Name: Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 57 s
Description: Scopri metodi computazionali per valutare il trasporto di nanovettori polimerici attraverso barriere cellulari usando modelli Caco-2. Questa tecnica migliora la comprensione dei meccanismi di assorbimento farmaceutico.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Howard Hughes Medical Institute e la National Science Foundation per RG, e fondi erogati a SM dal National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) e l&#39;American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

1. Coltivazione di un monostrato di cellule in Transwell Inserti <ol><li> In una sterile, livello di biosicurezza 2 cellule cappa cultura, pongono 0,8 millimetri poro PET Transwell inserisce in una piastra a 24 pozzetti (4 pozzi per condizione, per la significatività statistica) con una pinza. Tutti i materiali cofano, devono essere sterilizzati con etanolo. </li></ol> Nota: La dimensione dei pori del filtro deve essere selezionato in accordo alla dimensione media della NC utilizzato, per consentire il trasporto attraverso la membrana. Inoltre, per ottenere risultati statisticamente significativi, ogni condizione sperimentale richiede un minimo di quattro ripetizioni (pozzi) all&#39;interno dello stesso esperimento, e un minimo di tre esperimenti indipendenti. <ol start="2"><li> Preparare terreno di coltura contenente DMEM supplementato con 4,5 g / L di glucosio, siero bovino fetale 15% e 1% Pen Strep, e calore a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Diluire adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2), le cellule in terreno cellulare e luogo200-400 microlitri della soluzione nella cella superiore (apicale) camera dell&#39;inserto transwell, ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2. Riempire il più basso (basolaterale) da camera con 700-900 ml di mezzo cellulare. </li><li> Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO 2, e 95% di umidità per 16-21 giorni, sostituendo il mezzo nella camera superiore e inferiore ogni 3-4 giorni, utilizzando i volumi indicati al punto 1.3. Sostituire medio nel seguente ordine di mantenere la pressione sopra (anziché sotto) il monostrato cellulare: aspirare il terreno dalla camera inferiore, aspirare il terreno dalla camera superiore, riempire la camera superiore con mezzo fresco, e riempire la camera inferiore con terreno fresco. </li></ol> 2. Validazione del GI epiteliale permeabilità della barriera Uso transepiteliale resistenza elettrica (TEER) e Immunostaining di giunzioni strette <ol><li> Per la conservazione a breve termine (meno di 2 settimane), immergere gli elettrodi STX100 in una soluzione elettrolitazione (0,1-0,15 M KCl o NaCl). Collegare il cavo dell&#39;elettrodo alla porta elettrodo sul misuratore Evom volt-ohm in modo che il sistema è internamente cortocircuitati e elettrodo simmetria è mantenuta. Per la conservazione a lungo termine, sciacquare con dH 2 O e conservare in un luogo asciutto, condizione di buio. </li><li> Per sterilizzare gli elettrodi, immergere in etanolo per 15 minuti e lasciare asciugare all&#39;aria per 15 sec. In alternativa, gli elettrodi possono essere memorizzati in una cappa UV. Risciacquare gli elettrodi in una soluzione sterile elettrolita (soluzione salina tampone fosfato, PBS) o 0,1-0,15 soluzione M KCl o NaCl, prima di ogni misurazione della resistenza. </li><li> Con il voltmetro ohm impostata alla resistenza, verticalmente posizionare gli elettrodi in un pozzetto contenente l&#39;inserto transwell, con la breve elettrodo nella camera superiore e lungo elettrodo nella camera inferiore toccare il fondo del pozzo. Dopo la lettura Evom stabilizza, registrare il valore di resistenza (dato in ohm, Ω) per ogni bene. </li><li> Calcola resistività (resisce normalizzato a zona; Ω × cm 2) di campioni sottraendo la resistenza di fondo (TEER di inserti transwell senza celle) e moltiplicando per la superficie della membrana. Valori di resistività sono più spesso riportati in letteratura. (Vedi la discussione) </li><li> Ripetere le misurazioni ogni 1-2 giorni fino TEER valori aumentano al massimo e plateau, indicando la formazione di una barriera di permeabilità, che richiede in genere 2-3 settimane dal momento del Platting cella. Valori e il tempo necessario a conseguire integrità della barriera Plateau TEER possono variare in base al numero di cellulare di passaggio. </li><li> Per verificare la presenza di giunzioni strette in monostrati di cellule con alta TEER (uguale o superiore al valore di soglia per la formazione di barriera), fissare le cellule mediante incubazione con freddo 2% paraformaldeide per 15 min. Poi, lavare le cellule con PBS e incubate per 30 minuti a temperatura ambiente con 1 mg / ml di anti-occludina. Lavare le cellule nuovamente con PBS e incubare per 30 min a temperatura ambiente con 7,5 ug / ml fanticorpi secondari luorescently-etichettati. Utilizzare pozzetti con basso TEER come controllo negativo per la formazione barriera. </li></ol> Nota: Come sostituto per anti-occludina, possono essere utilizzati anticorpi contro proteine ​​alternative giunzione stretti. <ol start="7"><li> Asportare con cura la membrana filtrante su cui è collegato il monostrato fisso, e montare su vetrini per l&#39;imaging che utilizzano epifluorescenza o microscopia confocale. </li></ol> 3. Valutare transepiteliale trasporto di portatori di mirate <ol><li> Etichetta la mira anticorpo (anticorpo monoclonale di topo contro ICAM-1, anti-ICAM, in questo esempio) con 125 I, come descritto in precedenza 7. Utilizzare saggio Bradford per stimare la concentrazione di proteine ​​e un contatore gamma per determinare 125 I contenuti di anticorpi, quindi calcolare l&#39;attività specifica in conteggi per minuto (CPM) / mg di anticorpo marcato. </li></ol> Nota: Per controllare per la specificità, riRipetere la procedura con IgG etichettatura mouse, che verrà utilizzato per preparare NC rivestiti non mirati. Per studiare il trasporto di un carico terapeutica, ripetere la procedura di etichettatura del carico, per esempio, alfa-galattosidasi (α-Gal) in questo esempio. Alternative possono essere usate per l&#39;agente targeting, il controllo non specifico, o merci terapeutico. Metodi alternativi possono essere utilizzati anche per etichettare i composti e stimare la concentrazione delle controparti etichettati. <ol start="2"><li> Coppia il marcato di targeting anticorpi (anti-ICAM nel nostro esempio) alla superficie di NC. In questo esempio, incubare nanobeads polistirolo (diametro di 100 nm) per 1 ora a temperatura ambiente con 125 I-anti-ICAM per consentire adsorbimento superficie, come descritto 7. </li></ol> Nota: Per il controllo non specifico uso 125 I-IgG. Per tracciare il trasporto di un carico, utilizzare una combinazione di anticorpi rivolti e 125 I-marcato carico (α-Gal nel nostro esempio). <ol start="3"><li> Centrifugare a 13.000 xg per 3 min e rimuovere le controparti non-rivestiti nel surnatante tramite aspirazione. Risospendere il pellet contenente NC rivestiti con 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS pipettando, e sonicare a bassa potenza per distruggere potenziali aggregati di particelle (20-30 brevi impulsi). </li><li> Per la caratterizzazione NC, misurare le dimensioni, polidispersità, e ζ-potenziale di particelle rivestite utilizzando light scattering dinamico (seguendo le istruzioni del fornitore), e quantificare il numero di 125 I-marcato targeting molecole anticorpali (ad esempio anti-ICAM) sulla superficie delle particelle utilizzando un contatore gamma. </li></ol> Nota: Questi metodi possono essere ripetute per controparti non specifici e terapeutiche. La dimensione delle particelle rivestite varia circa 200 nm. <ol start="5"><li> Aggiungere 125 NC I-anticorpo, (ad esempio 125 I-anti-ICAM NCs; 56 nCi / ml) alla camera superiore sopra confluenti Caco-2 monostrati con TEER &amp;# 8805; 350 Ω × cm 2 (vedi discussione) su sfondo (16-21 giorni dopo la semina). Incubare a 37 ° C per una o più di tempo desiderato intervalli. Misurare TEER (Sezione 2.3) prima e dopo incubazione per valutare gli effetti della NC sulla barriera di permeabilità. </li></ol> Nota: Questa procedura può essere ripetuta per controparti non specifici e terapeutiche. <ol start="6"><li> Raccogliere medio dalle camere superiori e inferiori e lavare una volta con 0,5 ml di DMEM a 37 ° C (camera superiore) o 1 ml dH 2 O (camera inferiore). Raccogliere i lavaggi per la misurazione del contenuto totale radioisotopo in un contatore gamma. </li><li> Per la misura della frazione di cellule, asportare il filtro permeabile, per esempio usando una lama di rasoio per tagliare lungo i bordi, e incubare in un tubo contatore gamma con 1% Triton X-100 per 10 minuti (per rilasciare il contenuto delle celle), prima cella di misura associata radioattività totale. </li><li> Per misurare 125 ho riaffittati da NC durante il trasporto oa causa di potenziale degrado, primo mix 300 ml di campione (provenienti dalle frazioni superiori, inferiori o cellulari) con 700 ml di 3% BSA in PBS e 200 ml di acido tricloroacetico (TCA). Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Nel frattempo questa volta, misurare la radioattività totale di questo campione in un contatore gamma. </li><li> Centrifugare i campioni TCA a 3.000 xg per 5 minuti per separare proteina intatta (pellet) dalla proteina degradata o 125 I frazione (surnatante). Quantificare la radioattività della libera 125 frazione I e sottrarre questo valore dal radioattività totale misurato prima della centrifugazione. Ciò fornirà la quantità della proteina marcata che non viene degradato. </li></ol> 4. Meccanismo di trasporto transepiteliale di nanovettori mirate <ol><li> Etichetta albumina con 125 I, come descritto nella Sezione 3.1 e riportato in precedenza 7. </li></ol> Nota: L&#39;albumina è un 66.5kDa e, quindi, una relativamente grande sostanza. Anche se un controllo valido per il trasporto passivo di oggetti di grandi dimensioni (ad esempio, 200 CN nm utilizzati qui), dovrebbe essere sostituito con molecole traccianti inerti più piccoli quando si studia il trasporto di portatori di farmaci più piccoli (vedi discussione). <ol start="2"><li> Per valutare trasporto paracellulare utilizzando albumina perdite paracellulare, cultura Caco-2 monolayers su transwell inserti come descritto sopra. </li><li> Per il mezzo camera superiore sopra il monostrato cellulare, aggiungere o 125 solo I-albumina (controllo negativo che mostra il livello basale di perdite), o 125 NC anticorpi mirati I-albumina e non radioattivi (come descritto nella Sezione 3.5). Incubare a 37 ° C per l&#39;intervallo di tempo selezionato (s), che dovrebbe corrispondere a quelli esaminati durante le prove del trasporto NC. Misurare TEER (Sezione 2.3) prima, durante e dopo l&#39;incubazione, quindi raccogliere tutte le frazioni per un totale di 125 mi e libero 125 I misure come indicato. nella sezione 3 Nota: concomitante aggiunta di 125 controllo I-albumina e non radiomarcato NC IgG può essere utilizzato come controllo. </li><li> Come controllo positivo per l&#39;apertura di giunzioni intercellulari, aggiungere media cella contenente 5 mM H 2 O 2 alle camere superiore ed inferiore dell&#39;inserto transwell, e incubare a 37 ° C per 30 min. Quindi, misurare TEER (Sezione 2.3) e aggiungere 125 I-albumina alla camera superiore per gli intervalli di tempo selezionati. Misurare TEER in vari momenti durante l&#39;incubazione per identificare TEER decadimento valore causata da H 2 O 2 indotta apertura delle giunzioni cellulari. </li><li> In esperimenti paralleli, valutare i trasporti transcellulare, chiamato anche transcitosi, di 125 NC I-mirati da parte di incubazione confluenti Caco-2 monostrati sia con 50 pm monodansylcadaverine (MDC; inibitore di endocitosi clatrina-mediata), 1 mg / ml filipin (inibitore della caveolari endocitosi mediata), 0,5 micron Wortmannin (inibitore della fosfatidilinositolo 3 chinasi [PI3K], coinvolto in macropinocitosi), o 20 micron [5 - (N-etil-N-isopropile) amiloride] (EIPA, inibitore della macropinocitosi e CAM-mediata endocitosi 15). </li></ol> Nota: 125 I-IgG NC e 125 I-albumina possono essere utilizzati come controlli negativi per l&#39;effetto di questi inibitori, e altri metodi (ad esempio tecniche di siRNA) possono fornire inibizione più selettiva. <ol start="6"><li> Misurare TEER (Sezione 2.3) prima, durante, e dopo incubazione delle cellule con inibitori e materiali radiomarcati, quale ulteriore controllo per l&#39;effetto degli inibitori sulla permeabilità monostrato. </li></ol>

<ol><li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li>
<li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+nature%3A+%22Pathogen-Mimetic%22+systems+for+mucosal+nano-medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li>
<li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers%3A+implications+for+oral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li>
<li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li>
<li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persorption+of+particles%3A+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Pharmacol.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li>
<li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cell+junctions%3A+happy+together%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li>
<li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides%3A+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li>
<li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li>
<li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li>
<li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis%3A+crossing+cellular+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li>
<li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li>
<li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li>
<li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption%3A+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Ther.+Drug+Carrier+Syst%22%5BJournal%5D)">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li>
<li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li>
<li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional%2C+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-%2C+co-%2C+and+tri-cultivation+Transwell+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li>
<li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li>
<li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li>
<li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li>
<li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li>
<li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li>
<li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement%3A+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li>
<li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li>
<li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li>
<li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li>
<li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li>
<li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Usando i metodi discussi sopra, un modello cellulare per studiare il trasporto di NC mirati attraverso le barriere cellulari può essere stabilita, come l&#39;esempio fornito per Caco-2 cellule epiteliali, che è rilevante per valutare trasporto dal lume GI nel sangue nel caso dei sistemi di drug delivery per via orale. Coltura di monostrati di cellule epiteliali GI in inserti transwell ha permesso la misurazione di TEER e fluorescenza immunoistochimica di giunzioni strette per confermare la formazione di una barriera di ...

Barriere cellulari nell&#39;atto corpo come gateway tra l&#39;ambiente esterno e scomparti interni. Questo è il caso per il rivestimento epiteliale separa la superficie esterna esposta del tratto gastrointestinale (GI) e il flusso sanguigno 1-3. Barriere cellulari rappresentano anche l&#39;interfaccia tra il sangue e il parenchima e componenti cellulari di tessuti e organi. Questo è il caso per il rivestimento endoteliale interno in vasi sanguigni, come la barriera emato-polmonare, la barriera emato-encefalica, ecc 1 La capacità di attraversare le barriere cellulari nel corpo è cruciale per la consegna efficiente di agenti terapeutici e diagnostici in circolo e tessuti / organi in cui è necessario l&#39;intervento. Per migliorare l&#39;erogazione di agenti terapeutici o diagnostici, questi composti possono essere caricati in nanocarriers sub-micrometriche (NC). Questi veicoli di somministrazione di farmaci possono essere formulati con una varietà dichimiche e strutture per ottimizzare la solubilità della droga, la protezione, la farmacocinetica, il rilascio, e il metabolismo 4,5. NC può essere funzionalizzato con affinità o rivolti frazioni (ad esempio anticorpi, peptidi, aptameri zuccheri, ecc) per facilitare l&#39;adesione alle zone del corpo in cui è richiesta l&#39;azione terapeutica 2,6. Targeting di NC determinanti espresse sulla superficie delle barriere cellulari può facilitare il successivo trasporto in e / o di tutti questi rivestimenti 2,6. Il ruolo di trasportare selettivamente sostanze tra due ambienti richiede alcune caratteristiche uniche tra strati di cellule. Una tale funzionalità è polarità cellulare, per cui la membrana apicale rivolta verso il lume della cavità varia dalla membrana basolaterale orientata verso l&#39;interstizio tessuto, rispetto alla membrana morfologia e composizione dei lipidi, trasportatori e recettori 2. Un&#39;altra caratteristica comporta junctio intercellularens collegamento celle adiacenti. Regolazione delle proteine ​​che formano giunzioni strette, molecole di adesione particolarmente giunzionali (inceppamento), occludins e claudine, modulare la funzione di barriera per permettere selettivamente o non trasporto di sostanze tra cellule, note come trasporto paracellular, permettendo il passaggio di materiali dal lume a lo spazio basolaterale 3. Il legame di molti elementi naturali e sintetiche (leucociti, molecole, particelle e sistemi di drug delivery) alle barriere cellulari nel corpo può indurre apertura cella giunzione, che può essere transitoria e relativamente innocuo o più prolungato e, quindi, non sicuro con accesso di sostanze indesiderate attraverso la barriera 2,5,7-9. Di conseguenza, questa via può essere valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e diffusione paracellular passiva di molecole (qui chiamato dispersione paracellular), per cui diminuita resistenza in corrente elettrica o maggiore dispersione paracellular di un inert composto nello spazio basolaterale indicare l&#39;apertura di giunzioni cellulari, rispettivamente 5,10,11. A complemento di questi metodi, una delle proteine ​​di giunzione stretti sopra elencati possono essere macchiati di valutare la loro integrità, dove la colorazione dovrebbe apparire concentrata ai confini cellula-cellula in tutto il periferia cellulare 5,10,12. In alternativa, sistemi di somministrazione di farmaci che hanno come target specifici determinanti della superficie cellulare, come quelli associati a fosse rivestite di clatrina o invaginazioni di membrana a fiasco chiamati caveole, possono innescare captazione vescicolare nelle cellule per endocitosi, fornendo una via per la somministrazione di farmaci a compartimenti intracellulari 5, 13. Inoltre, endocitosi può portare al traffico di vescicole in tutto il corpo cellulare per il rilascio sul lato basolaterale, un fenomeno noto come transyctosis, o il trasporto transcellulare 14. Pertanto, la conoscenza della cinetica e meccanismo di endocitosi può essere utilizzata per sfruttare intracellulare unand drug delivery transcellulare, che offre un modo relativamente sicuro e controllato di consegna rispetto alla via paracellular. (Endocitosi come nel caso della molecola di adesione cellulare (CAM)-mediata) Il meccanismo di endocitosi può essere valutata con modulatori dei percorsi classici (clatrina-e endocitosi caveolina-mediata, e macropinocitosi) o rotte non-classici 5,13,15 . Considerando traffico intracellulare è spesso studiato in pozzetti standard o coprioggetti, l&#39;assenza di un compartimento basolaterale osta polarizzazione cellulare e la capacità di studiare il trasporto attraverso strati di cellule. Per superare questo ostacolo, il trasporto attraverso monostrati cellulari sono stati a lungo studiati utilizzando transwell inserti 10,11,16,17, che consistono in un (apicale) camera superiore, una membrana permeabile poroso in cui le cellule si attaccano e formano un monostrato stretto, ed una inferiore (basolaterale) camera (Figura 1). In questa configurazione, il trasporto può essere misurata nelapicale a basolaterale direzione somministrando un trattamento nella camera superiore, segue un percorso attraverso il monostrato cellulare e la membrana porosa sottostante, e finalmente raccogliendo il mezzo nella camera inferiore per la quantificazione del materiale trasportato. Trasporto in direzione basolaterale-to-apicale può anche essere misurata mediante somministrazione iniziale alla camera inferiore e successiva raccolta dalla camera superiore 5,10,12,16. Esistono varie tecniche per verificare la formazione di permeabilità barriera su transwells, compresi TEER e saggi trasporto paracellular, come descritto sopra. Inoltre, il filtro permeabile in cui le cellule sono coltivate può essere rimosso per l&#39;analisi delle immagini (ad esempio mediante fluorescenza, confocale, microscopia elettronica), come ulteriormente validazione del modello monostrato cellulare così come il meccanismo di trasporto. Selezione del tipo a membrana, che è disponibile in diverse dimensioni dei pori, materiali e superfici, in funzione di varie factors come la dimensione di sostanze o oggetti da trasportare, tipo cellulare, e metodo di imaging 16,18-20. Transwell inserti anche facilitare quantificazione controllato e preciso di trasporto rispetto ai sistemi complessi di mammifero, come volumi delle camere e della superficie cellulare sono costanti note. Mentre molti fattori coinvolti nella consegna in vivo sono eliminati, tra cui la presenza di muco intestinale, shear stress, enzimi digestivi, le cellule immunitarie, ecc, questa piccola scala modello in vitro fornisce informazioni preliminari utili in materia di trasporti. Come esempio per illustrare l&#39;adattamento di questi metodi per studiare il trasporto NC attraverso le barriere cellulari 10,11,16,17, descriviamo qui un caso in cui il rischio di propagazione NC attraverso l&#39;epitelio GI stato modellato valutando passaggio di un drug delivery modello sistema attraverso un monostrato di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2) cellule. A tal fine, cells stati coltivati ​​in inserti transwell, su un 0,8 micron pori polietilene tereftalato (PET) filtro (diametro 6,4 mm), che è trasparente e può essere utilizzato per l&#39;imaging microscopia. Lo stato della barriera di permeabilità è convalidata misurando TEER, trasporto apicale a basolaterale di una sostanza di riferimento, albumina, e visualizzazione microscopia a fluorescenza di un elemento delle giunzioni strette, proteine ​​occludina. Un modello di polimero mirata NC viene utilizzato, costituito da 100 nm, nanoparticelle polistirene non biodegradabile. NC sono rivestiti mediante adsorbimento superficie con un anticorpo rivolti solo o una combinazione di un anticorpo targeting e un carico terapeutico, in cui o componente può essere marcato con 125 I per radioisotopo tracciamento. Nell&#39;esempio selezionata, l&#39;anticorpo riconosce molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una proteina espressa sulla superficie di GI epiteliale (e altre cellule), che è stato dimostrato per facilitare il trasporto intracellulare e transcellulare o<html> trasportatori di farmaci f e del loro carico 21. Il carico è l&#39;alfa-galattosidasi (α-Gal), un enzima terapeutico usato per il trattamento della malattia di Fabry, una malattia da accumulo lisosomiale genetica 22. NCS rivestiti, di circa 200 nm dimensioni, vengono aggiunti alla camera apicale sopra il monostrato cellulare e incubate a 37 ° C per vari periodi di tempo, dopo che 125 I sulla NC può essere rilevato associata al monostrato di cellule e / o trasportato alla camera basolaterale sotto le celle. Ulteriori determinazione del libero 125 mi permette di sottrazione della frazione degradato e la stima dei trasporti rivestito NC. Il meccanismo di trasporto è ulteriormente valutata esaminando cambiamenti nella permeabilità della barriera di pertinenza del percorso paracellulare, attraverso i parametri sopra descritti, mentre il trasporto transcellulare è determinata esaminando cambiamenti nel trasporto modulando vie di endocitosi e transcitosi. ONTENUTO &quot;&gt; Questi metodi forniscono informazioni preziose riguardo modelli barriera cellulare, il grado e la velocità di trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci, e il meccanismo di tale trasporto, consentendo complessivamente valutazione del potenziale per la somministrazione di farmaci attraverso le barriere cellulari.

<table><tbody><tr><td>Inserti Transwell</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CM</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-015-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penna Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cellule di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2)</td><td>ATCC</td><td>HTB-37TM</td><td></td></tr><tr><td>125Iodio</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ033H002MC</td><td>Pericolo radioattivo</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Equitech Bio</td><td>BAH-66</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (16%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15710</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G (IgG) di topo,</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi monoclonali di topo contro l'ICAM-1 umano (anti-ICAM)</td><td>Marlin 1987</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa;-galattosidasi, da chicchi di caffè verde</td><td>Sigma</td><td>G8507-25UN</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Perline di lattice FITC, 100 nm</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>234729-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA433-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo occludina (Y-12), capra policlonale anti-umano</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-27151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Monodansilcadaverina (MDC)</td><td>Sigma</td><td>D4008</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filipin</td><td>Sigma</td><td>F9765</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5-(N-etil-N-isopropil) amiloride (EIPA)</td><td>Sigma</td><td>A3085</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>W1628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Contatore gamma</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Volt-ohmmetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elettrodi TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX100</td><td>Elettrodi disponibili per diverse piastre a pozzetti</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td><td>Malvern</td><td>Nano-ZS90</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

modelli e metodi per valutare il trasporto di drug delivery systems attraverso le barriere cellulari

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Vettori sub-micrometriche (nanovettori; NC) migliorare l&#39;efficacia dei farmaci, migliorando la solubilità, stabilità, tempo di circolazione, il targeting e il rilascio. Inoltre, attraversando le barriere cellulari nel corpo è fondamentale sia per la somministrazione orale di NC terapeutici nella circolazione e il trasporto dal sangue nei tessuti, dove è necessario un intervento. NC trasporto attraverso le barriere cellulari si ottiene: (i) il percorso paracellulare, via transitoria interruzione delle giunzioni che si incastrano celle adiacenti, o (ii) il percorso transcellulare, in cui i materiali vengono internalizzati per endocitosi, trasportato attraverso il corpo cellulare, e secreta sulla superficie cellulare opposta (transyctosis). Consegna attraverso le barriere cellulari può essere facilitata con l&#39;accoppiamento di terapie o loro vettori con agenti di targeting che si legano specificamente a marcatori di superficie cellulare coinvolti nel trasporto. Qui, forniamo i metodi per misurare l&#39;entità e il meccanismo di trasporto NC attraverso una barriera cellulare modello, which è costituito da un monostrato di gastrointestinale (GI), le cellule epiteliali coltivate su una membrana porosa situato in un inserto transwell. Formazione di una barriera di permeabilità è confermata dalla misurazione resistenza elettrica transepiteliale (TEER), trasporto transepiteliale di una sostanza di riferimento, e immunocolorazione delle giunzioni strette. Come esempio, si usano ~ 200 nm NC polimeriche, che portano un carico terapeutica e rivestite con un anticorpo che si rivolge a un determinante superficie cellulare. L&#39;anticorpo o un carico terapeutica è etichettato con 125 I per radioisotopo rintracciamento e NC etichettati vengono aggiunti alla camera superiore sopra il monostrato cellulare per diversi periodi di tempo. NC associati alle cellule e / o trasportati alla camera sottostante può essere rilevato. Misurazione della libera 125 I consente la sottrazione della frazione degradato. Il percorso paracellulare è valutata determinando potenziali variazioni causate dal trasporto NC barriera ai parametri sopra descritti. Transcellulare i trasportis determinata affrontando l&#39;effetto di modulare endocitosi e transcitosi percorsi.

Come validazione del nostro modello cellulare per lo studio trasporto transepiteliale di CN mirati, la figura 2 mostra che Caco-2 monostrati di cellule piastrate ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2 raggiunto confluenza ~ 12 ° giorno e mantenuti integrità monostrato fino al giorno 18, indicato con TEER (Figura 2A). Questo è stato convalidato dalla presenza di giunzioni strette occludina-positivi (Figura 2B) in monostrati con elevata TEER (39...

Molte applicazioni terapeutiche richiedono un trasporto sicuro ed efficiente dei vettori della droga e dei loro carichi attraverso le barriere cellulari nel corpo. Questo articolo descrive un adattamento di metodi consolidati per valutare il tasso e il meccanismo di trasporto di nanocarriers droga (NCS) attraverso le barriere cellulari, come il tratto gastrointestinale (GI) epitelio.

Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci o dell'agente terapeutico che esso trasporta attraverso una barriera cellulare, come ad esempio un modello dell'epitelio gastrointestinale rilevante per la somministrazione orale di farmaci. Questo viene ottenuto coltivando innanzitutto cellule Caco-2 su inserti Transwell, consentendo la differenziazione cellulare e la formazione di un monocstrato cellulare.Il secondo passaggio consiste nel verificare che questo modello rappresenti una barriera di permeabilità misurando la resistenza elettrica transepiteliale, eseguendo la colorazione immunoistochimica delle giunzioni cellulari e valutando la permeabilità passiva di una molecola tracciante rilevabile. Il passaggio successivo è preparare il sistema di somministrazione del farmaco; in questo esempio vengono utilizzati nanocarrier polimerici mirati. I nanocarrier possono contenere o meno un farmaco, e devono essere inclusi controlli come nanocarrier non mirati o il farmaco libero.Questi elementi sono marcati con radioisotopi per consentirne la rilevazione. I vettori vengono quindi aggiunti alla camera apicale sopra il monostrato cellulare dopo l'incubazione. A intervalli temporali variabili, i vettori vengono raccolti dalla camera apicale, dalla camera basolaterale e dal monostrato cellulare e sottoposti a test per verificare il potenziale degrado del componente marcato.Il trasporto del nanocarriero attraverso il monostrato cellulare viene quindi calcolato definitivamente, al fine di studiare il meccanismo di trasporto. Esperimenti simili devono essere condotti in presenza di inibitori farmacologici della trascitosi attraverso le cellule o con marcatori del trasporto paracellulare tra le cellule. La tecnica qui descritta rappresenta un adattamento di metodi ben consolidati utilizzati per valutare la velocità e il meccanismo di trasporto di farmaci e nanoportatori di farmaci attraverso monostrati cellulari in coltura, che rappresentano barriere cellulari nell'organismo.Sebbene l'esempio su cui ci siamo concentrati qui confermi il trasporto di nanoparticelle polimeriche mirate attraverso un modello di epitelio gastrointestinale, metodi simili possono essere applicati anche per esaminare il passaggio di diversi sistemi di somministrazione di farmaci attraverso questi o altri monociti cellulari, come le cellule endoteliali che tipicamente formano una barriera tra il flusso sanguigno e i tessuti e gli organi. Ad esempio, nel caso della barriera ematoencefalica, le persone generalmente alle prime esperienze con questo metodo incontrano difficoltà a causa della complessità nella scelta di marcatori adeguati per tracciare correttamente i sistemi di somministrazione dei farmaci durante questi studi, specialmente quando vengono trasportati attraverso le cellule e in piccole quantità.Per questo aspetto, utilizzeremo radioisotopi per marcare i sistemi di somministrazione dei farmaci nei nostri studi; un'altra preoccupazione importante è la validazione dell'integrità della barriera cellulare del modello e l'uso di controlli appropriati per verificarla durante gli esperimenti. Questa procedura viene eseguita in una cappa di sicurezza biologica sterile di livello due, e tutti i materiali che entrano nella cappa devono essere sterilizzati con etanolo utilizzando pinzette per posizionare inserti transwell in polietilene poroso da 0,8 micrometri in una piastra a 24 pozzetti, al fine di ottenere risultati statisticamente significativi.Ogni condizione sperimentale richiede un minimo di quattro ripetizioni. Diluire cellule di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano o cellule caco due nel mezzo cellulare precedentemente preparato. Aggiungere da 200 a 400 microlitri della soluzione cellulare nella camera superiore o apicale del transwell.Seminare a una densità di 1,5 × 10⁵ cellule per centimetro quadrato. Riempire la camera inferiore o basolaterale con 700-900 µL di mezzo di coltura e coltivare le cellule a 37 °C, 5% di anidride carbonica e umidità al 95% per 16-21 giorni, sostituendo il mezzo ogni tre-quattro giorni nelle camere superiore e inferiore.Sostituire il mezzo nell'ordine seguente per mantenere la pressione al di sopra del monostrato cellulare: aspirare il mezzo dalla camera inferiore, quindi aspirare il mezzo dalla camera superiore. Riempire la camera superiore con 200-400 microlitri di mezzo fresco e la camera inferiore con 700-900 microlitri di mezzo fresco per validare la barriera di permeabilità epiteliale mediante misurazione transepiteliale. Impostare il volt-ohm metro sulla modalità resistenza e posizionare verticalmente gli elettrodi in un pozzetto contenente l'inserto transwell.L'elettrodo corto deve trovarsi nella camera superiore e quello lungo nella camera inferiore, a contatto con il fondo della pozzetta. Una volta che la lettura del voltmetro si stabilizza, registrare il valore della resistenza in ohm per ciascuna pozzetta. Ripetere le misurazioni ogni uno o due giorni fino a quando i valori aumentano raggiungendo un massimo e stabilizzandosi, indicando la formazione di una barriera di permeabilità, processo che in genere richiede da due a tre settimane a partire dal momento del seeding cellulare.Per verificare la presenza di giunzioni strette in monociti cellulari di alto grado, fissare innanzitutto le cellule, aspirare il mezzo da entrambe le camere e lavare le cellule tre volte con DMEM tiepido, quindi incubare con paraformaldeide fredda al 2% per 15 minuti. Dopo 15 minuti, rimuovere la paraformaldeide e lavare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, aggiungere un microgrammo per millilitro di anticorpo anti-occludina a ciascuna.Utilizzeremo pozzetti con bassa permeabilità come controllo negativo per la formazione della barriera. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente le cellule con PBS e quindi aggiungere 7,5 microgrammi per millilitro di anticorpi secondari marcati in ciascun pozzetto, incubando per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Infine, lavare le cellule con PBS ed escindere con attenzione la membrana filtrante alla quale è attaccato il monostrato fissato, montandola su vetrini per l'analisi mediante microscopia epifluorescente, a fluorescenza o confocale.Questa procedura inizia con la marcatura dell'anticorpo bersaglio con iodio 125 e il calcolo dell'attività specifica dell'anticorpo marcato in conteggi al minuto per microgrammo, utilizzando protocolli precedentemente pubblicati. In questo esempio, l'anticorpo bersaglio è un anticorpo monoclonale murino contro la molecola di adesione intercellulare umana, uno o anti-ICAM uno, impiegato come controllo per la specificità. L'IgG murina marcata con iodio 125 verrà utilizzata per preparare nanoportatori ricoperti non mirati, al fine di studiare il trasporto di un carico terapeutico.Il carico è inoltre marcato con iodio 1 25. In questo esempio, il carico è l'alfa galatto SASE o Alpha G, un enzima terapeutico utilizzato per il trattamento della malattia di Fabry, un disturbo genetico da accumulo lisosomiale. Uno degli aspetti più difficili di questa procedura è garantire un'adeguata rilevazione dei materiali trasportati.Per garantire il successo, i componenti dei nanocarrier devono essere marcati con una quantità sufficiente di isotopi ad alta attività specifica. Il passo successivo consiste nell'accoppiare l'anti-ICAM marcata alla superficie dei nanocarrier. In questo caso, si mescola semplicemente l'anti-ICAM marcata con iodio 1 25 con nanostrutture sferiche di polistirene di 100 nanometri di diametro come modello per il controllo non specifico.Utilizzare IgG marcata con iodio 125 e, per tracciare il trasporto di un carico, utilizzare una combinazione di anti-ICAM e alfa-G marcato con iodio 125. Incubare le miscele per un'ora a temperatura ambiente per consentire l'assorbimento sulla superficie; dopo un'ora, centrifugare a 13.000 ×g per tre minuti, quindi rimuovere i corrispettivi non rivestiti nel soprannatante mediante pipetta aspirante. Sospendere il pellet contenente i nano-veicoli rivestiti in albumina sierica bovina al 1% in PBS e successivamente sottoporre a sonica a bassa potenza per interrompere eventuali aggregati di particelle. Aggiungere i nano-veicoli di anti-ICAM marcati con iodio 125 alla camera superiore posta sopra monociti confluenti di Caco-2 con elevata resistenza transepiteliale. Ripetere la procedura per i corrispettivi non specifici e terapeutici dopo aver misurato la permeabilità.Incubare a 37 gradi Celsius per uno o più intervalli di tempo desiderati. Misurare nuovamente lo strappo dopo l'incubazione. Le misurazioni dello strappo servono per valutare gli effetti dei nanoveicoli sulla barriera di permeabilità.Raccogliere il mezzo dalle camere superiore e inferiore. Lavare la camera superiore con 0,5 millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius e la camera inferiore con un millilitro di acqua deionizzata. Raccogliere i lavaggi per la misurazione del contenuto totale di radioisotopo mediante un contatore gamma per la misurazione della frazione cellulare.Escidere il filtro permeabile utilizzando una lametta per tagliare lungo i bordi. Incubare in un tubo per contatore gamma con Triton X-100 all'1% per 10 minuti per rilasciare il contenuto cellulare prima di misurare la radioattività totale associata alle cellule, al fine di quantificare l'iodio 125 rilasciato dai nano vettori durante il trasporto o a seguito di potenziale degradazione. Inizialmente mescolare 300 microlitri di ogni campione con 700 microlitri di BSA al 3% in PBS e 200 microlitri di acido tricloroacetico o TCA, quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Durante questa incubazione di 15 minuti, misurare la radioattività totale dei campioni in un contatore a scintillazione gamma. Centrifugare i campioni di acido tricloroacetico (TCA) a 3000 ×g per cinque minuti per separare la proteina integra dalla proteina degradata o dalla frazione di iodio 125. Quantificare la radioattività della frazione di iodio libero 125 e sottrarre questo valore dalla radioattività totale misurata prima della centrifugazione. Questo consentirà di determinare la quantità di proteina marcata rispetto alla frazione di radiofarmaco staccatasi da essa, al fine di valutare il trasporto paracellulare utilizzando la perdita paracellulare di albumina. Coltivare monocapucci cellulari di KCO2 su inserti transwell, come dimostrato in precedenza, aggiungendo nel compartimento superiore, al mezzo sovrastante il monocapuccio cellulare, o albumina marcata con iodio 125 da sola, come controllo negativo che mostra il livello basale di perdita, oppure iodio.1 25 albumina marcata e anticorpo non marcato con radionuclidi. Incubare i nanoveicoli mirati a 37 gradi Celsius per intervalli di tempo selezionati, che devono corrispondere a quelli esaminati durante il test del trasporto nz. Misurare le lacrime come dimostrato in precedenza, prima, durante e dopo l'incubazione.Raccogliere tutte le frazioni dopo l'incubazione per le misurazioni di iodio totale 1 25 e iodio libero 1 25 come controllo positivo per l'apertura delle giunzioni intercellulari. Aggiungere il mezzo cellulare contenente perossido di idrogeno cinque millimolare nelle camere superiore e inferiore del transwell. Inserire e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Misurare il tear e aggiungere albumina con iodio 1 25 alla camera superiore per gli intervalli di tempo selezionati. Misurare il tear in diversi punti temporali durante l'incubazione per identificare il decadimento del valore del tear causato dall'apertura delle giunzioni cellulari indotta dal perossido di idrogeno. In esperimenti paralleli, valutare il trasporto transcellulare o la transcitosi di nano vettori marcati con iodio 1 25 incubando monocapucci confluenti di Caco due con ciascuno di questi inibitori.50 Micromolar MDC, un inibitore dell'endocitosi mediata da clatrina. Un microgrammo per millilitro di filipina, un inibitore dell'endocitosi mediata da caveole. 0,5 Micromolar WT manina, un inibitore della fosfatidilinositolo tre chinasi, coinvolta nella macropinocitosi, e 20 micromolar di EIPA.Un inibitore della macropinocitosi e dell'endocitosi mediata da chem viene misurato il valore di TEER prima, durante e dopo l'incubazione delle cellule con inibitori e materiali radioattivamente marcati come ulteriore controllo sull'effetto degli inibitori sulla permeabilità del monostrato per validare i monostrati CACO-2 come modello di trasporto trans-epiteliale di nanoportatori mirati, le cellule CACO-2 sono state coltivate su inserti Transwell a una densità di 1,5 × 10⁵ cellule per centimetro quadrato e la resistenza elettrica trans-epiteliale o TEER è stata misurata per valutare l'integrità del monostrato. Come mostrato in questo grafico, il monostrato ha raggiunto la confluenza al giorno 12 e ha mantenuto l'integrità fino al giorno 18. Questo risultato è stato ulteriormente confermato dalla presenza di giunzioni strette positive per occludina nei monostrati con un alto valore di TEER pari a 380 ohm per centimetro quadrato al giorno 14, rispetto all'etichettatura delle giunzioni strette al giorno 5 con un basso valore di TEER pari a 17 ohm per centimetro quadrato. Per valutare il trasporto di nanoportatori anti-ICAM attraverso i monostrati di cellule CACO-2, i monostrati confluenti di CACO-2 coltivati su inserti Transwell sono stati incubati con nanoportatori anti-ICAM marcati con iodio-125 aggiunti alla camera apicale.Il contenuto di iodio 125 nella camera basolaterale è stato misurato nei punti temporali indicati per calcolare la quantità di nano vettori trasportati per cellula, come mostrato nel pannello superiore. Nel pannello inferiore, la percentuale di nano vettori trasportati è stata calcolata come rapporto tra i vettori presenti nella frazione basolaterale e quelli presenti nella frazione combinata basolaterale e cellulare. Questi parametri stimati in questo esempio per i nano vettori anti-ICAM marcati con iodio 125 sono stati confrontati anche con quelli del controllo, ovvero i nano vettori IgG marcati con iodio 125, al fine di dimostrare l'efficienza di trasporto rispetto a un corrispettivo non mirato, e i risultati sono mostrati nel pannello superiore.I coefficienti di permeabilità apparente sono stati inoltre calcolati per riflettere le velocità di trasporto di nano-veicoli contenenti iodio 125 anti-ICAM o nano-veicoli contenenti iodio 125 IgG, come mostrato nel pannello inferiore, quando l'etichetta radioattiva è incorporata nel carico del nanoveicolo. I parametri descritti riflettono il trasporto del carico, che in questo esempio è l'enzima alfa-GA utilizzato per il trattamento di una malattia genetica da accumulo lisosomiale nota come malattia di Fabry. Il contenuto di radioisotopo nelle frazioni apicali, basolaterali e cellulari è stato misurato a tre ore e a 24 ore e convertito in diversi valori rilevanti per il trasporto, come mostrato in questa tabella.Oltre al calcolo del trasporto dei nanocarrier mediante il tracciamento del carico, la somministrazione trans-epiteliale di questo enzima terapeutico può essere stimata esprimendola come numero di molecole o picogrammi di alfa-gal trasportati per cellula. È stato inoltre studiato il meccanismo di trasporto dei nanocarrier anti-ICAM attraverso monociti di Caco. Il trasporto transcellulare di nanocarrier anti-ICAM marcati con iodio-125 attraverso monociti confluenti di Caco-2 è stato valutato dopo 24 ore in assenza o in presenza dei seguenti inibitori: EIPA, Filipina MDC o Wirtmanina. L’EIPA è un inibitore della macropinocitosi e dell’endocitosi mediata da canali. Filipina, MDC e WT menina sono inibitori dell’endocitosi mediata da caveole, dell’endocitosi mediata da clatrina e della macropinocitosi, rispettivamente.Come indicato in questo grafico, l'EIPA ha ridotto il trasporto di nano veicoli contenenti iodio 1 25 anti IAM attraverso monocapate di cellule CACO due, mentre la Filipina MDC e la Wirt Menin non hanno ridotto i livelli di trasporto rispetto alla condizione di controllo. Questo suggerisce che i nano veicoli anti ICAM utilizzano l'endocitosi mediata da chem per il trasporto transcellulare, ma non la traslocazione mediata da clar, clatrina o macropinocitosi.Per valutare il trasporto paracellulare, la resistenza transepiteliale (TEER) è stata misurata durante il trasporto di nanoportatori anti-ICAM marcati con iodio 125 attraverso un monostrato di Caco-2. Sono mostrati i valori di TEER di due monostrati in assenza di nanoportatori come controlli, e l'intervallo tratteggiato indica l'errore standard della media (SEM) dell'incubazione con cinque millimolari di perossido di idrogeno, utilizzato come controllo positivo per l'apertura delle giunzioni intercellulari, come evidenziato dalla riduzione della TEER ai livelli di base.Inoltre, è stata misurata e calcolata la perdita proteica paracellulari, espressa come coefficiente di permeabilità apparente dell'albumina marcata con iodio 125, che attraversa il monostrato cellulare in assenza o in presenza di cinque millimoli di perossido di idrogeno, di nanoveicoli IgG o di nanoveicoli anti-ICAM. Il perossido di idrogeno ha notevolmente aumentato la fuoriuscita dell'albumina marcata con iodio 125 nella camera basolaterale, fungendo da controllo positivo, come mostrato in questi grafici. L'incubazione con nanoveicoli anti-ICAM non ha modificato la perdita paracellulare di albumina marcata con iodio 125 né di lacrime, nel corso di 48 ore, in modo simile ai nanoveicoli IgG di controllo che non vengono trasportati.Questi risultati escludono il trasporto paracellulari e sono coerenti con risultati precedenti che suggeriscono che i nano vettori anti-ICAM utilizzano l'endocitosi mediata da cam per il trasporto transcellulare. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante selezionare uno o più tipi cellulari adatti e un filtro permeabile con dimensione dei pori, materiale, diametro e altre caratteristiche appropriate per il modello Transwell, nonché tecniche di marcatura per una quantificazione efficace del sistema di somministrazione del farmaco dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza o la microscopia elettronica a trasmissione, possono essere utilizzati per determinare la localizzazione dei materiali trasportati e, in aggiunta, per verificare lo stato dei materiali trasportati.Il blotting Western può essere utilizzato per misurare la degradazione delle proteine. L'EISA può essere utilizzata per determinare l'abilità di targeting dei vettori trasportati e l'attività del farmaco trasportato può essere misurata mediante saggi spettrofotometrici o altre tecniche appropriate.

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