Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di Drosophila melanogaster
11 settembre 2013
La cooperazione tra l'oncogene attivato, come RAS V12 e le mutazioni nei geni della polarità cellulare come scarabocchiato, causare la crescita del tumore in Drosophila in cui le cellule tumorali mostrano anche comportamenti invasivi. Qui un semplice protocollo per l'induzione e l'osservazione dei tumori benigni e invasivi è presentato.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre tumori benigni e invasivi nella drosofila, per poi visualizzarli sezionando il complesso cefalico larvale. Questo inizia con l'insediamento tra i ceppi desiderati e l'isolamento della progenie larvale, portatrice di tumori invasivi o benigni. Il passo successivo consiste nel sezionare le larve selezionate.
Esporre il complesso cefalico prima tagliandolo a due terzi del percorso, fissandolo e poi capovolgendolo. Successivamente, il corpo grasso e i tessuti intestinali vengono puliti, quindi anche i nervi ancora attaccati al cordone nervoso ventrale e l'epidermide larvale vengono rotti. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare il complesso cefalico o fissarlo per le applicazioni a valle.
In definitiva, i risultati possono mostrare tumori invasivi o benigni marcati con GFP attraverso l'uso della microscopia a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune delle domande chiave nella biologia del cancro. Ad esempio, potresti voler capire quali geni potrebbero inibire la progressione dei tumori in un organismo intatto.
Una volta ottenuti i ceppi genetici necessari, preparare una coltura starter del ceppo tester. Preparare anche una coltura starter per il brodo testato. Incrocia 10 femmine vergini dal ceppo del tester con 10 maschi dal ceppo testato.
Lascia che le mosche si accoppino e depongano le uova per 24-48 ore a 25 gradi Celsius, quindi trasferiscile in una fiala fresca per produrre più prole. Monitorare le fiale incrociate per le uova e le larve di primo stadio. Imposta una nuova croce.
Se le fiale raccolte mostrano una scarsa deposizione di uova. Se le fiale raccolte iniziano ad asciugarsi, aggiungere solo tre o quattro gocce di acqua distillata in autoclave per mantenere la coltura umida. Continuare a monitorare le fiale fino a quando non si va a vagare.
Sono presenti larve di terzo stadio. Quindi procedere con il monitoraggio con uno stereomicroscopio a fluorescenza. Utilizzando la stessa procedura, raccogliere mosche portatrici di tumori invasivi utilizzando gli stock elencati entro il quinto o il sesto giorno di coltura, le larve vaganti del terzo stadio saranno disponibili dalle colture di tumori benigni.
Tuttavia, non saranno disponibili fino al giorno 10 dalle colture tumorali invasive. Per raccogliere le larve del terzo stadio, bagnare un pennello fine con acqua distillata e raschiarle via dalla parete della fiala. Posizionare le larve in un vetrino a depressione con quello freddo XPBS, e poi utilizzando un pennello bagnato.
Raschiare via qualsiasi materiale alimentare dall'epidermide. Per alcuni minuti di immobilizzazione, posizionare la larva sul piatto a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Per un tempo di immobilizzazione più lungo, metti le larve in una fiala di coltura con solo un pisolino su una bacchetta.
Collegare la fiala di coltura e lasciarla riposare per 40 minuti. Successivamente, trasferisci le larve immobilizzate su un vetrino. Aggiungere una goccia di olio di carburazione light halo e coprire le larve con un vetro di copertura.
Ora, osserva le larve sotto uno stereomicroscopio fluorescente. Per l'espressione della GFP, selezionare le larve fluorescenti verdi e procedere con la dissezione. Le larve benigne portatrici di tumore emetteranno fluorescenza in verde nella regione anteriore in cui è presente il complesso cefalico.
I tumori invasivi emetteranno anche il verde fluorescente nella regione anteriore delle larve in corrispondenza del complesso cefalico. Se possibile, assicurati di documentare fotograficamente i tumori fluorescenti. Quindi l'epidermide traslucida della larva rende difficile osservare l'entità della migrazione dei tumori, ed è per questo che dobbiamo sezionare i tumori.
Inizia con l'uso del forcipe per trasferire una larva fresca con entrambi i tumori. Digitare su un pozzetto di una capsula di dissezione contenente un millilitro di XPBS freddo. Tenere ferme le larve usando un paio di pinze a circa due terzi della distanza dall'estremità anteriore.
Usando un altro paio di pinze, separa in modo intelligente il terzo posteriore delle larve e scartalo. Poi ha lasciato andare i due terzi anteriori. Quando la pressione all'interno delle larve viene rilasciata, il suo contenuto fuoriesce dalla cavità corporea.
Usando una pinza, rimuovere i tessuti che sono fuoriusciti dalla cavità del corpo. Quindi, tieni il gancio per la bocca della larva e spingilo nell'epidermide della larva. Usando l'altro paio di pinze, invertire completamente le larve.
Ora con la pinza, delicatamente e con attenzione, rimuovere le ghiandole salivari del corpo adiposo, l'intestino, il complesso del disco alare e gli eventuali tubi tracheali. Il complesso cefalico può ora essere visibile attaccato all'uncino della bocca. Gli emisferi cerebrali e il VNC sono ancora collegati all'epidermide larvale tramite i nervi emanati dal VNC.
Con una pinza, rompere delicatamente queste connessioni. Quindi rimuovere il grasso in eccesso o altri tessuti in modo che il complesso cefalico diventi chiaramente visibile. Attaccato all'epidermide larvale in corrispondenza dei ganci della bocca.
Lasciare il complesso cefalico così com'è per un'ulteriore elaborazione prima della visualizzazione. Altrimenti, per visualizzare direttamente il complesso cefalico, staccarlo dall'epidermide e posizionarlo in una goccia di terreno di montaggio a base di glicerolo come lo scudo vettore. Utilizzando il protocollo descritto, sono stati indotti tumori nell'occhio.
Disco aninico, i tumori benigni sono rimasti localizzati al disco aninico dell'occhio dove vengono indotti. Si noti che il tessuto marcato con GFP non è migrato verso organi contigui come il cordone nervoso ventrale nel complesso cefalico che porta tumori invasivi da una crescita eccessiva di larve del giorno 10 di tessuto tumorale è stata notata. Inoltre, come sottolineato dalla freccia rossa, i tumori hanno invaso organi contigui come il VNC e i ganci della bocca.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre geneticamente tumori benigni e invasivi, e quindi visualizzarli sezionando il complesso cefalico intra ano gastro.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per indurre e osservare tumori benigni e invasivi in Drosophila, concentrandosi sulla cooperazione tra oncogeni attivati e mutazioni nei geni della polarità cellulare. La procedura include la dissezione del complesso cefalico larvale per visualizzare le caratteristiche del tumore.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Genetica
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Gli oncogeni attivati, come RAS V12, contribuiscono alla crescita tumorale.
- Le mutazioni nei geni della polarità cellulare, come scribbled, svolgono un ruolo nel comportamento tumorale.
- Drosophila è un organismo modello per lo studio della dinamica tumorale.
- Comprendere l'invasività tumorale è fondamentale per la ricerca sul cancro.
Scopo dello studio
- Indurre tumori benigni e invasivi in Drosophila.
- Visualizzare le caratteristiche tumorali mediante dissezione delle larve.
- Esplorare le interazioni tra oncogeni e mutazioni della polarità cellulare.
Metodi Utilizzati
- Incrocio di ceppi di Drosophila desiderati per isolare la progenie larvale.
- Dissezione delle larve per esporre il complesso cefalico.
- Rimozione dei tessuti del corpo adiposo e dell'intestino dalle larve dissezionate.
- Acquisizione di immagini del complesso cefalico per ulteriori analisi.
Risultati principali
- Induzione con successo di tumori benigni e invasivi in Drosophila.
- Visualizzazione delle caratteristiche tumorali mediante dissezione delle larve.
- Informazioni sul ruolo degli oncogeni e delle mutazioni della polarità cellulare nel comportamento tumorale.
- Ripercussioni potenziali per la comprensione della biologia del cancro.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio della dinamica tumorale in Drosophila.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'invasività tumorale.
- Ulteriori ricerche potrebbero esplorare bersagli terapeutici basati su queste interazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo protocollo consente la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi di invasione tumorale modellando la progressione da benigno a maligno in un sistema geneticamente modificabile. Supporta la validazione degli obiettivi attraverso l'analisi funzionale delle interazioni tra oncogeni e geni della polarità. L'approccio fornisce un'elevata affidabilità predittiva per la priorizzazione di modificatori genetici del comportamento tumorale nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche testando la cooperazione tra RasV12 attivato e la perdita dei geni scribble, discs large o lethal giant larvae.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico nei percorsi di invasione mediante una progressione tumorale quantificabile, da una crescita localizzata a un'iperplasia tissutale contigua.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara complessi cefalici portatori di tumore validati per lo screening fenotipico successivo di soppressori o potenziatori genetici.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di dissezione e visualizzazione per garantire letture quantitative riproducibili della localizzazione e dell'invasione del tumore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando interazioni genetiche conservate nell'invasività tumorale, applicabili ai percorsi del cancro umano.
- Valore operativo: Favorisce l'allineamento traslazionale dei biomarcatori consentendo l'analisi della dissociazione del tessuto tumorale marcato con GFP e dei modelli di migrazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo una piattaforma scalabile per la genomica funzionale nella biologia tumorale.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici visualizzando l'espansione tumorale in complessi cefalici integri per valutare i modificatori genetici dell'invasione.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso l'isolamento standardizzato di tessuto tumorale marcato con GFP per la valutazione di composti o soppressori genetici.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative dell'iperplasia tumorale e dell'invasione degli organi per confrontare condizioni in diversi contesti genetici.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica modellando passaggi conservati nella progressione tumorale rilevanti per i sistemi mammiferi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per la validazione incrociata dei bersagli nei processi di scoperta oncologica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di invasione tumorale collegando perturbazioni genetiche definite a risultati fenotipici osservabili.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso la dissezione standardizzata delle larve e la preparazione del complesso cefalico per l'acquisizione di immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo un'elevata affidabilità fenotipica in fase precoce per candidati geni soppressori tumorali o oncogeni.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione corretta rispetto al rischio distinguendo fenotipi tumorali benigni da quelli invasivi negli schermi funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica di Drosophila, microscopia fluorescente e tecniche di dissezione microchirurgica.
- È dipendente dalla microscopia stereoscopica a fluorescenza e dai sistemi di anestesia a freddo per l'immobilizzazione delle larve e la manipolazione dei tessuti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la manutenzione dei ceppi, i tempi degli incroci e i protocolli di stadiatura larvale.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il modello ad altri tipi di tumore o contesti genetici diversi dall'origine nel disco occhio-antennale.
- È limitato dalla necessità di una stadiatura precisa (giorno 5–6 per tumori benigni, giorno 10 per tumori invasivi) per garantire finestre temporali comparabili di progressione tumorale.
