Approcci genetici in avanti Chlamydia trachomatis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire analisi genetiche sulla clamidia tritus effettuando mutagenesi chimica e determinando le associazioni del fenotipo genotipo. Ciò si ottiene generando prima ceppi mutanti di chlamydia tracom utilizzando la mutagenesi chimica. Successivamente, tutte le mutazioni generate da sostanze chimiche vengono identificate mediante sequenziamento dell'intero genoma, seguito dall'assemblaggio del genoma guidato da riferimento.

Quindi vengono identificate le associazioni fenotipiche genotipiche nei ceppi mutanti. Infine, le associazioni genotipiche fenotipiche vengono confermate generando ceppi ricombinanti e analizzandoli. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano che una mutazione in un particolare gene della clamidia porta a un fenotipo di interesse attraverso una combinazione di approcci classici di mutagenesi chimica e Singh di nuova generazione.

Attualmente non sono disponibili metodi per la sostituzione genica nella clamidia e gli strumenti di genetica molecolare per il suo studio sono agli inizi. Questo metodo non richiede la trasformazione con DNA ricombinante o lo sviluppo di strumenti di genetica molecolare, ma raggiunge lo stesso obiettivo. Si tratta di un'assegnazione di funzione a singoli prodotti genici.

Per preparare, le cellule coltivate posizionano circa una volta 10 delle sei cellule vir per 25 centimetri al quadrato in tre millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS, incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Quando le cellule raggiungono la confluenza circa 24 ore dopo, aspirare il terreno e infettare le cellule con clamidia con una molteplicità di infezioni di cinque. In un volume totale di tre millilitri di D-M-E-M-F-B-S contenente 200 nanogrammi per millilitro di cicloesimide per iniziare la mutagenesi a 18 ore dopo l'infezione sotto una cappa chimica, preparare 20 milligrammi per millilitro di etilmetano solfonato o EMS in PBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio.

L'EMS è un potente mutageno e cancerogeno. Pertanto, fare riferimento al protocollo di testo per il suo smaltimento. Aspirare il terreno dalle cellule Vero e lavarle una volta con tre millilitri di PBS con cloruro di magnesio e cloruro di calcio.

Quindi a tre millilitri di soluzione EMS e incubare per un'ora nella cappa aspirante a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere l'EMS e metterlo in un contenitore di idrossido di sodio molare per inattivare il mutageno prima di lavare le cellule tre volte per rimuovere eventuali residui di EMS. Quindi, a sei millilitri di DMEM, 10% FBS con 200 nanogrammi per millilitro di cicloheide e 25 microgrammi per millilitro di gentamicina e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48-72 ore.

Le inclusioni appaiono prive di batteri circa 36 ore dopo la mutagenesi a 72 ore. Circa il 10% delle inclusioni sono riempite di batteri mentre il resto rimane vuoto per estrarre i corpi elementari o EBS mediante lisi ipotonica aspirare completamente il mezzo. Aggiungere un millilitro di acqua e agitare per 10 minuti per rimuovere le cellule, licare le cellule pipettando su e giù almeno 10 volte.

Dopo aver raccolto il lisato in una provetta per microfuge, aggiungere 0,25 millilitri di cinque x saccarosio, tampone glutammato fosfato o SPG a una concentrazione finale di una x e conservare a meno 80 gradi Celsius. Impostare i monostrati confluenti di cellule VES in piastre a sei pozzetti seminando circa 0,4 volte 10 delle sei cellule in tre millilitri di DMEM, il 10% FBS per pozzetto, consente alle cellule di formare un monostrato omogeneo nelle successive 24 ore. Prossimo autunno sul ghiaccio, una soluzione stock di clamidia mutagena.

Quindi preparare sei tubi di diluizione seriale dieci volte in un volume totale di 200 microlitri per diluizione in DMEM 10%FBS e metterli in ghiaccio. Utilizzare tre millilitri per pozzetto di PBS per lavare due volte le cellule Vero. Quindi aggiungere tre millilitri di DMEM a ciascun pozzetto per piastre a sei pozzetti e 100 microlitri di diluizione batterica in duplicato.

Agitare la piastra per garantire un composto uniforme. Centrifugare le piastre infette a 2.700 GS per 30 minuti a 15 gradi Celsius. Quindi incubarli a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per una o due ore.

Nel frattempo, prepara 0.54%AROS in DMEM combinando prima i seguenti ingredienti e mescolando. Bene, quindi mescolare 18,9 millilitri di acqua calda sterile, all'1,2%, mescolando per evitare grumi. Mantieni il composto caldo a bagnomaria a 55 gradi Celsius.

Aspirare la sospensione batterica dalle stoviglie e aggiungere sei millilitri della soluzione aro calda. Lasciarlo solidificare completamente a temperatura ambiente all'esterno della cappa. Quindi, nella cappa di biosicurezza con i coperchi rimossi, asciugare le piastre per altri 15 minuti quando le piastre si sono asciugate, incubarle a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per sette-10 giorni.

Le placche dovrebbero essere visibili con l'aiuto di un microscopio da dissezione un giorno prima di isolare i mutanti. Vedere una volta 10 per le quattro celle zero in 100 microlitri per pozzetto. In una piastra a 96 pozzetti, le cellule saranno confluenti entro 24 ore.

Sotto un microscopio da dissezione, contrassegnare le placche da prelevare e quindi utilizzare una pipetta barriera sterile da un millilitro per raccogliere i tappi delle placche. Resus sospendere le placche in 100 microlitri di DMEM integrati con il 10% di FBS 400 nanogrammi per millilitro, ciclo, heide e 50 microgrammi per millilitro. Gentamicina per espandere i ceppi mutanti, sovrapporre la sospensione su monostrati confluenti di cellule Vero.

Centrifugare le piastre a 2, 700 GS e 15 gradi Celsius per 30 minuti prima di incubare i db del raccolto quando più del 50% delle cellule è infetto, il che può verificarsi già 48 ore dopo l'infezione e fino a 14 giorni. Questa quantità di cellule infette consente di immagazzinare un numero sufficiente di batteri vitali per estrarre le vescicole extracellulari mediante lisi ipotonica delle cellule infette. Dopo aver aspirato il terreno a 160 microlitri di acqua sterile e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Utilizzare i puntali barriera per disgregare le cellule pipettando su e giù più volte per garantire una lisi completa. Infine, trasferire 160 microlitri di ciascun lisato in provette per microfuge. Aggiungere 40 microlitri di cinque XSPG e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento di analizzare e selezionare i mutanti per i fenotipi di interesse.

L'esposizione al mutageno porta a inclusioni che sembrano prive di batteri, presumibilmente a causa della morte cellulare batterica. Tipicamente, il sierotipo LGVL 2 eliminerà completamente le cellule infette entro 48 ore dall'infezione, ma il trattamento con mutageni può estendere questo ciclo a più di 90 ore e si prevede che circa il 10% delle inclusioni si riprenderà nei nostri esperimenti. Le cellule Vero infette trattate con 20 milligrammi per millilitro di EMS hanno portato a una diminuzione del 99% del recupero della progenie infettiva rispetto ai controlli non trattati, come si vede in questa figura.

Il trattamento mutageno ha anche portato alla comparsa di placche con morfologie alterate, comprese piccole placche. Altre morfologie includono placche che appaiono granulari, grumose o a forma di nido d'ape come mostrato qui. Le dosi di EMS utilizzate in questi studi possono portare a un numero di mutazioni compreso tra tre e 30 per genoma KCL, come valutato sperimentalmente da NGS.

Sebbene gli EBS purificati in gradiente siano in gran parte privi di materiale cellulare ospite, viene rilevato anche il DNA dell'ospite e comprende circa il 10-15% delle preparazioni genomiche Seguendo questa procedura. Screening per fenotipi come l'alterata replicazione nelle cellule di coltura tissutale, la perdita di attività biochimiche o l'alterazione delle morfologie batteriche possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come quali fattori batterici sono necessari per la formazione e il mantenimento della clamidia, fattori patogeni.