Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i difetti comportamentali nelle larve di zebrafish dopo il trattamento con sostanze tossiche o farmaci. Ciò si ottiene raccogliendo e trattando prima gli embrioni o le larve con sostanze chimiche fino ai primi sette giorni di sviluppo. Il secondo passo è quello di realizzare corsie di nuoto agricolo utilizzando stampi appositamente progettati.

Successivamente, le larve trattate vengono collocate nelle corsie agricole per l'analisi comportamentale utilizzando la fotografia time-lapse. Il passaggio finale consiste nell'importare le immagini nell'immagine J e utilizzare una macro specifica scritta internamente per raccogliere i dati delle coordinate XY delle larve nelle corsie. In definitiva, il test comportamentale ad alto rendimento viene utilizzato per trovare differenze nel comportamento di evitamento e nell'asse figma, nonché nella velocità di nuoto e nel riposo tra i gruppi di trattamento.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quelli disponibili in commercio è che possiamo utilizzare il nostro metodo per osservare comportamenti più complessi. È anche economico da costruire e facile da configurare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze comportamentali, come ad esempio il modo in cui le sostanze tossiche influenzano lo sviluppo del cervello e il comportamento durante l'esposizione embrionale precoce.

Può anche fornire informazioni su sottili difetti cerebrali negli esseri umani, che non possono essere trovati da altri attuali screening di tossicità. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché catturare le larve può essere difficile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi hanno una curva di apprendimento poiché il protocollo coinvolge sistemi personalizzati.

Per iniziare questa procedura, inserire nei serbatoi piatti di vetro Pyrex con erba finta realizzata con filato verde. All'alba, lasciare le stoviglie nelle vasche per due ore in modo da raccogliere gli embrioni di zebrafish. Versare i piatti di vetro contenenti gli embrioni su un colino portatile con acqua deionizzata.

Successivamente, fai crescere gli embrioni in acqua d'uovo contenente 60 milligrammi per litro di oceano istantaneo in acqua deionizzata e 0,25 milligrammi per litro di blu di metilene, che viene utilizzato come inibitore della muffa. Gli embrioni possono essere alloggiati da 50 a 60 larve per 50 millilitri o in vasche di riproduzione più grandi fino a quando gli embrioni non sono pronti per essere trattati con sostanze tossiche. A seconda dell'ipotesi del singolo esperimento, gli embrioni possono essere trattati immediatamente o durante specifiche fasi di sviluppo utilizzando sostanze tossiche o farmaci, che di solito vengono disciolti nel DMSO e poi ulteriormente diluiti direttamente nel mezzo di acqua dell'uovo.

Il colore blu viene utilizzato a scopo dimostrativo video durante il trattamento embrionale e larvale. Le larve e gli embrioni possono essere alloggiati in piastre di Petri profonde a una densità di circa 50-60 larve per 50 millilitri fino all'analisi comportamentale a sette giorni dopo la fecondazione, cambiare la soluzione di acqua d'uovo almeno a giorni alterni per evitare la crescita di funghi o batteri dagli embrioni morti. Gli stampi in plastica sono stati fabbricati per creare corsie utilizzando aros, che viene versato in piastre di plastica a pozzetto singolo da Thermos Scientific.

Gli stampi contengono cinque corsie in cui i lati sono angolati a 60 gradi. Vedi il protocollo di testo che accompagna questo video per le dimensioni degli stampi e delle piastre? Per prima cosa, prepara l'aros sciogliendo lo 0,8% di aros in acqua deionizzata con 60 milligrammi per litro di oceano istantaneo.

Successivamente, generare le corsie versando 50 millilitri di aros fusi in una piastra a pozzetto singolo. Quindi molto lentamente posizionare lo stampo sopra il liquido aros che elimina ogni formazione di bolle. Togliete lo stampo quando l'aros si sarà raffreddato.

Le corsie aros possono essere conservate a temperatura ambiente con i coperchi sulle stoviglie per un massimo di 36 ore. Per un'analisi comportamentale ad alta produttività, le cabine di imaging sono preparate con una fotocamera digitale da 15 megapixel collegata alla parte superiore della cabina rivolta verso il basso nella parte inferiore della cabina. Un laptop con schermo da 15,6 pollici viene posizionato con lo schermo rivolto verso l'alto.

Per evitare il surriscaldamento delle larve, è meglio utilizzare un laptop con una temperatura dello schermo che non superi i 28 gradi Celsius. Posizionare un diffusore di plastica sopra lo schermo del laptop su cui verranno posizionate le piastre agros. Il diffusore eviterà più motivi nelle immagini raccolte.

Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, spostare con cautela le larve dalla capsula di Petri alla corsia dell'agros per ridurre lo stress delle larve. In ogni corsia possono essere collocate fino a 20 larve, ma in genere vengono utilizzate cinque larve per corsia per facilitare il monitoraggio più accurato della velocità di nuoto e per ridurre il numero di larve necessarie per esperimento, riempire le corsie con acqua d'uovo, con o senza farmaci o sostanze tossiche a seconda dell'esperimento. Non riempire completamente le corsie fino a quando non sono state posizionate negli armadi di imaging per evitare traboccamenti.

Attendere 10 minuti affinché le larve si acclimatino dopo il periodo di acclimatazione. Posiziona quattro piastre a mano direttamente sopra lo schermo del laptop. In questo momento, le corsie possono essere completate con uova, acqua o trattamento chimico in modo che sia a livello della parte superiore della corsia per eliminare le ombre sui bordi delle corsie.

Nelle immagini programmare il computer per la fotografia time-lapse, scattando foto ogni sei secondi per un totale di 300 immagini per esperimento. Impostare la fotocamera su una risoluzione inferiore per l'imaging a velocità video. Mentre la risoluzione inferiore limita le registrazioni a una singola piastra multipozzetto.

Le registrazioni video sono appropriate per l'imaging di eventi di nuoto rapido. Usa una presentazione PowerPoint come stimolo avversivo per le larve in questa dimostrazione. Il PowerPoint inizia con uno sfondo bianco vuoto per 15 minuti, seguito da 15 di una barra rossa in movimento sulla metà superiore del piatto.

Per evitare l'evaporazione del liquido all'interno delle corsie di aros, mantenere il tempo massimo di imaging al di sotto di un'ora. Apri le immagini con l'immagine J in questa dimostrazione. Viene utilizzata una macro interna per l'analisi larvale a cinque corsie, che può essere resa disponibile a qualsiasi utente.

Utilizzare i prompt nella macro per impostare i parametri, come il numero di immagini e il colore da sottrarre. La macro divide quindi automaticamente il canale di colore in modo che il colore rosso possa essere rimosso. Sottrae lo sfondo, applica una soglia e identifica le larve mediante analisi delle particelle.

Dopo che tutte le immagini sono state analizzate nella macro J dell'immagine, verrà visualizzato un file dei risultati che conterrà le coordinate XY delle singole larve per ogni immagine, insieme al numero dell'immagine e al numero della corsia. Salva il file dei risultati in formato Excel e ordinalo in base allo sfondo vuoto rispetto allo sfondo della barra mobile, quindi al numero del pozzetto. Usa un modello Excel con equazioni integrate per determinare automaticamente il posizionamento delle larve nei pozzetti, la distanza tra le larve, la velocità di movimento e la quantità di riposo.

Il modello Excel più recente creato nel laboratorio Cretin è disponibile su richiesta per la creazione di grafici che mostrano vari gruppi di trattamento nel foglio Excel, insieme al T-test per il confronto tra gruppi di trattamento e controlli. Ulteriori analisi statistiche possono essere eseguite utilizzando il programma statistico SPSS. I risultati sono mostrati per le larve trattate con acqua d'uovo e DMSO come controlli e concentrazioni variabili di un pesticida organofosfato che si trova comunemente negli alimenti non biologici.

Qui le barre bianche mostrano i dati delle larve esposte a uno sfondo vuoto e le barre rosse mostrano i dati delle larve esposte alla barra rossa in movimento. Controllo. Le larve cresciute nell'acqua d'uovo mostrano una maggiore preferenza per essere giù nel piatto dopo che viene presentata loro la barra rossa in movimento. Risultati simili si ottengono quando le larve vengono coltivate in acqua d'uovo contenente un microgrammo per millilitro di DMSO, un solvente che viene comunemente usato per sciogliere vari prodotti farmaceutici e tossici come 1000 x soluzioni stock.

I grafici indicano le misurazioni che possono essere ottenute dall'analisi comportamentale, tra cui la percentuale di larve lungo la corsia, la percentuale di larve alla fine della corsia, la percentuale di larve sul bordo della corsia, la distanza tra i pesci, la velocità di nuoto delle larve e la percentuale di tempo in cui le larve sono a riposo. I risultati mostrati sono un campione di un esperimento. Tuttavia, quando ripetuti, i risultati indicano che la velocità di nuoto e il comportamento figma sono alterati da basse concentrazioni di pesticidi organofosfati, che imitano i livelli nel cibo umano Una volta padroneggiati, l'imaging e l'analisi dell'imaging possono essere eseguiti in un'ora e mezza se eseguiti correttamente.

L'aspetto più importante di questa procedura è ricordarsi di mantenere pulito il mezzo culturale sostituendolo con un nuovo mezzo ogni giorno.