Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare il lipopolisaccaride dalla superficie esterna dei batteri gram-negativi e caratterizzare strutturalmente la porzione lipidica A mediante l'utilizzo di protocolli di spettrometria di massa in tandem. Questo viene ottenuto attraverso l'estrazione chimica del lipopolisaccaride dalla superficie cellulare batterica e successiva idrolisi acida blanda per liberare il lipid A dalla porzione polisaccaridica del lipopolisaccaride. Come secondo passaggio, una soluzione di lipid A viene analizzata mediante spettrometria di massa tandem con ionizzazione a spruzzo elettrospray.

Nella nostra procedura, il lipidio A viene analizzato mediante spettrometria di massa in tandem basata su dissociazione indotta da collisione o su dissociazione fotoindotta da ultravioletti per la caratterizzazione strutturale. I risultati mostrano differenze nei pattern di frammentazione negli spettri di massa ottenuti con protocolli basati sulla dissociazione indotta da collisione o sulla dissociazione fotoindotta da ultravioletti, dove la UVPD produce un pattern di frammentazione più informativo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la spettrometria di massa in tandem consente la chiarificazione degli analiti bersaglio in base all'interpretazione dei pattern di frammentazione diagnostici.

Le foto ultraviolette, in particolare la dissociazione, rappresentano un metodo MSMS ad alta energia che produce ioni frammento più diversificati rispetto alle tecniche esistenti, come la dissociazione indotta da collisione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché il metodo di spettrometria di massa UVPD utilizzato non è ancora commercializzato. Inoltre, il metodo impiega un laser che è stato integrato con uno spettrometro di massa mediante modifiche personalizzate prima dell'inizio di questa procedura.

Raccogliere le cellule da una coltura batterica di 250 ml, centrifugare le cellule a 10.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi eliminare il soprannatante del mezzo, lavare il pellet cellulare con 50 ml di 1× PBS. Dopo la centrifugazione per ricostituire il pellet, rimuovere il soprannatante.

Sospendere successivamente le cellule in 40 mil di XPBS e suddividerle in 2 provette da centrifuga in teflon da 250 mil. Aggiungere 25 mil di cloroformio e 50 M di metanolo a ciascuna provetta per ottenere una miscela omogenea monofasica. Mescolare per inversione e incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti.

Per garantire una lisi cellulare completa, centrifugare il campione a 2000 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante. Lavare il pellet di LPS con circa 100 mil di una miscela monofasica di Bly dire. Centrifugare a 2000 ×g per 20 minuti e scartare il soprannatante.

Aggiungere 27 ml di tampone per l'idrolisi acida debole al pellet di LPS e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta fino a quando rimangono solo piccole particelle; sottoporre a sonica con una sonda per ottenere una sospensione omogenea. Sospendere il pellet di LPS in soluzione a ciclo continuo costante per 20 secondi al 50% di potenza. Ripetere la sonicazione del campione due volte, con impulsi di 20 secondi ciascuno e circa cinque secondi di intervallo tra un impulso e l'altro.

Quindi far bollire i campioni in un bagno d'acqua per 30 minuti. Rimuovere le provette dal bagno d'acqua e lasciare raffreddare il campione alla temperatura ambiente. Prima di procedere all'estrazione del lipidio A dopo l'idrolisi, convertire la soluzione di SDS in una miscela bifasica BLY aggiungendo 30 mil di cloroformio e 30 mil di metanolo per ottenere una miscela tampone di idrolisi acida leggera di cloroformio-metanolo, mescolare per inversione e centrifugare.

Centrifugare il campione S per 10 minuti a 2000 × g. Utilizzando una pipetta di vetro, estrarre la fase inferiore in un tubo da centrifuga in teflon pulito. Successivamente, eseguire una seconda estrazione aggiungendo 30 ml della fase inferiore proveniente da una miscela bifasica pre-equilibrata di butanolo e dire all'acqua alla fase superiore nel tubo del campione, mescolando per inversione e centrifugando a 2000 × g per 10 minuti. Estrarre la fase inferiore con una pipetta di vetro e unire con la fase inferiore estratta in precedenza.

Lavare le fasi inferiori raccolte aggiungendo 114 ml della fase superiore di bly dire pre-equilibrata per creare una miscela bifasica di bly dire, mescolare per inversione e centrifugare a 2000 ×g per 10 minuti utilizzando una pipetta di trasferimento in vetro. Trasferire la fase inferiore in un pallone pulito per evaporazione rotativa e asciugare il campione mediante evaporazione rotativa.

Successivamente, aggiungere cinque millilitri di una miscela di cloroformio e metanolo al pallone rotante e sottoporre a sonicazione in bagno per almeno 30 secondi, al fine di agevolare la sospensione del lipid A dalle pareti del pallone. Utilizzare una pipetta di trasferimento in vetro per trasferire il lipidio in un tubo in vetro pulito chiuso con tappo a vite fenolico rivestito in A-P-T-F-E.

Asciugare il campione sotto un flusso di azoto utilizzando un essiccatore ad azoto. Ri-sospendere il lipide essiccato in un millilitro di una miscela cloroformio-metanolo. Dopo l'aggiunta del solvente, vortexare la miscela per garantire una completa ri-sospensione.

Trasferire in una piccola provetta di vetro e asciugare utilizzando un essiccatore a azoto. Conservare il campione essiccato a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi successiva mediante TLC o spettrometria di massa. Il campione può essere conservato a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi successiva.

Una volta preparato il campione, mescolare 200 microlitri di metanolo di grado HPLC con 200 microlitri di cloroformo di grado HPLC in un piccolo flacone di vetro vuoto; trasferire 200 microlitri della miscela solvente cloroformio-metanolo nel flacone contenente il lipid A e sottoporre il contenuto a sonificazione per cinque minuti o fino a quando tutto il materiale si sarà disciolto. Successivamente, impostare lo spettrometro di massa per l'ionizzazione elettrospray in modalità negativa e riempire una siringa da 250 microlitri con la soluzione di lipid A.

Inserire la siringa in una pompa per siringa ed infondere direttamente il lipide diluito. Campionare a un flusso di 2,0-3,5 microlitri al minuto. Ottimizzare e potenziare il segnale ionico del lipide regolando l'ottica ionica.

Acquisire lo spettro di massa del lipide. Isolare e attivare il lipide A bersaglio selezionando la CID come metodo MSM. Successivamente, aumentare la tensione CID o l'energia di collisione normalizzata fino al lipide precursore.

Una specie presenta un'abbondanza relativa di circa il 10% rispetto all'ione prodotto più intenso; acquisire e mediare gli spettri fino al raggiungimento di un rapporto segnale/rumore sufficiente. Per gli ioni prodotti, preparare il campione e lo spettrometro di massa come descritto nella sezione precedente. Accendere il laser collegato allo spettrometro di massa.

Vedere il protocollo testuale per i dettagli di spettrometria di massa: configurare il software dello strumento in modo che il laser attivi il laser a eccimeri quando gli ioni entrano nella cella HCD; successivamente, accendere il generatore di impulsi in modo che il laser emetta un impulso ogni due millisecondi. Isolare l'ione precursore del lipide A selezionando la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) come metodo MS/MS e regolare l'energia collisionale al 1% di energia collisionale normalizzata; attivare l'ione lipidico isolato aumentando l'energia del laser e regolando il numero di impulsi laser, tipicamente dieci impulsi da sei millijoule. Infine, acquisire e mediare gli spettri finché non si raggiunge un rapporto segnale/rumore sufficiente.

Per gli ioni prodotto UVPD. Lo spettro di massa MALDI TOF in modo anionico del lipid A proveniente dal ceppo E Coli K 12 W 3 110 mostra la singola specie deprotonata a rapporto massa/carica di 1796,2 come specie principale osservata. I dettagli dell'analisi MALDI TOF sono discussi nel protocollo del testo.

In alternativa, lo stesso campione lipidico sottoposto a ESI in modalità negativa produce prevalentemente ioni lipidici doppiamente deprotonati con rapporto massa/carica principale di 898,1; ioni lipidici deprotonati singolarmente con rapporto massa/carica principale di 1796,20 sono osservabili ma con abbondanza relativa inferiore rispetto alle specie doppiamente deprotonate. La frammentazione mediante CID o UVPD a 193 nanometri è stata eseguita sull'ione lipidico singolarmente deprotonato. Queste tecniche possono essere utilizzate per assegnare in modo più accurato le strutture chimiche, in particolare dei lipidi.

Una specie contenente combinazioni complesse di modifiche o modifiche chimiche precedentemente non caratterizzate. I profili di frammentazione sono mostrati con linee tratteggiate che rappresentano i siti di scissione e vengono confrontati con i valori del rapporto di carica principale riportati sotto ciascuna struttura fornita. I valori del rapporto di carica principale e i siti di scissione evidenziati in carattere rosso rappresentano ioni prodotto unici associati al lipide marcato con UVPD 32 P.

A isolato da due ceppi diversi di e coli K 12 è stato analizzato mediante TLC. Il protocollo per questa procedura è descritto in dettaglio nel protocollo testuale. Il ceppo K 12 W 3 110 contiene principalmente lipid A fosforilato BIS e tris, oppure si osserva un profilo TLC più complesso con lipidio 32 p.

A isolato dal ceppo di E. coli WD 1 0 1. WD 1 0 1 produce lipidi. A fortemente modificato con rabino e fosfoetanolammina.

Poiché sia il fosfato in posizione uno che quello in posizione quattro sono disponibili per modifiche, il lipid A da WD 1 0 1 può essere descritto come modificato singolarmente, contenente un solo residuo di acido aminoarabinosico o fosfoetanolammina su uno dei due fosfati, oppure come doppiamente modificato, in cui entrambi i fosfati sono modificati in maniera combinatoria. Oltre alle modifiche sui fosfati in posizione uno e quattro, si osserva anche l'aggiunta di palmitato, che aumenta il valore di Rf delle specie di lipid A in questo sistema solvente. Questo protocollo ha aperto in modo unico la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare ulteriormente le relazioni struttura-funzione riguardo al modo in cui le modifiche del lipid A influenzano la biologia dei batteri Gram-negativi.

Siamo inoltre molto interessati e abbiamo dimostrato l'efficacia della spettrometria di massa basata su UVPD per caratterizzare le strutture di molecole biologicamente importanti, come glicani, proteine, acidi nucleici e altri lipidi complessi. Non bisogna dimenticare che lavorare con solventi organici, materiali biologicamente pericolosi e laser può essere estremamente rischioso. È fondamentale sottolineare che i solventi devono essere manipolati all'interno di cappe chimiche ventilate.

È sempre necessario indossare un'adeguata attrezzatura di protezione, come guanti e occhiali protettivi, e il laser utilizzato per la UVPD deve essere adeguatamente schermato.