifero hanno descritto i ruoli delle cellule di Schwann durante degenerazione del nervo e rigenerazione 1, 2, 6, 8. In questi studi di tessuto fisso o coltura cellulare, cellule di Schwann reclutati non solo macrofagi al sito di lesione per aiutare nella liquidazione detriti, ma anche aiutati in mielina stessi fagocitosi. Anche se questi studi sono stati incredibilmente informativo, non abbiamo mai visualizzate risposte gliali a danno degli assoni periferici in vivo, in tempo reale, e non altri studi hanno indagato il rapporto tra le diverse classi di cellule gliali periferico durante questi eventi. Recentemente, molti laboratori hanno indagato degenerazione Walleriana utilizzando zebrafish e lesioni assone laser-mediata simile a quello che abbiamo descritto qui <sup&gt; 4, 5, 7, 9. In alcuni di questi studi, gli assoni sensoriali superficiali sono stati axotomized in giovani larve con un costruito su misura, a due fotoni microscopio confocale 4, 5, 9. In un altro studio, che è molto simile al nostro, assoni più profondi all&#39;interno del nervo motore ventrale sono stati tagliati di 5 giorni vecchio larve utilizzando un sistema di ablazione laser disponibili in commercio 7. In entrambi questi nelle configurazioni, l&#39;attenzione si è concentrata sulla degenerazione Walleriana ed entrambi gli assoni e cellule immunitarie sono stati ripresi. Per approfondire questi studi, si descrive ferendo assoni motori in larve anziani con più maturi, nervi mieliniche e analisi della risposta di tutti glia nervo periferico associata durante la degenerazione e rigenerazione. Per fare questo, abbiamo transetto nervi motori a 6 e 7 giorni dopo la fecondazione (DPF) larve e visualizzare le risposte delle singole popolazioni gliali e indagare le interazioni tra queste popolazioni lungo gli assoni danneggiati. Utilizzando doppie e triple TRALinee nsgenic che etichetta glia periferico, comprese le cellule di Schwann e glia perineurale, così come un marcatore per assoni, si usa un sistema di ablazione laser disponibile in commercio costituito da un azoto-pompato dye laser (lunghezza d&#39;onda 435 nm) collegata ad un sistema confocale disco rotante per creare assoni transections. Questo set-up sperimentale ci permette di visualizzare in diretta, zebrafish larvale, ferire specifici tratti di assoni motori periferici e di immagine al rallentatore le risposte delle popolazioni gliali distinte al danno assonale e la loro relazione l&#39;uno all&#39;altro. Questo protocollo può essere ulteriormente adattato per creare lesioni nervose in zebrafish di età diverse, con diverse linee transgeniche o mutanti genetici per affrontare diverse questioni scientifiche.

<table><tbody><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-100G</td><td></td></tr><tr><td>Finquel Tricaina Metansolfonato MS-222</td><td>Argent Chemical</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sigma</td><td>A9414-10G</td><td></td></tr><tr><td>Quad CELLview Piastre per colture cellulari, fondo di vetro, sterile, Greiner Bio One</td><td>VWR/Greiner</td><td>89125-444</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri con fondo in vetro a pozzetto singolo 35 x 10 mm, spessore 12 mm</td><td>Willco Wells</td><td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint Laser System con tutti i componenti</td><td>Andor Technology - acquistato tramite Quorum Technologies, Inc.</td><td>2203-SYS</td><td></td></tr><tr><td>Laser MicroPoint Colorante Courmarin (435 nm)</td><td>Andor Technology</td><td>MP-27-435-DYE</td><td></td></tr></tbody></table>

motor nerve transezione e time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo zebrafish

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Il sistema nervoso è spesso descritto come componente hard-wired del corpo, anche se si tratta di un sistema di organi considerevolmente fluido che reagisce a stimoli esterni in maniera stereotipata coerente, pur mantenendo un&#39;incredibile flessibilità e plasticità. A differenza del sistema nervoso centrale (SNC), il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativa, ma abbiamo appena iniziato a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando zebrafish come sistema modello, abbiamo l&#39;opportunità senza precedenti di studi rigenerativi coppia con l&#39;imaging in vivo e di manipolazione genetica. Nervi periferici sono composti di assoni circondati da strati di cellule gliali e tessuto connettivo. Gli assoni sono ensheathed da mielinizzanti o non mielinizzanti cellule di Schwann, che sono a loro volta avvolto in un fascicolo da una guaina cellulare chiamato il perinevrio. A seguito di un infortunio, nervi periferici adulti hanno la straordinaria capacità di remove danneggiato detriti assonale e obiettivi re-innervano. Per studiare i ruoli di tutti glia periferica in PNS rigenerazione, descriviamo qui un saggio transection assone che utilizza un laser a colorante disponibile in commercio azoto pompato a axotomize nervi motori in vivo zebrafish transgenico. Approfondiremo i metodi di accoppiare questi esperimenti di time-lapse imaging di nervi feriti e di controllo. Questo paradigma sperimentale può essere utilizzato non solo per valutare il ruolo che giocano glia in rigenerazione nervosa, ma può anche essere la piattaforma per chiarire i meccanismi molecolari che governano riparazione del sistema nervoso.

Il saggio descritto qui può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule gliali e altre popolazioni di cellule nervose associate al danno assonale in vivo. Filmato 1 mostra un esempio di una lesione del nervo creato con questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. Questo esperimento è stato eseguito in Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) zebrafish, in cui glia perineurale esprimono una membrana mirata EGFP e motore neuroni esprimono citosolico DsRed. Il ...

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l&#39;infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

L'obiettivo generale di questa procedura è acquisire immagini in time-lapse del comportamento delle cellule gliali dopo una lesione del nervo periferico in larve di zebrafish vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto montando larve di zebrafish anestetizzate in agarosio a basso punto di fusione su piastre di Petri con fondo in vetro, posizionandole con un ago da dissezione. Successivamente, le larve montate vengono posizionate sul microscopio confocale.Viene selezionato un nervo da ablare ed è acquisita un'immagine degli assoni e delle cellule gliali del nervo non lesionato. Successivamente, vengono selezionate delle aree di interesse (ROI) lungo il nervo ed è attivato il laser per ablare le zone selezionate, creando una sezione del nervo. Infine, gli assoni e le cellule gliali vengono ripresi con imaging a intervalli di tempo successivamente alla sezione del nervo.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il comportamento dinamico delle cellule gliali durante la degenerazione e la rigenerazione del nervo, mediante microscopia confocale a intervalli di tempo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della rigenerazione e dell

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Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di...

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Fonte: Lahne, M., et.al. Coltura di espianti retinici di zebrafish transgenico adulto per l'imaging di cellule vive mediante microscopia multifotonica. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra l'imaging su cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller in espianti retinici di pesce zebra inclusi in agarosio a seguito di danni ai fotorecettori indotti dalla luce. Il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) rilasciato dai fotorecettori danneggiati attiva le cellule gliali di Muller,...

Imaging di cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller durante la rigenerazione retinica del pesce zebra

Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

Dimostriamo un metodo che sfrutta la microscopia confocale a scansione rapida per eseguire l'imaging dal vivo delle cellule della microglia nel tectum ottico del pesce zebra in via di sviluppo, consentendo l'analisi della dinamica di queste cellule in vivo.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per esaminare l'attività neurale nelle regioni cerebrali del pesce zebra transgenico che esprimono indicatori di calcio GCaMP utilizzando la microscopia confocale.

In vivo Imaging a fluorescenza confocale dell'attività neurale indotta dalla stimolazione sensoriale in larve di pesce zebra parzialmente trattenute

La giunzione neuromuscolare larvale di pesce zebra è un modello interessante per lo studio della fisiologia sinaptica. È suscettibile di molte tecniche sperimentali, tra cui l'elettrofisiologia e l'imaging ottico. Qui, descriviamo un protocollo per l'imaging della trasmissione sinaptica utilizzando una sonda basata su pHluorin, sotto un microscopio a epifluorescenza verticale.

Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Scopri il comportamento dinamico delle cellule gliali dopo lesione del nervo periferico in larve di zebrafish trasparenti. Questo metodo di imaging time-lapse aiuta a comprendere i meccanismi cellulari della rigenerazione nervosa in vivo.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

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