Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci o dell'agente terapeutico che esso trasporta attraverso una barriera cellulare, come ad esempio un modello dell'epitelio gastrointestinale rilevante per la somministrazione orale di farmaci. Questo viene ottenuto coltivando innanzitutto cellule Caco-2 su inserti Transwell, consentendo la differenziazione cellulare e la formazione di un monocstrato cellulare.

Il secondo passaggio consiste nel verificare che questo modello rappresenti una barriera di permeabilità misurando la resistenza elettrica transepiteliale, eseguendo la colorazione immunoistochimica delle giunzioni cellulari e valutando la permeabilità passiva di una molecola tracciante rilevabile. Il passaggio successivo è preparare il sistema di somministrazione del farmaco; in questo esempio vengono utilizzati nanocarrier polimerici mirati. I nanocarrier possono contenere o meno un farmaco, e devono essere inclusi controlli come nanocarrier non mirati o il farmaco libero.

Questi elementi sono marcati con radioisotopi per consentirne la rilevazione. I vettori vengono quindi aggiunti alla camera apicale sopra il monostrato cellulare dopo l'incubazione. A intervalli temporali variabili, i vettori vengono raccolti dalla camera apicale, dalla camera basolaterale e dal monostrato cellulare e sottoposti a test per verificare il potenziale degrado del componente marcato.

Il trasporto del nanocarriero attraverso il monostrato cellulare viene quindi calcolato definitivamente, al fine di studiare il meccanismo di trasporto. Esperimenti simili devono essere condotti in presenza di inibitori farmacologici della trascitosi attraverso le cellule o con marcatori del trasporto paracellulare tra le cellule. La tecnica qui descritta rappresenta un adattamento di metodi ben consolidati utilizzati per valutare la velocità e il meccanismo di trasporto di farmaci e nanoportatori di farmaci attraverso monostrati cellulari in coltura, che rappresentano barriere cellulari nell'organismo.

Sebbene l'esempio su cui ci siamo concentrati qui confermi il trasporto di nanoparticelle polimeriche mirate attraverso un modello di epitelio gastrointestinale, metodi simili possono essere applicati anche per esaminare il passaggio di diversi sistemi di somministrazione di farmaci attraverso questi o altri monociti cellulari, come le cellule endoteliali che tipicamente formano una barriera tra il flusso sanguigno e i tessuti e gli organi. Ad esempio, nel caso della barriera ematoencefalica, le persone generalmente alle prime esperienze con questo metodo incontrano difficoltà a causa della complessità nella scelta di marcatori adeguati per tracciare correttamente i sistemi di somministrazione dei farmaci durante questi studi, specialmente quando vengono trasportati attraverso le cellule e in piccole quantità.

Per questo aspetto, utilizzeremo radioisotopi per marcare i sistemi di somministrazione dei farmaci nei nostri studi; un'altra preoccupazione importante è la validazione dell'integrità della barriera cellulare del modello e l'uso di controlli appropriati per verificarla durante gli esperimenti. Questa procedura viene eseguita in una cappa di sicurezza biologica sterile di livello due, e tutti i materiali che entrano nella cappa devono essere sterilizzati con etanolo utilizzando pinzette per posizionare inserti transwell in polietilene poroso da 0,8 micrometri in una piastra a 24 pozzetti, al fine di ottenere risultati statisticamente significativi.

Ogni condizione sperimentale richiede un minimo di quattro ripetizioni. Diluire cellule di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano o cellule caco due nel mezzo cellulare precedentemente preparato. Aggiungere da 200 a 400 microlitri della soluzione cellulare nella camera superiore o apicale del transwell.

Seminare a una densità di 1,5 × 10⁵ cellule per centimetro quadrato. Riempire la camera inferiore o basolaterale con 700-900 µL di mezzo di coltura e coltivare le cellule a 37 °C, 5% di anidride carbonica e umidità al 95% per 16-21 giorni, sostituendo il mezzo ogni tre-quattro giorni nelle camere superiore e inferiore.

Sostituire il mezzo nell'ordine seguente per mantenere la pressione al di sopra del monostrato cellulare: aspirare il mezzo dalla camera inferiore, quindi aspirare il mezzo dalla camera superiore. Riempire la camera superiore con 200-400 microlitri di mezzo fresco e la camera inferiore con 700-900 microlitri di mezzo fresco per validare la barriera di permeabilità epiteliale mediante misurazione transepiteliale. Impostare il volt-ohm metro sulla modalità resistenza e posizionare verticalmente gli elettrodi in un pozzetto contenente l'inserto transwell.

L'elettrodo corto deve trovarsi nella camera superiore e quello lungo nella camera inferiore, a contatto con il fondo della pozzetta. Una volta che la lettura del voltmetro si stabilizza, registrare il valore della resistenza in ohm per ciascuna pozzetta. Ripetere le misurazioni ogni uno o due giorni fino a quando i valori aumentano raggiungendo un massimo e stabilizzandosi, indicando la formazione di una barriera di permeabilità, processo che in genere richiede da due a tre settimane a partire dal momento del seeding cellulare.

Per verificare la presenza di giunzioni strette in monociti cellulari di alto grado, fissare innanzitutto le cellule, aspirare il mezzo da entrambe le camere e lavare le cellule tre volte con DMEM tiepido, quindi incubare con paraformaldeide fredda al 2% per 15 minuti. Dopo 15 minuti, rimuovere la paraformaldeide e lavare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, aggiungere un microgrammo per millilitro di anticorpo anti-occludina a ciascuna.

Utilizzeremo pozzetti con bassa permeabilità come controllo negativo per la formazione della barriera. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente le cellule con PBS e quindi aggiungere 7,5 microgrammi per millilitro di anticorpi secondari marcati in ciascun pozzetto, incubando per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Infine, lavare le cellule con PBS ed escindere con attenzione la membrana filtrante alla quale è attaccato il monostrato fissato, montandola su vetrini per l'analisi mediante microscopia epifluorescente, a fluorescenza o confocale.

Questa procedura inizia con la marcatura dell'anticorpo bersaglio con iodio 125 e il calcolo dell'attività specifica dell'anticorpo marcato in conteggi al minuto per microgrammo, utilizzando protocolli precedentemente pubblicati. In questo esempio, l'anticorpo bersaglio è un anticorpo monoclonale murino contro la molecola di adesione intercellulare umana, uno o anti-ICAM uno, impiegato come controllo per la specificità. L'IgG murina marcata con iodio 125 verrà utilizzata per preparare nanoportatori ricoperti non mirati, al fine di studiare il trasporto di un carico terapeutico.

Il carico è inoltre marcato con iodio 1 25. In questo esempio, il carico è l'alfa galatto SASE o Alpha G, un enzima terapeutico utilizzato per il trattamento della malattia di Fabry, un disturbo genetico da accumulo lisosomiale. Uno degli aspetti più difficili di questa procedura è garantire un'adeguata rilevazione dei materiali trasportati.

Per garantire il successo, i componenti dei nanocarrier devono essere marcati con una quantità sufficiente di isotopi ad alta attività specifica. Il passo successivo consiste nell'accoppiare l'anti-ICAM marcata alla superficie dei nanocarrier. In questo caso, si mescola semplicemente l'anti-ICAM marcata con iodio 1 25 con nanostrutture sferiche di polistirene di 100 nanometri di diametro come modello per il controllo non specifico.

Utilizzare IgG marcata con iodio 125 e, per tracciare il trasporto di un carico, utilizzare una combinazione di anti-ICAM e alfa-G marcato con iodio 125. Incubare le miscele per un'ora a temperatura ambiente per consentire l'assorbimento sulla superficie; dopo un'ora, centrifugare a 13.000 ×g per tre minuti, quindi rimuovere i corrispettivi non rivestiti nel soprannatante mediante pipetta aspirante. Sospendere il pellet contenente i nano-veicoli rivestiti in albumina sierica bovina al 1% in PBS e successivamente sottoporre a sonica a bassa potenza per interrompere eventuali aggregati di particelle. Aggiungere i nano-veicoli di anti-ICAM marcati con iodio 125 alla camera superiore posta sopra monociti confluenti di Caco-2 con elevata resistenza transepiteliale. Ripetere la procedura per i corrispettivi non specifici e terapeutici dopo aver misurato la permeabilità.

Incubare a 37 gradi Celsius per uno o più intervalli di tempo desiderati. Misurare nuovamente lo strappo dopo l'incubazione. Le misurazioni dello strappo servono per valutare gli effetti dei nanoveicoli sulla barriera di permeabilità.

Raccogliere il mezzo dalle camere superiore e inferiore. Lavare la camera superiore con 0,5 millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius e la camera inferiore con un millilitro di acqua deionizzata. Raccogliere i lavaggi per la misurazione del contenuto totale di radioisotopo mediante un contatore gamma per la misurazione della frazione cellulare.

Escidere il filtro permeabile utilizzando una lametta per tagliare lungo i bordi. Incubare in un tubo per contatore gamma con Triton X-100 all'1% per 10 minuti per rilasciare il contenuto cellulare prima di misurare la radioattività totale associata alle cellule, al fine di quantificare l'iodio 125 rilasciato dai nano vettori durante il trasporto o a seguito di potenziale degradazione. Inizialmente mescolare 300 microlitri di ogni campione con 700 microlitri di BSA al 3% in PBS e 200 microlitri di acido tricloroacetico o TCA, quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.

Durante questa incubazione di 15 minuti, misurare la radioattività totale dei campioni in un contatore a scintillazione gamma. Centrifugare i campioni di acido tricloroacetico (TCA) a 3000 ×g per cinque minuti per separare la proteina integra dalla proteina degradata o dalla frazione di iodio 125. Quantificare la radioattività della frazione di iodio libero 125 e sottrarre questo valore dalla radioattività totale misurata prima della centrifugazione. Questo consentirà di determinare la quantità di proteina marcata rispetto alla frazione di radiofarmaco staccatasi da essa, al fine di valutare il trasporto paracellulare utilizzando la perdita paracellulare di albumina. Coltivare monocapucci cellulari di KCO2 su inserti transwell, come dimostrato in precedenza, aggiungendo nel compartimento superiore, al mezzo sovrastante il monocapuccio cellulare, o albumina marcata con iodio 125 da sola, come controllo negativo che mostra il livello basale di perdita, oppure iodio.

1 25 albumina marcata e anticorpo non marcato con radionuclidi. Incubare i nanoveicoli mirati a 37 gradi Celsius per intervalli di tempo selezionati, che devono corrispondere a quelli esaminati durante il test del trasporto nz. Misurare le lacrime come dimostrato in precedenza, prima, durante e dopo l'incubazione.

Raccogliere tutte le frazioni dopo l'incubazione per le misurazioni di iodio totale 1 25 e iodio libero 1 25 come controllo positivo per l'apertura delle giunzioni intercellulari. Aggiungere il mezzo cellulare contenente perossido di idrogeno cinque millimolare nelle camere superiore e inferiore del transwell. Inserire e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Misurare il tear e aggiungere albumina con iodio 1 25 alla camera superiore per gli intervalli di tempo selezionati. Misurare il tear in diversi punti temporali durante l'incubazione per identificare il decadimento del valore del tear causato dall'apertura delle giunzioni cellulari indotta dal perossido di idrogeno. In esperimenti paralleli, valutare il trasporto transcellulare o la transcitosi di nano vettori marcati con iodio 1 25 incubando monocapucci confluenti di Caco due con ciascuno di questi inibitori.

50 Micromolar MDC, un inibitore dell'endocitosi mediata da clatrina. Un microgrammo per millilitro di filipina, un inibitore dell'endocitosi mediata da caveole. 0,5 Micromolar WT manina, un inibitore della fosfatidilinositolo tre chinasi, coinvolta nella macropinocitosi, e 20 micromolar di EIPA.

Un inibitore della macropinocitosi e dell'endocitosi mediata da chem viene misurato il valore di TEER prima, durante e dopo l'incubazione delle cellule con inibitori e materiali radioattivamente marcati come ulteriore controllo sull'effetto degli inibitori sulla permeabilità del monostrato per validare i monostrati CACO-2 come modello di trasporto trans-epiteliale di nanoportatori mirati, le cellule CACO-2 sono state coltivate su inserti Transwell a una densità di 1,5 × 10⁵ cellule per centimetro quadrato e la resistenza elettrica trans-epiteliale o TEER è stata misurata per valutare l'integrità del monostrato. Come mostrato in questo grafico, il monostrato ha raggiunto la confluenza al giorno 12 e ha mantenuto l'integrità fino al giorno 18. Questo risultato è stato ulteriormente confermato dalla presenza di giunzioni strette positive per occludina nei monostrati con un alto valore di TEER pari a 380 ohm per centimetro quadrato al giorno 14, rispetto all'etichettatura delle giunzioni strette al giorno 5 con un basso valore di TEER pari a 17 ohm per centimetro quadrato. Per valutare il trasporto di nanoportatori anti-ICAM attraverso i monostrati di cellule CACO-2, i monostrati confluenti di CACO-2 coltivati su inserti Transwell sono stati incubati con nanoportatori anti-ICAM marcati con iodio-125 aggiunti alla camera apicale.

Il contenuto di iodio 125 nella camera basolaterale è stato misurato nei punti temporali indicati per calcolare la quantità di nano vettori trasportati per cellula, come mostrato nel pannello superiore. Nel pannello inferiore, la percentuale di nano vettori trasportati è stata calcolata come rapporto tra i vettori presenti nella frazione basolaterale e quelli presenti nella frazione combinata basolaterale e cellulare. Questi parametri stimati in questo esempio per i nano vettori anti-ICAM marcati con iodio 125 sono stati confrontati anche con quelli del controllo, ovvero i nano vettori IgG marcati con iodio 125, al fine di dimostrare l'efficienza di trasporto rispetto a un corrispettivo non mirato, e i risultati sono mostrati nel pannello superiore.

I coefficienti di permeabilità apparente sono stati inoltre calcolati per riflettere le velocità di trasporto di nano-veicoli contenenti iodio 125 anti-ICAM o nano-veicoli contenenti iodio 125 IgG, come mostrato nel pannello inferiore, quando l'etichetta radioattiva è incorporata nel carico del nanoveicolo. I parametri descritti riflettono il trasporto del carico, che in questo esempio è l'enzima alfa-GA utilizzato per il trattamento di una malattia genetica da accumulo lisosomiale nota come malattia di Fabry. Il contenuto di radioisotopo nelle frazioni apicali, basolaterali e cellulari è stato misurato a tre ore e a 24 ore e convertito in diversi valori rilevanti per il trasporto, come mostrato in questa tabella.

Oltre al calcolo del trasporto dei nanocarrier mediante il tracciamento del carico, la somministrazione trans-epiteliale di questo enzima terapeutico può essere stimata esprimendola come numero di molecole o picogrammi di alfa-gal trasportati per cellula. È stato inoltre studiato il meccanismo di trasporto dei nanocarrier anti-ICAM attraverso monociti di Caco. Il trasporto transcellulare di nanocarrier anti-ICAM marcati con iodio-125 attraverso monociti confluenti di Caco-2 è stato valutato dopo 24 ore in assenza o in presenza dei seguenti inibitori: EIPA, Filipina MDC o Wirtmanina. L’EIPA è un inibitore della macropinocitosi e dell’endocitosi mediata da canali. Filipina, MDC e WT menina sono inibitori dell’endocitosi mediata da caveole, dell’endocitosi mediata da clatrina e della macropinocitosi, rispettivamente.

Come indicato in questo grafico, l'EIPA ha ridotto il trasporto di nano veicoli contenenti iodio 1 25 anti IAM attraverso monocapate di cellule CACO due, mentre la Filipina MDC e la Wirt Menin non hanno ridotto i livelli di trasporto rispetto alla condizione di controllo. Questo suggerisce che i nano veicoli anti ICAM utilizzano l'endocitosi mediata da chem per il trasporto transcellulare, ma non la traslocazione mediata da clar, clatrina o macropinocitosi.

Per valutare il trasporto paracellulare, la resistenza transepiteliale (TEER) è stata misurata durante il trasporto di nanoportatori anti-ICAM marcati con iodio 125 attraverso un monostrato di Caco-2. Sono mostrati i valori di TEER di due monostrati in assenza di nanoportatori come controlli, e l'intervallo tratteggiato indica l'errore standard della media (SEM) dell'incubazione con cinque millimolari di perossido di idrogeno, utilizzato come controllo positivo per l'apertura delle giunzioni intercellulari, come evidenziato dalla riduzione della TEER ai livelli di base.

Inoltre, è stata misurata e calcolata la perdita proteica paracellulari, espressa come coefficiente di permeabilità apparente dell'albumina marcata con iodio 125, che attraversa il monostrato cellulare in assenza o in presenza di cinque millimoli di perossido di idrogeno, di nanoveicoli IgG o di nanoveicoli anti-ICAM. Il perossido di idrogeno ha notevolmente aumentato la fuoriuscita dell'albumina marcata con iodio 125 nella camera basolaterale, fungendo da controllo positivo, come mostrato in questi grafici. L'incubazione con nanoveicoli anti-ICAM non ha modificato la perdita paracellulare di albumina marcata con iodio 125 né di lacrime, nel corso di 48 ore, in modo simile ai nanoveicoli IgG di controllo che non vengono trasportati.

Questi risultati escludono il trasporto paracellulari e sono coerenti con risultati precedenti che suggeriscono che i nano vettori anti-ICAM utilizzano l'endocitosi mediata da cam per il trasporto transcellulare. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante selezionare uno o più tipi cellulari adatti e un filtro permeabile con dimensione dei pori, materiale, diametro e altre caratteristiche appropriate per il modello Transwell, nonché tecniche di marcatura per una quantificazione efficace del sistema di somministrazione del farmaco dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza o la microscopia elettronica a trasmissione, possono essere utilizzati per determinare la localizzazione dei materiali trasportati e, in aggiunta, per verificare lo stato dei materiali trasportati.

Il blotting Western può essere utilizzato per misurare la degradazione delle proteine. L'EISA può essere utilizzata per determinare l'abilità di targeting dei vettori trasportati e l'attività del farmaco trasportato può essere misurata mediante saggi spettrofotometrici o altre tecniche appropriate.