Generazione e quantificazione 3-Dimensional di arteriosa lesioni nei topi mediante tomografia ottica di proiezione

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come la tomografia a proiezione ottica possa essere utilizzata per la visualizzazione e la quantificazione tridimensionale delle lesioni aterosclerotiche e neointimali nel topo. Ciò si ottiene generando prima lesioni arteriose nei topi, chirurgicamente o somministrando una dieta ad alto contenuto di colesterolo ai topi con una predisposizione a sviluppare l'aterosclerosi. Il passo successivo consiste nell'isolare l'arteria bersaglio e scansionarla utilizzando la tomografia a proiezione ottica.

Le fasi finali consistono nell'eseguire la ricostruzione dell'immagine, identificare la lesione e misurare il volume della lesione. In definitiva, i risultati possono mostrare ricostruzioni anatomiche della lesione e quantificazione del volume della lesione e del restringimento arterioso attraverso l'analisi delle immagini. Il nostro gruppo è interessato a comprendere i meccanismi alla base della formazione di lesioni che causano il restringimento arterioso che porta a complicanze potenzialmente letali come infarto e ictus.

Questa applicazione della tomografia a proiezione ottica è stata sviluppata nel nostro gruppo dal Dr.Nicholas Kirkby, in collaborazione con la Dr.Lucy Lowe, e sarà dimostrata dal Dr.Jung Shi Wu, che è uno scienziato post-dottorato che lavora nei nostri laboratori. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'istologia e l'immunoistochimica, è che è meno laboriosa e consente l'analisi tridimensionale piuttosto che bidimensionale. Questa tecnica per indurre lesioni dell'arteria femorale è stata modificata da quelle di R e compagnia e Sada e compagnia.

Il protocollo del testo spiega come indurre lesioni aterosclerotiche mediante manipolazione alimentare. Inizia con un topo nero sei C 57 di 10-12 settimane di peso compreso tra 25 e 30 grammi. Una volta anestetizzato, posizionare il mouse su un tappetino caldo per mantenere la sua temperatura corporea e fornire fluoro dal due al 3% attraverso un cono nasale.

Quando il topo non risponde a un pizzicamento delle dita, somministrare buprenorfina a 0,1 milligrammi per chilogrammo. Quindi, metti il topo sulla schiena e radere la superficie ventrale dell'arto posteriore sinistro. Quindi praticare un'incisione per esporre i muscoli dell'arto posteriore superiore tra la biforcazione dell'arteria poplitea e la parete addominale.

Eseguire una dissezione smussata per isolare il nervo femorale dall'arteria e dalla vena femorale durante la procedura. Mantenere i tessuti umidi con l'1% in peso in volume li canine. Successivamente, posizionare le legature temporanee di seta 6.0 Mers attorno all'arteria femorale e alla vena vicino alla parete addominale e immediatamente sotto il ramo con l'arteria poplitea.

Questi servono a controllare il flusso sanguigno. Quindi isolare l'arteria poplitea, da due a cinque millimetri distalmente al ramo con l'arteria femorale, e legare l'arteria poplitea sotto l'arteria poplitea. Posiziona una seconda legatura.

Ora, fai una piccola incisione per l'inserimento del filo nell'arteria poplitea immediatamente distale al ramo con l'arteria femorale. Applicare pressione sulla legatura temporanea prossimale per prevenire il sanguinamento attraverso l'incisione e nell'arteria femorale verso la parete addominale. Inserire un filo G da 0,014 pollici da circa uno a 1,5 centimetri.

Lasciarlo in posizione per 30 secondi e poi rimuoverlo. Quindi utilizzando le legature legate, l'arteria poplitea sopra l'incisione. Fare attenzione a non occludere l'arteria femorale.

Ora rimuovi le legature temporanee. Chiudere la ferita con suture di corsa discontinue utilizzando 5.0 mercal. Quindi applicare la crema EMLA.

Consenti all'animale di riprendere conoscenza e movimento nella gabbia di recupero prima di rimetterlo nella gabbia di casa. Si prevede che la zampa mostri zoppia per due o tre giorni, ma questo non significa che il topo debba essere isolato. Per l'OPT, il topo deve essere soppresso, indurre l'anestesia terminale dal pentobarbital.

Quindi effettuare una fissazione della perfusione transcardiaca con dissanguamento. Ora isolate le arterie femorali o l'arco aortico e i suoi rami. Rimuovere qualsiasi materiale estraneo al periale durante il processo.

Quindi postfissare il tessuto in formalina tamponata neutra al 10% per una notte. Il giorno successivo conservare il tessuto in etanolo al 70% o procedere con l'inclusione delle arterie in aeros filtrato all'1,5% LMP. Abbassare delicatamente il tessuto nell'aerodinamica fusa a circa 40 gradi Celsius.

Taglia gli aerodinamici per creare una forma conica. Ora disidratare questo preparato in metanolo al 100% per almeno 12 ore. Una volta disidratati, pulire i recipienti in una miscela uno o due di benzo alcol e benzoato.

Lasciare incubare i vasi in questa soluzione per 12-24 ore. Il giorno successivo, caricare il campione cancellato nel tomografo, che deve essere precalibrato. La risoluzione è fissata a 1024.

Di 1024 pixel. Impostare l'ingrandimento per l'area di interesse. L'asse Z verrà automaticamente impostato sulla stessa risoluzione.

La dimensione del voxel sarà di circa 200 micron. Quindi, utilizzando il canale Campo chiaro, posizionate il campione in modo che ruoti attorno al proprio asse al centro del campo visivo. Utilizzando il canale di emissione GFP one filter, impostare la messa a fuoco e regolare l'esposizione per massimizzare la gamma dinamica dell'immagine.

Evitare la saturazione eccessiva. Ora scansiona il recipiente nel canale di emissione GFP uno solo con incrementi di 0,9 gradi. I campioni devono quindi essere restituiti al 100% di metanolo per almeno 24 ore prima di essere incorporati nella cera.

Per l'analisi istologica, aprire le immagini acquisite in un software di ricognizione o in un software simile utilizzando il software di visualizzazione dei dati. Controllare la qualità della ricostruzione dell'immagine, migliorare la qualità dell'immagine, regolare l'intensità dell'immagine e fare in modo che il software compensi eventuali disallineamenti del campione rispetto al suo asse di rotazione ideale. Per ogni scansione, definire la regione verticale di interesse contenente la lesione.

In ogni 50a linea di scansione, tracciare il confine tra il supporto e la posizione della lamina elastica interna. Il software può quindi interpolare il bordo in tutte le altre scansioni, controllare manualmente queste interpolazioni e correggerle secondo necessità. Ora produci un set di immagini binarie con i pixel bianchi che rappresentano la neointima e i pixel neri che rappresentano il lume pervio.

Ciò si ottiene definendo le soglie di intensità. Una volta ottenuto ciò, il volume dell'oggetto è il volume totale della lesione e il volume luminale è il volume totale, meno il volume dell'oggetto. Pertanto, viene valutata la distribuzione della lesione e del lume lungo la lunghezza assiale.

Le arterie femorali murine sono state prelevate 28 giorni dopo la lesione indotta dal filo o dalla legatura. L'ispessimento neointimale era evidente nelle proiezioni di emissione in vetrini bidimensionali ricostruiti. Si possono distinguere lesioni neointimali concentriche.

Le immagini di emissione dell'intero arco aortico da un topo con deficit di APOE hanno identificato le lesioni attese nella minore curvatura dell'arco aortico, nell'arteria brachiocefalica e nelle origini delle arterie carotide e succlavia sinistra. La stessa lesione è stata segmentata e resa in rosso. Per enfatizzare la distribuzione delle placche quando sovrapposte all'immagine originale, il mezzo e il lume potevano essere distinti in immagini in sezione trasversale che mostravano che si trattava di lesioni eccentriche.

Qui, man mano che la scintigrafia si muove distalmente lungo questi rami, le lesioni si riducono gradualmente e scompaiono prima nell'arteria succlavia, poi nella carotide e infine nell'arteria brachiocefalica. È interessante notare che questa lesione nell'arteria brachiocefalica si sposta verso il divisore di flusso quando questo vaso si divide nelle arterie carotide destra e succlavia destra. Dopo la procedura OPT, è possibile eseguire altri metodi come l'istologia e l'immunoistochimica per rispondere a ulteriori domande come qual è la composizione della lesione?

Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati che lavorano nel campo della ricerca vascolare per studiare il ruolo dei recettori endoteliali, delle lectine e degli enzimi che metabolizzano gli steroidi nello sviluppo di lesioni neointimali e aterosclerotiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere e analizzare le lesioni dalle arterie di rima utilizzando la tomografia a proiezione ottica.