Analisi di acido grasso contenuto e la composizione in microalghe

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il contenuto totale e la composizione degli acidi grassi nelle microalghe. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando un campione contenente una quantità nota di biomassa algale liofilizzata. Il secondo passaggio consiste nel rompere la biomassa microalgaletica.

Successivamente, i componenti lipofili vengono estratti e isolati. L'ultimo passaggio consiste nella transesterificazione dei lipidi di ACell in esteri metilici degli acidi grassi. Infine, la cromatografia gassosa viene utilizzata per quantificare gli acidi grassi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le determinazioni del tric, è che questo metodo è molto preciso e misura specificamente tutti gli acidi grassi e tutti gli altri componenti lipofili. A illustrare la procedura sarà NDI Afer, un tecnico del nostro laboratorio. Prima di iniziare questa procedura, determinare la concentrazione di peso secco di alghe in grammi per litro nel brodo di coltura, come specificato nella referenza indicata. Trasferire un volume di brodo di coltura che contenga da cinque a dieci milligrammi di peso secco di alghe in un tubo da centrifuga in vetro.

Calcolare la quantità esatta di biomassa trasferita utilizzando la concentrazione di biomassa determinata in precedenza; centrifugare il campione per cinque minuti a 1200 G. Eliminare parte del soprannatante, lasciando circa 0,25 millilitri nel tubo. Successivamente, risospendere. Sospendere l'algato nel soprannatante residuo pipettando delicatamente su e giù il pellet e trasferire la miscela cellulare in un tubo per omogeneizzatore a sfere.

Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, risciacquare il tubo della centrifuga e la punta della pipetta con circa 0,15 millilitri di acqua milliQ e trasferire il liquido nel tubo del bead beater. Centrifugare il tubo del bead beater per un minuto al massimo numero di giri al minuto per assicurarsi che non rimangano bolle d'aria sul fondo del tubo. Al termine, liofilizzare il materiale presente nel tubo seguendo questa procedura.

Preparare una soluzione di 50 milligrammi per litro di trip Penta Deano in un rapporto volumetrico arricchito di cloroformio rispetto a metanolo. Utilizzando una pipetta a spostamento positivo, aggiungere un millilitro della soluzione di tripod, no al tubo con perline. Verificare che non rimangano perline all'interno del cappuccio del tubo del bead beater, poiché ciò potrebbe causare la fuoriuscita delle perline dal tubo.

Battere il tubo del frantoio otto volte a 2.500 giri/min per 60 secondi ciascuna, con un intervallo di 122° tra ogni ciclo di frantumazione. Successivamente, trasferire la soluzione con le perle dal tubo del frantumatore a un tubo da centrifuga in vetro pulito e resistente al calore da 15 millilitri con tappo a vite con inserto in teflon. Lavare il tubo del frantumatore con un millilitro della soluzione tripod, e trasferire il lavaggio nel tubo da centrifuga in vetro.

Ripetere altre due volte. Vortexare il campione per cinque secondi, quindi sottoporlo a sonificazione per 10 minuti. Dopo la sonificazione, aggiungere al tubo da centrifuga 2,5 millilitri di una soluzione acquosa a pH 7 contenente tris 50 millimolare e cloruro di sodio 1 molare.

Dopo aver agitato il campione al vortex e averlo sottoposto nuovamente a sonica, centrifugarlo per cinque minuti a 1200 ×g. Al termine, trasferire con attenzione la fase inferiore di cloroformio in un tubo di vetro pulito utilizzando una pipetta di vetro, quindi ripetere l'estrazione con un millilitro di cloroformio. Al termine, raccogliere la fase di cloroformio mediante una pipetta di vetro e unirla alla prima frazione di cloroformio.

Fare evaporare il cloroformio utilizzando un flusso di gas azoto per ottenere i lipidi estratti essiccati. Successivamente, aggiungere tre millilitri di metanolo contenente l'5% di acido solforico al tubo contenente i lipidi estratti essiccati e chiuderlo ermeticamente. Vortexare il campione per cinque secondi.

Incubare i campioni per tre ore a 70 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Controllare periodicamente che i campioni non stiano bollendo ed eseguire un vortex del tubo ogni volta che si verifica lo stato dei campioni. Una volta che il campione si è raffreddato a temperatura ambiente, aggiungere al tubo tre millilitri di acqua milli-Q e tre millilitri di n-esano, seguiti da un mescolamento con vortex.

Agitare il campione per 15 minuti utilizzando un rotatore per provette. Dopo aver rimosso i campioni dal rotatore per provette, centrifugarli per cinque minuti a 1200 G. Utilizzando una pipetta di vetro, raccogliere due millilitri della fase superiore di esano e trasferirli in una provetta di vetro pulita. Per lavare la fase di esano raccolta, aggiungere due millilitri di acqua milli Q nella provetta di vetro.

Quindi vortexare il campione per cinque secondi e centrifugare per cinque minuti. A 1200 G, trasferire la fase di esano dal tubo di vetro in un vial per GC utilizzando una pipetta Pasteur di vetro. Quindi posizionare un tappo sul vial per GC e avvitarlo bene per prevenire l'evaporazione del solvente.

Posizionare il flacone del campione nel campionatore automatico dello strumento GC. Infine, eseguire l'analisi del campione sullo strumento utilizzando una nuova colonna con una portata totale di 20 millilitri al minuto e un volume di iniezione di un microlitro. Per le specifiche della colonna e le condizioni cromatografiche, consultare il protocollo scritto.

Di seguito è riportato un cromatogramma tipico ottenuto con questo processo. Gli esteri metilici degli acidi grassi vengono separati in base alla dimensione e al grado di saturazione dalla colonna GC; con il protocollo utilizzato, gli acidi grassi a catena più corta e quelli più saturi presentano tempi di ritenzione più brevi. La colonna GC e il protocollo impiegati non sono pensati per separare gli isomeri degli acidi grassi, ma ciò potrebbe essere ottenuto utilizzando una colonna GC e un protocollo differenti.

Il contenuto e la composizione di acidi grassi di C Desus UEX 3 93 in condizioni di sufficiente e insufficiente azoto sono mostrati qui. I contenuti totali di acidi grassi sono stati 8,6 ± 0,5% e 44,7 ± 1,7% rispettivamente in condizioni di coltivazione con azoto sufficiente e in carenza di azoto. Questi valori dimostrano che la composizione e il contenuto di acidi grassi sono fortemente influenzati dalla carenza di azoto.

In ESBL, l'acido palmitico e l'acido oleico sono i due acidi grassi più abbondanti. Per i dettagli sul calcolo del contenuto e della composizione degli acidi grassi, consultare il protocollo testuale. Qui vengono mostrati il contenuto e la composizione degli acidi grassi di Odum Trico UEX 6 4 0 in condizioni di sufficiente e limitata disponibilità di azoto.

Come per gli UU obliqui, il contenuto e la composizione di acidi grassi sono fortemente influenzati dalla carenza di azoto. In condizioni di azoto sufficiente e in condizioni di privazione, i contenuti totali di acidi grassi sono stati rispettivamente del 11,7 ± 0,9% e del 30,5 ± 1,1%. P. trium produce anche quantità rilevanti di acidi grassi altamente insaturi, come I csap e acido penta IC.

Inoltre, anche acidi grassi a catena molto lunga come l'acido lignero possono essere rilevati con questo metodo. La procedura può essere estesa includendo un passaggio di separazione del coagulo lipidico tra l'estrazione dei lipidi e il passaggio di transesterificazione, al fine di ottenere ulteriori informazioni sulla composizione delle classi lipidiche del micro LG, come descritto nelle referenze nel testo del protocollo.