Name: Biosensori MIL Tale misura mitocondriale stato redox e ATP in cellule viventi di lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Scopri come misurare lo stato redox mitocondriale e i livelli di ATP in cellule di lievito viventi utilizzando biosensori ratiometrici a GFP. Questo metodo offre risoluzione subcellulare per analisi dettagliate.

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Questo lavoro è stato sostenuto da premi da HHMI 56006760 a JDV, il National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) a DMAW, e dal Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) e del NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) a LP. GM45735S1 è stato emesso dal NIH nell&#39;ambito del Recovery and Reinvestment Act del 2009. I microscopi utilizzati per questi studi sono stati finanziati in parte attraverso un NIH / NCI concessione (5 P30 CA13696).

1. Trasformazione di cellule di lievito con i biosensori <ol><li> Trasforma il ceppo di lievito desiderato con cuscinetto plasmide mito-roGFP o mitGO-ATeam2 con il metodo acetato di litio 27. </li><li> Per confermare la trasformazione con il biosensore plasmide-borne e per evitare la perdita del plasmide, selezionare e mantenere trasformanti sul appropriato terreno selettivo completo sintetico (SC-Ura di mito-roGFP, o SC-Leu per mitGo-ATeam2). Se la sonda fluorescente è stato subclonato in un plasmide diversa da quelle qui descritte, utilizzare il terreno selettivo appropriato. Visualizza trasformanti mediante microscopia a fluorescenza per confermare che essi esprimono il biosensore fluorescente ed esporre normale morfologia mitocondriale. </li></ol> 2. Crescita delle cellule e preparazione per l&#39;imaging Funzione delle cellule e la risposta al trattamento farmacologico sono altamente dipendenti dalla densità cellulare e l&#39;attività metabolica. I migliori risultati si ottengono quando le cellulestanno dividendo attivamente (fase mid-log, ~ 0,5-1 x 10 7 cellule / ml). Il modo più affidabile per generare metà log fase culture di densità costante è per inoculare da una fase stazionaria di pre-cultura. <ol><li> Preparare una fase stazionaria di pre-cultura: scegliere una singola colonia di cellule trasformate da un piatto e inoculare i terreni liquidi selettivi (5 ml in una provetta a fondo conico 50). Crescere a 30 ° C con agitazione a 225 rpm finché la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) ha raggiunto un plateau (24-48). </li><li> Preparare una cultura fase mid-log per l&#39;osservazione: utilizzare l&#39;appropriato volume di pre-cultura per inoculare 5 ml di terreno selettivo in una provetta a fondo conico 50. YPD media è autofluorescente e non deve essere usato per questi studi. Usa, glucosio basato, dropout (SC-Ura) mezzi completi sintetici. Crescere le cellule a 30 ° C, agitando a 225 giri al minuto, per 4-16 ore, fino a raggiungere fase di mid-log (~ 0,5-1 x 10 7 cellule / ml). Densità cellulare può essere determinatamisurando OD 600; calibrare lo spettrofotometro per determinare il corretto OD 600 lettura. Sul nostro Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), metà fase log corrisponde ad un OD 600 di 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 sensi fluttuazioni del organello in risposta ai cambiamenti metabolici. Per esempio, in questo saggio mitocondriali modifiche dello stato redox quando il lievito crescere su fonti di carbonio fermentabili (ad esempio glucosio, come in SC media) rispetto a fonti di carbonio non fermentescibili (ad esempio glicerolo, come in SGlyc media), e anche in diverse partite della stessa media. Pertanto, utilizzare lo stesso lotto di terreno, per tutti gli esperimenti. <ol start="3"><li> Cellule sono pronte per la concentrazione (vedi punto 2.4) e l&#39;imaging se nessun trattamento è in corso. Se le cellule vengono trattate, incubare le cellule con il trattamento desiderato e proseguire alla fase successiva. </li><li> Concentrare 1 ml di coltura mediante centrifugazione a 6000 xg per 15 sec erisospensione del pellet cellulare in 20 l di media. Queste condizioni massimizzare il numero di cellule distinguibili nel campo di vista. </li><li> Applicare 2 ml delle cellule risospese ad una diapositiva. Coprire con un vetrino coprioggetto (n. 1.5, preferibilmente ad alte prestazioni 170 ± 5 micron di spessore), e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente o valap (vedi Reagenti). Per sigillare con valap, fondere una piccola quantità su una spatola metallica tenendolo su un becco Bunsen, poi diffondere una piccola quantità lungo i bordi del coprioggetto. </li><li> Mantenere le cellule a 30 ° C durante l&#39;imaging. Un riscaldatore obiettivo sul 100x obiettivo a immersione in olio utilizzato per l&#39;imaging funziona bene per questa applicazione. In queste condizioni, la morfologia mitocondriale, stato redox e livelli di ATP rimangono invariati durante l&#39;imaging per 10-15 min. </li></ol> 3. Setup Imaging <ol><li> Impostazione per l&#39;imaging mito-roGFP1 su un ampio campo di microscopio a fluorescenza I passi qui sono su misura per il AxioObserver.Z1 microscopio dotato di un LED sorgente di eccitazione Colibri, un grande campo Orca ER fotocamera e software di acquisizione AxioVision. Fotodecolorazione di entrambi i canali e le foto conversione di ossidati mito-roGFP1 è ridotto in modo significativo utilizzando l&#39;illuminazione a LED rispetto a vapori di mercurio illuminazione lampada (vedi sotto). Per massimizzare il segnale e la risoluzione, utilizzare la più alta apertura numerica possibile l&#39;obiettivo, e l&#39;ingrandimento più basso che fornisce sufficiente risoluzione spaziale. Inoltre, per i mito-roGFP di imaging, verificare che l&#39;obiettivo trasmette bene a 365 nm. Il 100x/1.3NA CE PlanNeofluar obiettivo (Zeiss) funziona bene per questa applicazione. Configurare il software di acquisizione per catturare le specie di mito-roGFP1 ossidato e ridotto. Usiamo le seguenti condizioni. <ol><li> Configurare il canale per ossidato mito-roGFP utilizzare eccitazione a 365 nm (100% di energia LED) e un filtro di emissione adatto per GFP, come il 38 HE filtra set (Zeiss), con la excitatio inclusofiltro n rimossa dal cubo. Rimozione del filtro di eccitazione consente di eccitazione a 365 nm entrambi e 470 nm, senza la necessità di cambiare i filtri, aumentando così risoluzione temporale realizzabile. </li><li> Configurare il canale per ridotta mito-roGFP utilizzare eccitazione a 470 nm (100% di potenza del LED) e, come già detto, lo stesso cubo filtro per le emissioni utilizzato per la ossidato mito-roGFP. Impostare la fotocamera in binning 1x1 per ottimizzare la risoluzione spaziale. </li><li> Impostare il software per l&#39;acquisizione pila az composta da 11 fette con spaziatura 0,5 micron, la raccolta di entrambi i canali in ogni posizione z. Questa modalità di acquisizione è più lenta di acquisire ogni pila z a turno, ma impedisce artefatti derivanti dal movimento mitocondriale tra acquisizione dei canali ossidato e ridotto. </li><li> Immagini diverse celle per determinare un tempo di esposizione appropriato, producendo un segnale forte ma non saturante. È importante mantenere il rapporto di tempi di esposizione per ossidata e ridotta mito-roGFP1 per tutti esperimentos. Per esempio, se i tempi di esposizione per ossidati e ridotti mito-roGFP1 sono 300 e 100 msec, allora il tempo di esposizione per ossidato mito-roGFP1 dovrebbe essere di 3 volte che per ridurre mito-roGFP per tutti gli esperimenti. </li></ol></li><li> Impostazione per l&#39;imaging mitGO-ATeam2 su un microscopio confocale spettrale Per quantificare i livelli di ATP utilizzando mitGO-ATeam2, la fluorescenza di GFP (emissione di massimo 510 nm) deve essere distinto da quello di OFP (emissione massima 560 nm). Ci sono fluorescenza set di filtri che risolvono la fluorescenza emessa da questi fluorofori. Tuttavia, troviamo che un rivelatore spettrale, disponibile su microscopi a scansione confocale molti laser, funziona meglio per questa applicazione. Un rivelatore spettrale separa l&#39;emissione di fluorescenza in molti componenti (tipicamente 32 o più) secondo la lunghezza d&#39;onda. Diverse bande di lunghezza d&#39;onda adiacenti possono essere combinati in un canale dell&#39;immagine. Le lunghezze d&#39;onda per essere combinati sono selezionati empiricamente in modo da massimizzare il segnale da GFP e OFP, evitando di crossover di segnale che potrebbero confondere la misura FRET. Usare la massima apertura numerica della lente disponibile. Usiamo un 100x/1.49 o 60x/1.49 obiettivo Apo-TIRF. Usiamo la Nikon A1R microscopio confocale in esecuzione il software NIS Elements. Configurare il software di acquisizione per catturare le specie mitGO-ATeam2 ATP-bound e ATP-non legato. Usiamo le seguenti condizioni. <ol><li> Impostare pinhole a 1.0 unità di Airy (AU), che sul nostro sistema corrisponde alla risoluzione az di circa 0,42 micron. </li><li> Impostare scansione zoom per avvicinarsi al limite di campionamento di Nyquist, che consentirà di massimizzare l&#39;informazione territoriale nella immagine. Sul nostro sistema la dimensione dei pixel è 0,12 micron. </li><li> Poiché i mitocondri possono muoversi durante l&#39;imaging, può essere utile per aumentare la velocità di imaging da ritaglio il campo a 512 x 256 pixel. Il tempo totale richiesto per immagine di un frame nel nostro sistema è di 1,0 sec, compresa una media di scansione 2 volte. A seconda della risoluzione spaziale desiderata, il campo può essere ulteriormente tagliata per aumene risoluzione temporale. </li><li> Excite a 488 nm, e raccogliere emissione 500-520 nm per GFP, e 550-580 nm per OFP. Valori ottimali effettivi possono variare le caratteristiche del sistema di imaging. </li><li> La potenza del laser ottimale per il nostro sistema è compresa tra 6,0 e 6,4%. La potenza del laser ottimale varia per ogni sistema di microscopio, ma sarà idealmente essere la più bassa possibile, pur producendo un&#39;immagine interpretabile. Utilizzare un misuratore di potenza interno o esterno per monitorare l&#39;andamento del potere del laser, che si verificano normalmente nel corso del tempo in un sistema ottico. </li><li> Regolare il guadagno del rivelatore e l&#39;intensità della luce di illuminazione per massimizzare l&#39;intervallo di valori di pixel rilevato ma evitare di saturare il segnale, per altrettanti possibile di cellule. Non analizzare eventuali cellule contenenti più del 1% pixel saturi. Immagine tutti i campioni con lo stesso obiettivo, potenza del laser, scansione zoom, dimensione dei pixel, guadagno e offset. </li></ol></li></ol> 4. Acquisizione di immagini <ol><li> Individuare il pla focale<html> ne di cellule di interesse con luce trasmessa per minimizzare la sbianca sonda fluorescente. </li><li> Dopo aver individuato una o più celle di interesse, raccogliere una serie z attraverso tutta la profondità di una tipica cellula (circa 7 micron) utilizzando una dimensione di passo di 0,5 micron. </li><li> Immagine altre cellule di interesse sulla diapositiva, ma non una immagine singola diapositiva per più di 15 min. Dopo 15 min sulla diapositiva, le cellule perdono la vitalità. </li></ol> 5. Analisi ATP mitocondriale livello è determinato misurando il rapporto dell&#39;emissione mitGO-ATeam2 a 560 nm a 510 nm che a 27 Lo stato redox della organello viene misurato come ridotto a ossidato (R / O) rapporto di mito-roGFP;. Ie emissione a 510 nm su di eccitazione a 470 nm divisa per emissione a 510 nm su di eccitazione a 365 nm. Prima di calcolare il rapporto, sottraiamo fondo e determinare un valore soglia per pixel appartenenti al fluorescente mitocondri. tenda &quot;&gt; dominio pubblico (ad es ImageJ 30) o disponibile in commercio (ad es Volocity, Perkin-Elmer) software può essere utilizzato per l&#39;analisi di mito-roGFP1 o mitGO-ATeam2. seconda del software utilizzato per l&#39;acquisizione delle immagini e di analisi, le immagini può prima devono essere convertiti in un altro formato, come TIFF, prima di aprire nel software di analisi. Se le immagini vengono convertite, è essenziale verificare che i valori dei pixel non vengono modificati durante la conversione. Analisi di Mito-roGFP1 dati, utilizzando entrambi i programmi è descritto di seguito. menu del programma e le opzioni da selezionare all&#39;interno di ciascun menu sono evidenziate in corsivo grassetto. 5.1 analisi ImageJ <ol><li> Aprire le immagini e il cambiamento di tipo a 32 bit: Immagine → Tipo → 32 bit. </li><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) in una zona dove non ci sono le cellule. Calcolare l&#39;intensità media in questo ROI: Analizzare → Misura. </li><li> Sottrarre il fondo medio calcolato dalla pila: Processo → Matematica → Sottrai. </li><li> Utilizzando la sottratto z-stack, trovare la fetta centrale e la soglia di mitocondri: Immagine → Regola → Soglia e fare clic su Applica nella finestra di Threshold. Applica a tutte le sezioni della pila. Selezionare Imposta pixel di sfondo a NaN. </li><li> Creare il rapporto z pila: Processo → Calcolatrice Immagine dividere la pila ridotta dallo stack z ossidato per l&#39;analisi di mito-roGFP1. Dividere l&#39;immagine 560 nm (ATP bound) dai 510 nm di immagine (ATP legato) per l&#39;analisi mitGO-ATeam2. </li><li> Disegnare un ROI intorno alla zona di interesse. Scegliere Analizza → Strumenti → ROI Manager e fare clic su Aggiungi per registrare il ROI. Regioni multiple possono essere memorizzati nel gestore. In ROI Manager, selezionare tutte le ROI, quindi scegliere Mminerale → Multi-Misura per misurare tutte le fette di stack. Esportare i dati in un foglio di calcolo per l&#39;analisi. </li></ol> 5.2 analisi Volocity <ol><li> Importare le immagini in una libreria Volocity e creare una sequenza di immagini a 2 canali. </li><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) in una zona dove non ci sono le cellule. Scegli: Strumenti → Rapporto. </li><li> Utilizzare Volocity per calcolare il fondo: ottenere da ROI. </li><li> Regolare la soglia per includere strutture mitocondriali. </li><li> Verificare la possibilità di applicare una LUT arcobaleno al canale rapporto. Il canale intensità modulata può produrre un&#39;immagine meno rumorosa per presenta-zione, ma non dovrebbe essere utilizzato per la quantificazione del rapporto medio. </li><li> Selezionare la scheda di misura, selezionare il canale di rapporto e disegnare un ROI intorno alla zona di interesse. Misurare il canale di rapporto, escludendo i valori zero. Regioni multipli possono essere selezionati e valutatiallo stesso tempo. Esportare i dati in un foglio di calcolo per l&#39;analisi. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui, descriviamo i metodi da utilizzare mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 come biosensori per valutare mitocondriale stato redox e livelli di ATP in cellule di lievito vive. Troviamo che l&#39;espressione del plasmide-borne mito-roGFP1 o mitGO-Ateam risultati in quantitativa mira a mitocondri, senza alcun effetto evidente sulla morfologia o la distribuzione mitocondriale o sui tassi di crescita cellulari. 3 Mito-roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale da molto ossidato a stati fortemente ...

I mitocondri sono organelli essenziali per la produzione di ATP, la biosintesi di aminoacidi, acidi grassi, ferro eme, ammassi di zolfo e pirimidine. I mitocondri svolgono anche un ruolo fondamentale nell&#39;omeostasi del calcio e nella regolazione dell&#39;apoptosi. 1 crescenti prove link mitocondri di invecchiamento e malattie legate all&#39;età come il morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica, e la malattia di Huntington. 2 Mentre gli individui vivono tutta la loro vita con mutazioni nelle proteine ​​mitocondriali che sono associate con malattie neurodegenerative, i sintomi della malattia si verificano solo tardi nella vita. Questo indica che i cambiamenti avvengono nei mitocondri con l&#39;età che permettono malattia patologia ad emergere. Infatti, fitness mitocondriale è correlata con la salute generale delle cellule e la durata della vita nei lieviti e cellule di mammifero. 3,4 Qui, descriviamo come utilizzare biosensori fluorescenti geneticamente codificati, raziometriche per valutare due aspetti critici della Mitochondria in cellule di lievito vive: stato redox e livelli di ATP. Funzione mitocondriale in aerobico mobilitazione energia è ben stabilita. Stato redox mitocondriale è un prodotto di ossidanti e riducenti specie nel organello, compresi NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatione / glutatione disolfuro (GSH / GSSG) e specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS). Sganciamento mitocondri o ipossia interessa l&#39;attività respiratoria mitocondriale e altera il rapporto di NAD + in NADH in organello. ROS, che sono prodotte dal trasferimento di elettroni inefficiente tra i complessi della catena di trasporto degli elettroni nella membrana mitocondriale interna, così come dalla deaminazione di amine tramite monoamino-ossidasi nella membrana mitocondriale esterna 5, lipidi danni, proteine ​​e acidi nucleici e hanno stato collegato a invecchiamento e le malattie neurodegenerative associate all&#39;età 6,7,8. ROS anche svolgere un ruolo nella trasduzione del segnale in mitochondria, attraverso l&#39;ossidazione di GSH. Ad esempio, NADH deidrogenasi contribuisce non solo alla produzione di ROS, ma anche è regolata attraverso le interazioni con il pool di glutatione 9,10. deidrogenasi α-chetoglutarato e aconitasi, componenti del ciclo TCA, mostrano un&#39;attività ridotta in ambienti ossidanti 11,12. Infatti, regolazione redox-dipendente di attività aconitasi è conservato dai batteri ai mammiferi 13,14. Pertanto, il monitoraggio dello stato redox e livelli di ATP di mitocondri è fondamentale per capire la loro funzione e il ruolo nella malattia di patologia. Metodi biochimici sono stati utilizzati per valutare lo stato redox o livelli di ATP di cellule intere o mitocondri isolati. I metodi utilizzati per valutare lo stato redox delle cellule intere o mitocondri isolati si basano sulla misurazione dei livelli della coppia redox GSH / GSSG 15. Il sistema luciferina-luciferasi viene comunemente utilizzato per misurare mitocondrialeLivelli di ATP nelle cellule intere sia permeabilizzate o mitocondri isolati. 16,17,18,19,20 In questo saggio, luciferasi lega alla ATP e catalizza l&#39;ossidazione di chemiluminescenza e dalla luciferina. 21 L&#39;intensità della luce emessa è proporzionale alla quantità di ATP nella miscela di reazione. 22 Questi metodi hanno rivelato informazioni fondamentali riguardanti la funzione mitocondriale, tra cui la constatazione che i pazienti con malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, hanno livelli anormalmente bassi di ATP. 23 Tuttavia, essi non possono essere usati a vivere immagine, cellule intatte. Inoltre, metodi basati su analisi a cellule forniscono una media di stato redox o livelli di ATP in tutti i compartimenti della cellula. Misure in organelli isolati sono potenzialmente problematico perché mitocondriale stato redox o livelli di ATP possono cambiare durante il frazionamento subcellulare. Infine, recenti studi del nostro laboratorio e altri indicano chemitocondri all&#39;interno delle singole celle sono eterogenei in funzione, che a sua volta influenza la durata della vita delle cellule madre e figlia. 3 Quindi, vi è la necessità di misurare i livelli di ATP mitocondriale e lo stato redox nelle cellule viventi con risoluzione sub-cellulare. I biosensori per la funzione mitocondriale descritti qui sono entrambi basati su GFP. GFP redox-sensibile (roGFP) 24,25 è una variante di GFP in cui superficie esposti cisteine ​​vengono aggiunti alla molecola. roGFP, come wild-type GFP, ha due picchi di eccitazione (a ~ 400 nm e 480 nm ~) e un picco di emissione a ~ 510 nm. Ossidazione dei residui di cisteina nei risultati roGFP in un aumento di eccitazione a 400 nm. Riduzione di quei cisteine ​​favorisce eccitazione a ~ 480 nm. Perciò, il rapporto di 510 nm di emissione di roGFP upon eccitazione a 480 nm e 400 nm rivela la quantità relativa di ridotta e ossidata roGFP, che riflette lo stato redox dell&#39;ambiente del fluoroforo. Due versioni di roGFP sono ampiamente utilizzati: roGFP1 e roGFP2. Entrambi contengono gli stessi inserimenti cisteina. roGFP1 è basato sulla GFP wild-type e roGFP2 si basa su S65T GFP, che ha più efficiente eccitazione a 480 nm e meno efficiente eccitazione a 400 nm rispetto al wtGFP 24. roGFP1 pH è meno sensibile rispetto roGFP2 e la sua gamma dinamica prosegue nel range ridotto. Così, roGFP1 può essere più utile per monitorare comparti più riducenti come i mitocondri e il citosol, e scomparti con pH variabile, come endosomi. roGFP2 offre segnale luminoso e, in alcuni studi, una più ampia gamma dinamica rispetto roGFP1 24,26. Studi in Arabidopsis thaliana indicano che il tempo necessario per rispondere alle variazioni di stato redox è simile per entrambi i sensori (t ½ per l&#39;ossidazione, 65 e 95 sec e t ½ per la riduzione, 272 e 206 sec, per roGFP1 e roGFP2, rispettivamente). 26 MitGO-ATeam2 è un mini-invasiva, affidabilesensore che misura ATP mitocondriale nella nascente lievito Saccharomyces cerevisiae. GO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda che consiste della subunità ε della F o F 1-ATP sintasi FRET sandwich tra donatore e accettore proteine ​​fluorescenti (GFP e arancio proteina fluorescente (OFP), rispettivamente). 27 legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il FRET donatore in prossimità del accettore e il trasferimento di energia dal donatore accettore. Ci sono due varianti di GO-Ateam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 ha una maggiore affinità per MgATP rispetto GO-ATeam1, rendendolo più adatto per misurare l&#39;tipicamente inferiore [ATP] nei mitocondri rispetto al citosol. 27 Per sondare stato redox mitocondriale, abbiamo costruito una proteina di fusione (mito-roGFP1) costituito roGFP1 fusa alla sequenza leader di un ATP9nd espressa da un&#39;espressione lievito centromero-based (basso numero di copie) plasmide sotto controllo del forte deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GPD) promotore (p416GPD, Addgene). Abbiamo usato roGFP1 per sondare lo stato redox dei mitocondri nel contesto di invecchiamento del modello fungo Saccharomyces cerevisiae. Troviamo che roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale che si verificano durante l&#39;invecchiamento e in risposta alla disponibilità di nutrienti, ma non ha alcun effetto negativo sulla apparente cellule di lievito. Vediamo anche la variabilità dello stato redox dei mitocondri all&#39;interno delle singole cellule di lievito viventi, un risultato che sottolinea l&#39;importanza di un biosensore con subcellulare risoluzione spaziale. MitGO-ATeam2 è una variante del GO-ATeam2, che ha la sequenza segnale mitocondriale di citocromo c ossidasi subunità VIII inserito al terminale amminico di GO-ATeam2 27. Abbiamo modificato la sonda mitGO-ATeam2 (gentilmente fornite dal laboratorio di H. Noji, Istituto of Ricerca Scientifica e Industriale, Università di Osaka, Giappone) per l&#39;uso nel lievito da subclonaggio esso, tramite Xba1 e siti HindIII, nel vettore di espressione di lievito pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), che è un low-copia plasmide contenente il promotore costitutivo forte GPD. Abbiamo espresso mitGO-ATeam2 in lievito in erba, e troviamo, dalla controcolorazione con il colorante DAPI legame al DNA, che si localizza esclusivamente ai mitocondri, dove serve come una sonda efficace per misurare i cambiamenti fisiologici nei livelli di ATP mitocondriale. roGFP e GO-Ateam sono entrambi geneticamente codificati. Come risultato, essi possono essere introdotti e mantenuti stabilmente in cellule intatte, e forniscono informazioni su stato redox o livelli di ATP in singole, cellule viventi. Inoltre, entrambi i biosensori monitorare i cambiamenti di stato redox o livelli di ATP che si verificano in condizioni fisiologiche. 28 Entrambe le sonde sono anche ratiometrica. Come risultato, le misurazioni effettuate con queste sonde non risentono chaNGES nella concentrazione biosensore o l&#39;illuminazione del campione o spessore. Infine, entrambi i biosensori forniscono subcellulare risoluzione spaziale. Infatti, roGFP è stato preso di mira da mitocondri, ER, endosomi e perossisomi 24, e in grado di rilevare i cambiamenti di stato redox di ciascuno di questi organelli, in gran parte indipendenti di pH.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>1397-94-0</td><td>Disciolto in etanolo in una soluzione madre da 2 mg/ml.</td></tr><tr><td>Terreno di crescita del lievito SGlyc (a base di glicerolo sintetico) *omettere per SGlyc-Ura **omettere per SGlyc-Leu</td><td></td><td></td><td>Dissolvere in H2O. Regolare il pH a 5,5 con NaHCO3. Autoclave. Ingredienti: 0,67% Base azotata di lievito senza aminoacidi 3% Glicerolo 0,05% Glucosio 2 mg/ml adenina 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginina 1 mg/ml L-istidina 1 mg/ml L-leucina** 3 mg/ml L-lisina 2 mg/ml di L-metionina 4 mg/ml di L-fenilalanina 2 mg/ml di L-triptofano 3 mg/ml di L-tirosina</td></tr><tr><td>SC (sintetico completo, a base di glucosio) terreno di coltura del lievito *omettere per SGlyc-Ura **omettere per SGlyc-Leu</td><td></td><td></td><td>Sciogliere in H2O. Regolare il pH a 5,5 con NaHCO3. Autoclave. Ingredienti: 0,67% Base azotata di lievito senza aminoacidi 3% Glucosio 2 mg/ml adenina 2 mg/ml uracile* 1 mg/ml L-arginina 1 mg/ml L-istidina 1 mg/ml L-leucina** 3 mg/ml L-lisina 2 mg/ml L-metionina 4 mg/ml di L-fenilalanina 2 mg/ml di L-triptofano 3 mg/ml di L-tirosina</td></tr><tr><td>Valap</td><td></td><td></td><td>Combina gli ingredienti in un rapporto 1:1:1 (w:w:w). Sciogliere immergendolo in un 70 &deg; C H2O bagno. Aliquotare in piastre di Petri di vetro. Conservare a temperatura ambiente. Ingredienti: vaselina vaselina, paraffina dura, lanolina</td></tr><tr><td>...</td><td></td><td></td><td>Attrezzature e software</td></tr><tr><td>Prepulito Gold Seal Rite-on Micro Slides</td><td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td><td>3050</td><td>Dimensioni: 25 x 75 mm; Spessore: da 0,93 a 1,05 mm</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti ad alte prestazioni, n. 1,5, 18x18 mm</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>474030-9000-000</td><td>Questi sono meno variabili in spessore (170&plusmn; 5 &mu; m) rispetto ai vetrini coprioggetti standard, riducendo l'aberrazione sferica e migliorando le prestazioni di imaging 3D</td></tr><tr><td>Fisherbrand Vetro di copertura per microscopio, n. 1,5</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td><td>12-545E</td><td>Dimensioni: 22 x 22 mm, n. 1,5 spessore (170 &mu; m)</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser A1 con rivelatore spettrale e obiettivo 100x/1.49 NA Apo-TIRF</td><td>Nikon (Melville, NY)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio AxioObserver.Z1 equipaggiato con un obiettivo 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) e telecamera CCD raffreddata Orca ER (Hamamatsu) e controllato dal software Axiovision</td><td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Città di Hamamatsu, Giappone)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini 3D Volocity</td><td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td><td></td><td>Modulo di restauro per la deconvoluzione; Modulo di quantificazione per il calcolo e la misurazione del rapporto</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr></tbody></table>

biosensori mil tale misura mitocondriale stato redox e atp in cellule viventi di lievito

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

I mitocondri hanno ruoli in molti processi cellulari, dal metabolismo energetico e l&#39;omeostasi del calcio per controllare di vita cellulare e morte cellulare programmata. Questi processi influenzano e sono influenzate dallo stato redox e della produzione di ATP dai mitocondri. Qui, descriviamo l&#39;uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati che possono rilevare mitocondriale stato redox e livelli di ATP a risoluzione sub-cellulare in cellule di lievito vive. Stato redox mitocondriale è misurata utilizzando redox-sensibili proteina fluorescente verde (roGFP), che si rivolge alla matrice mitocondriale. Mito-roGFP contiene cisteine ​​nelle posizioni 147 e 204 della GFP, che subiscono ossidazione e riduzione reversibile e ambiente-dipendente, che a sua volta altera lo spettro di eccitazione della proteina. MitGO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda in cui la subunità ε della F o F 1-ATP sintasi è inserita tra FRET donatore e accettore fluoproteine ​​centi. Legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il donatore e accettore FRET in stretta vicinanza e per consentire il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza dal donatore al accettore.

Misurare stato redox mitocondriale con mito-roGFP Qui, dimostriamo che mito-roGFP1 ha la gamma dinamica per rilevare cambiamenti di stato redox mitocondriale da completamente ossidato a ridotto in cellule di lievito vive, senza influenzare la crescita delle cellule di lievito o la morfologia mitocondriale. In primo luogo, troviamo cellule che esprimono GFP mitocondri mirati e roGFP1 crescono a ritmi normali (Figura 1A). Il tasso di crescita massimo, misurato dalla massima pende...

Descriviamo l&#39;uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati, che si basano sulla GFP, per monitorare lo stato redox mitocondriale e livelli di ATP a risoluzione subcellulare in vita cellule di lievito.

Biosensori MIL Tale misura mitocondriale stato redox e ATP in cellule viventi di lievito

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la funzione mitocondriale in cellule di lievito viventi utilizzando due varianti di proteina fluorescente verde o GFP. La GFP con rilevamento redox contiene cistine esposte in superficie, che subiscono un'ossidazione e una riduzione reversibili e dipendenti dall'ambiente, alterando lo spettro di eccitazione della fila di proteine ridotte. La GFP ha un'eccitazione massima a 470 nanometri, mentre la GFP a righe ossidate ha una maggiore carenza di eccitazione a 365 nanometri.Lo stato di redoc è misurato come emissione RO GFP a 470 nanometri di eccitazione rispetto all'emissione RO GFP a 365 nanometri di eccitazione go A team è una sonda fret in cui la subunità epsilon della F zero F1 A TP sintasi è inserita tra un GFP donatore di fret e una proteina fluorescente arancione accettore di fret o OFP il legame di un TP alla subunità epsilon provoca cambiamenti di conferma nella proteina che portano Il donatore e l'accettore FRET nelle immediate vicinanze, consentendo il trasferimento di energia dal donatore all'accettore. I livelli di TP A vengono quindi misurati come l'emissione OFP dopo eccitazione a 488 nanometri rispetto all'emissione GFP dopo eccitazione a 488 nanometri. Si ottengono risultati che monitorano i cambiamenti nello stato redox o nei livelli di TP che si verificano in condizioni fisiologiche.Il vantaggio principale di questi metodi rispetto ai metodi esistenti è che la GFP stradale e vai. Un team è geneticamente codificato e può essere introdotto e mantenuto stabilmente nelle cellule viventi. Di conseguenza, possono essere utilizzati per misurare lo stato redox mitocondriale e un TP nelle cellule viventi senza influire sulla fitness delle cellule o degli organelli.Entrambe le sonde monitorano i cambiamenti nello stato redox o nei livelli di TP in condizioni fisiologiche. Di conseguenza, entrambe le sonde sono anche metriche di rapporto. Le misure effettuate con queste sonde non sono influenzate dalle variazioni della concentrazione del biosensore o dell'illuminazione o dello spessore del campione.Entrambi i biosensori forniscono una risoluzione a livello dei singoli organelli. Infatti, le varianti RO GFP sono state prese di mira per mitocondri, er, endosomi e perossisomi dove hanno rilevato cambiamenti nello stato redox, in gran parte indipendenti dal pH. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave in campi riguardanti il controllo della qualità mitocondriale e come i mitocondri cambiano con l'età.La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto i passaggi di soglia e rapporto durante l'analisi dell'immagine sono difficili e devono essere eseguiti utilizzando linee guida definite coerenti per iniziare questa procedura. Eseguire la trasformazione del lievito con i biosensori come descritto nel protocollo di testo. Far crescere le cellule fino alla fase di log medio in cinque millilitri di terreno di caduta completo selettivo in un tubo a fondo conico da 15 millilitri.Utilizza lo stesso batch di file multimediali per tutti gli esperimenti. Dopo aver concentrato un millilitro di coltura a 20 microlitri, applicare due microlitri di cellule risospese su un vetrino e coprire le cellule con un vetrino coprioggetti. Quindi sciogliere una piccola quantità di VAP su una spatola metallica e stendere lungo i bordi del vetrino coprioggetto per sigillare.In alternativa, lo smalto trasparente può essere utilizzato per l'imaging mito RO GFP one su un microscopio fluorescente ad ampio campo. Utilizzare un obiettivo con la più alta apertura numerica possibile che trasmetta la luce a 365 nanometri come il piano 100 x 1,3 NA EEC. Obiettivo Neo Fluor.Configura il microscopio per eccitare a 365 e 470 nanometri per rilevare rispettivamente la GFP della fila di mitter ossidata e ridotta. Utilizzare i LED per modificare la lunghezza d'onda di eccitazione e un cubo filtro di emissione adatto per GFP. Con il filtro di eccitazione rimosso, impostare la telecamera su una per una per una risoluzione spaziale ottimale.Quindi, imposta il software per acquisire uno Zack composto da 11 fette con spaziatura di 0,5 micrometri, raccogliendo entrambi i canali in ogni posizione Z. Localizzare il piano focale delle cellule utilizzando la luce trasmessa per ridurre al minimo lo sbiancamento della sonda fluorescente. Quindi raccogli una serie Z attraverso l'intera profondità di una cella tipica utilizzando un passo di 0,5 micrometri per l'impostazione per l'imaging.Potrebbe andare una squadra due su un microscopio confocale spettrale. Usa l'obiettivo con l'apertura numerica più alta disponibile qui. Viene utilizzata una lente per tappeto erboso APO 100 x 1,49.Configura il microscopio per eccitare una squadra di migo a due a 488 nanometri e raccogliere l'emissione da 500 a 520 nanometri per un TP legato e da 550 a 580 nanometri. Per un TP moduli non associati. I valori ottimali effettivi possono variare in base alle caratteristiche del sistema di imaging.Impostare il foro stenopeico su 1,0 unità di area, quindi impostarlo. Eseguire lo zoom di scansione per avvicinarsi al limite di campionamento di Nyquist. Per aumentare la velocità di imaging, ritaglia il campo a 512 x 256 pixel.Se necessario, utilizzare la media di scansione per ridurre il rumore. Utilizzare la minor potenza laser possibile pur producendo un'immagine interpretabile. Utilizzare un misuratore di potenza interno o esterno per monitorare le variazioni della potenza del laser che si verificano normalmente nel tempo in qualsiasi sistema ottico.Regola il guadagno del rivelatore e l'intensità dell'illuminazione per massimizzare la gamma dinamica. Ma evita la saturazione. Non analizzare le celle contenenti più dell'1% di pixel saturi.Individuare il piano focale delle cellule utilizzando la luce trasmessa prima di raccogliere una serie Z attraverso la profondità di tenuta di una cella tipica utilizzando un passo di 0,5 micrometri Visualizzare tutti i campioni utilizzando lo stesso obiettivo, laser, potenza, scansione, zoom, dimensione dei pixel, guadagno e offset. Apri le immagini acquisite e cambia il tipo a 32 bit per determinare lo sfondo. Disegna un'area di interesse o ROI in un'area in cui non sono presenti celle.Scegli, analizza, misura per aggiungere l'intensità media di questo ROI alla finestra dei risultati. Per sottrarre questo valore dallo stack, scegliere Elabora matematica e Sottrai. Quindi inserisci l'intensità media dello sfondo e scegli l'anteprima.Va bene e sì, la soglia è l'aspetto più difficile della procedura. Per garantire il successo, definire i parametri di soglia in modo che l'immagine risultante mantenga le dimensioni effettive dell'oggetto fluorescente nell'immagine originale. L'utilizzo esattamente delle stesse condizioni di esposizione per ogni esperimento aiuterà a produrre soglie coerenti durante l'elaborazione delle immagini.Una soglia troppo bassa includerà i pixel di sfondo. Una soglia troppo alta eliminerà parti dei mitocondri dall'analisi utilizzando il sottratto Zack, troverà la fetta centrale e selezionerà la regolazione dell'immagine e la soglia, quindi la soglia dei mitocondri dopo aver trovato un valore di soglia appropriato. Fare clic su Applica per applicare questa soglia a tutte le sezioni della pila.Quindi seleziona imposta pixel di sfondo su NAN o non un numero e fai clic su OK e sì, ripeti questo processo per l'altra immagine. Crea lo stack Z del rapporto facendo clic su processo e poi su calcolatore di immagini. Dividere la pila ridotta per la pila C ossidata per l'analisi MIT O-R-G-F-P one.Lo stesso protocollo viene utilizzato per l'analisi migo AAM two. In tal caso, dividere l'immagine a 560 nanometri legata A TP per l'immagine A TP non legata a 510 nanometri. Disegna un ROI intorno all'area di interesse.Scegliere Strumenti di analisi. ROI manager e fare clic su aggiungi per registrare il ROI, quindi scegliere più multi misura e ok. Infine, copia l'area del numero di fetta e la media ed esporta i dati in un foglio di calcolo per l'analisi, usa il foglio di calcolo per calcolare l'area volte la media della somma ponderata e la media ponderata delle cellule che esprimono la GFP mirata dei mitocondri e la riga GFP uno crescono a ritmi normali.Il tasso di crescita massimo è simile nelle cellule che esprimono mito GFP e nella riga GFP del MIT. Inoltre, i mitocondri e il lievito che esprimono MIT RO GF P one sono tubulari allineati lungo l'asse della gemma madre e si accumulano all'estremità delle cellule madri e figlie. Questa morfologia normale indica che MIT RO GF P one non perturba la funzione mitocondriale.Per valutare l'intervallo dinamico di mitg FP one midlock, le cellule di lievito wild type sono state trattate con perossido di idrogeno e dihi tre etolo ed è stato misurato il rapporto medio mitocondriale ridotto a ossidato per valutare la titolazione dello stato redox mitocondriale con perossido di idrogeno o DTT da zero a 10 millimolari in un cambiamento dose-dipendente. In media rapporto mitocondriale ridotto a ossidato con un intervallo misurato da 0,6 in condizioni ossidanti a 1,23 in condizioni riducenti. Pertanto, mitg FP one è un biosensore efficace per l'analisi del redato mitocondriale nelle cellule viventi.Mito RO GFP one offre anche la risoluzione subcellulare dello stato redox mitocondriale. Questa risoluzione subcellulare rivela che i mitocondri all'interno delle singole cellule di lievito differiscono nello stato redox rerelativo La luce può indurre cambiamenti nel cromo 4 GFP dopo l'esposizione a una fila di luce ad alta intensità di 400 nanometri GFP uno subisce la fotoconversione in una specie con uno spettro di emissione diverso utilizzando l'eccitazione a bassa intensità. Non c'è una conversione significativa di foto durante il periodo analizzato.Il modo preferito per ridurre la fotoconversione è quello di eccitare la forma ossidata della GFP di fila a 365 nanometri MIGO AAM two co-localizza con DAPI il DNA mitocondriale colorato nel lievito e si trova nelle strutture tubolari tipiche dei mitocondri di lievito wild type. Inoltre, il tasso di crescita delle cellule che esprimono MIGO AAM 2 è simile a quello delle cellule che esprimono GFP mirata ai mitocondri sia nel glucosio che nel glicerolo. Pertanto, l'espressione di migo A two non sembra deleteria per la cellula o i mitocondri per verificare se il migo A two risponde ai cambiamenti nei livelli di A TP mitocondriale. Le cellule sono state trattate con antimicina A, un agente che inibisce la produzione di A TP mitocondriale.Il rapporto mediano dei tasti diminuisce nelle cellule trattate con antimicina. È interessante notare che i dati preliminari indicano che ci possono essere differenze nei livelli di TP in diversi mitocondri all'interno della stessa cellula. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in diverse ore.Inoltre, durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere costanti i parametri di imaging durante il monitoraggio delle cellule per la frammentazione mitocondriale e altri segni di fototossicità. Evitare il fotosbiancamento e sviluppare criteri coerenti per la soglia. Questi biosensori possono essere utilizzati per monitorare i cambiamenti mitocondriali nei funghi delle piante vive e nelle cellule dei mammiferi.Possono anche essere utilizzati per monitorare i cambiamenti mitocondriali nella neurodegenerazione, nelle malattie metaboliche e in altre malattie associate a difetti nelle funzioni mitocondriali. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di utilizzare coloranti fluorescenti metrici a rapporto mirato dei mitocondri per monitorare lo stato redox mitocondriale e un TP nelle cellule viventi.

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