Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare in time-lapse il comportamento delle cellule gliali a seguito di lesione del nervo periferico in larve di zebrafish vive. Ciò si ottiene montando prima larve di zebrafish anestetizzate a basso punto di fusione su piastre di Petri con fondo di vetro e posizionandole con un ago da dissezione. Successivamente, le larve montate vengono posizionate sul microscopio confocale.

Viene selezionato un nervo per l'ablazione e viene acquisita un'immagine degli assoni e delle cellule gliali del nervo illeso. Quindi le ROI vengono selezionate lungo il nervo e il laser viene sparato per ablare le aree selezionate creando una trassezione nervosa. Infine, gli assoni e le cellule gliali vengono sottoposti a imaging time-lapse dopo la transezione nervosa.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il comportamento dinamico delle cellule gliali durante la degenerazione e la rigenerazione nervosa attraverso la microscopia confocale time-lapse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione e della biologia delle cellule gliali, ad esempio come rispondono le cellule gliali alle lesioni nervose? E in che modo i distinti sottotipi gliali coordinano il loro comportamento durante la degenerazione e la rigenerazione?

Dopo aver incrociato zebrafish adulti contenenti transgeni che marcano in modo fluorescente i motoneuroni e i tipi di cellule gliali di interesse e aver incubato gli embrioni a 24 ore dopo la fecondazione o HPF, rimuovere l'acqua dell'uovo e sostituirla con un dente a pH o PTU in acqua d'uovo prima di rimettere gli embrioni nell'incubatrice. Da questo punto di tempo fino a circa 96 HPF, utilizzare un cannocchiale da dissezione fluorescente per esaminare gli embrioni per la presenza del gene fluorescente desiderato. Trasferisci gli embrioni positivi in acqua fresca di uova PTU e rimettili nell'incubatrice.

Quando le larve hanno raggiunto i sei giorni dopo la fecondazione o DPF, seleziona alcuni embrioni per il montaggio e trasferiscili in un piatto più piccolo. Togliere l'acqua dal piatto e sostituirla immediatamente con 0,02% di trica Nell'acqua d'uovo PTU, incubare le larve in anestetico per circa cinque minuti. Metti un Eloqua di agro a basso punto di fusione allo 0,8% precedentemente preparato secondo il protocollo di testo in un becher con acqua di rubinetto e un forno a microonde.

Per 30 secondi o fino a quando l'agros non si sarà sciolto, lasciare raffreddare il bicchiere fino a quando il tubo di agros non risulterà tiepido al tatto. Successivamente, trasferisci una larva anestetizzata su un piatto di vetro da 35 millimetri. Rimuovere l'acqua dal piatto.

Quindi coprire immediatamente le larve con abbastanza aros caldi da riempire la parte del piatto con fondo di vetro. Man mano che l'agros si indurisce, utilizzare un ago da dissezione per posizionare le larve su un lato. Quindi inclinalo leggermente sul dorso, assicurandoti che le larve montate tocchino il vetro sul fondo del piatto, necessario per lesioni e imaging.

Usa l'ago per mantenere le larve in posizione fino a quando l'agro non si solidifica e le larve sono immobilizzate. Quindi pipettare lentamente abbastanza acqua trica nel piatto per coprire completamente gli agro e le larve. Accendi tutta la strumentazione del microscopio confocale, i laser a diodi appropriati per emozionare i transgeni del pesce zebra e il laser a colorante pompato con azoto.

Assicurarsi che il divisore di fascio vuoto sia in posizione e che la cella di coer e colorante a 435 nanometri sia in posizione. Aprire completamente l'attenuatore laser, quindi aprire il software di imaging con la lente a immersione in acqua da 63 x 1,2 NA e un vetrino con un lato a specchio. Usa l'illuminazione a campo chiaro per trovare e mettere a fuoco un graffio o un'incisione nello specchio.

Utilizzando il software di imaging, è possibile visualizzare e mettere a fuoco le incisioni sullo schermo del computer dalla finestra che controlla la calibrazione del laser e le impostazioni di alimentazione. Imposta il numero di impulsi su uno e l'attenuazione su 3% di trasmissione dalla barra degli strumenti principale. Seleziona lo strumento ellisse e fai clic sull'immagine sullo schermo del computer.

Per creare una singola ROI circolare, ripeti il processo altre tre volte fino a quando non ci sono quattro RI circolari distanziate in modo casuale sull'immagine. Quindi, spara il laser. Se il laser funziona ed è calibrato correttamente, si creeranno quattro piccole incisioni spot, una all'interno di ogni ROI circolare. Quindi rimuovere il vetrino dal tavolino del microscopio e pulire l'obiettivo.

Sostituire il divisore di fascio vuoto con il divisore di fascio 100% ILL per sezionare un nervo motore utilizzando l'ablazione laser. Applicare una piccola goccia di mezzo di immersione in acqua sull'obiettivo e posizionare la capsula con la larva montata sul tavolino appropriato utilizzando le clip per stabilizzarla utilizzando l'oculare e l'illuminazione a campo largo. Concentrati sulle larve e localizza i motoneuroni.

Scansiona i nervi nei segmenti emi da 10 a 20 e seleziona un nervo motore per la transezione. Quindi, visualizza una visualizzazione dal vivo del nervo sullo schermo del computer. Seleziona i piani Z e acquisisci un'immagine degli assoni e delle cellule gliali del nervo illeso.

Quindi prepara le impostazioni di imaging time-lapse per acquisire proiezioni Z di tutti i tipi di cellule a intervalli da cinque a 30 minuti. A seconda dell'esperimento, rimuovere il divisore di fascio 100% ILL e sostituirlo con il grezzo. Torna alla visualizzazione dal vivo del nervo e usa il canale fluorescente appropriato per visualizzare gli assoni che verranno sezionati.

Utilizzando lo strumento ellisse, creare una ROI ellittica sottile nell'area da ablare. Quindi crea ROI più piccoli all'interno della regione selezionata nella finestra che controlla le impostazioni del laser. Impostare il numero di impulsi su due e la piastra di attenuazione su 18% di trasmissione.

Quindi spara il laser entro le ROI selezionate. Attendere 10 o più secondi e controllare nuovamente la fluorescenza dell'area ablata. Tieni presente che una ROI può inizialmente apparire ablata quando è effettivamente fotosbiancata e potrebbe essere necessario modificare leggermente le ROI durante il corso dell'ablazione per ottenere una transezione completa.

Se la fluorescenza ritorna, aumentare la potenza del laser e sparare il laser. Ancora una volta, ripeti l'operazione fino a quando la fluorescenza scompare all'interno dell'R OIS e non ritorna entro 10 secondi. Una volta completata l'ablazione, iniziare l'imaging time-lapse quando il time-lapse è completo.

Utilizza il software di imaging per compilare i dati e creare proiezioni Z composite a colori per ogni punto temporale. Crea un filmato rapido per analizzare contemporaneamente il comportamento delle cellule gliali degli assoni. Il test qui descritto può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule gliali e di altre popolazioni cellulari associate ai nervi al danno assonale in vivo.

Qui è mostrato un esempio di una lesione nervosa creata utilizzando questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. L'esperimento è stato condotto su sei pesci zebra transgenici DPF che esprimevano un EGFP mirato alla membrana nel ggl perineurale e un rosso DS citosolico nei motoneuroni. La lesione è stata fatta lungo la proiezione rostrale di un nervo motore del tronco che è stato poi ripreso in time-lapse in entrambi i canali rossi EGFP e DS.

Ciò ha permesso la visualizzazione simultanea dei comportamenti delle cellule assoniche e gliali immediatamente dopo la lesione. Queste immagini sono punti temporali statici presi dal filmato time-lapse. L'ellisse tratteggiata mostra il ROI che è stato ablato utilizzando il laser in un minuto.

Dopo la transezione o MPT, l'area ablata mancava di fluorescenza e la zona della lesione misurava circa 3,5 micrometri dal moncone prossimale a quello distale. Il successo di una transezione può essere confermato dall'imaging del moncone del nervo distale e dalla ricerca di segni di degenerazione walleriana, tra cui la frammentazione dell'assone distale e la rapida clearance. L'assenza di fluorescenza assonale lungo il moncone distale a 120 MPT indica che questi assoni hanno effettivamente subito una degenerazione walleriana e la transazione ha avuto successo.

La regolazione della potenza del laser su un'impostazione ideale è fondamentale quando si eseguono esperimenti di ablazione laser. Le impostazioni ideali della potenza del laser ableranno in modo pulito il nervo solo entro il ROI selezionato e le impostazioni di potenza del laser che sono troppo basse o troppo alte produrranno risultati non ottimali visto qui è un infortunio che è stato eseguito con la potenza del laser che era troppo bassa. La fluorescenza è rimasta all'interno della ROI dopo l'accensione del laser, risultando in una transezione incompleta.

D'altra parte, come dimostrato in questa figura, una potenza laser troppo elevata produceva un'ablazione estremamente ampia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come montare il pesce zebra per gli esperimenti di transsezione laser. Crea una transezione utilizzando un laser a colorante con pompa di azoto e valuta la risposta delle cellule circostanti utilizzando l'imaging confocale time-lapse.