Name: Alta Risoluzione intero monte In Situ Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare lespressione genica e la funzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ a montaggio totale ad alta risoluzione per analizzare l'espressione genica spaziotemporale in embrioni di Danio rerio. Questo metodo migliora la sensibilità nella rilevazione di trascritti a bassa abbondanza riducendo il segnale di fondo.

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<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo sviluppato metodi migliori per visualizzare l&#39;RNA con alta risoluzione. Il nelle procedure di ibridazione in situ sono effettuate utilizzando semplici cesti su misura con fondi porosi (Figura 1). Gli embrioni sono trattati con soluzioni RNase-free in piastre da 6 pozzetti a temperatura ambiente in condizioni sterili. Per segregare gli embrioni cestini sono realizzati in diversi tubi colorati Eppendorf. Cestini con o senza cerchio vengono utilizz...

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello animale potente per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, la malattia, il comportamento, e in-droga screening di 1-3. Zebrafish embrioni possono essere ottenuti in gran numero da un singolo incrocio. Fecondazione e sviluppo si verifica ex utero e gli embrioni otticamente chiare sviluppano rapidamente. Eventi critici evolutivi si verificano durante le prime 48 ore dopo la fecondazione (HPF). Ciò include la comparsa di organo primordi e l&#39;avvio di citodifferenziazione. Knockdown o sovra-espressione di proteine ​​può essere raggiunto attraverso la microiniezione di embrioni con antisenso morfolino (MO) oligonucleotidi o mRNA rispettivamente nella fase uno o due celle (0,75 HPF). Il desiderio di embrioni di zebrafish facilita lo studio della espressione spazio-temporale di specifici geni di interesse. Applicazione della tecnica WISH dopo microiniezione di embrioni con mRNA o MO a un eccesso di express o livelli di proteine ​​specifiche atterramento rivela regolazione differenziale di altri geni. Cambiamenti nei modelli di espressione genica possono essere correlati con i cambiamenti fenotipici e rivelano la funzione di geni bersaglio durante la prima organogenesi. Poiché sonde possono essere preparate e conservate in anticipo, la tecnica ISH può essere applicata a rivelare modelli di espressione genica per almeno 20 geni per volta utilizzando piastre a sei pozzetti e cestini misura.

<table><tbody>Kit di clonazione <tr><td>Taq Polimerasi</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA - Doppio promotore pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione del plasmide mini HQ</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione Not1 e HindIII</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo saturo tampone,</td><td>Invitrogen</td> ultrapuro <td>15513039</td><td>conservare a 4 &deg;C. Occhi, pelle e vie respiratorie irritanti e sospetto cancerogeno. Prestare attenzione durante la manipolazione.</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa aspirante.</td></tr><tr><td>DNAsi libera da RNasi I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Preparare piccole aliquote e conservare a -20°C.</td></tr><tr><td>Miscela di marcatura DIG-RNA con RNA polimerasi Sp6, T7 e T3</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Acetato di sodio (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Alcoli commerciali Dietil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>Il DEPC è un irritante per gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e maschera.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M (pH 8,0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi per acquari</td> a<td>sale oceanico istantaneo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Preparare e conservare a -20 gradi C come aliquote da 40 ml per un uso successivo. Il PFA è tossico. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e maschera antipolvere.</td></tr><tr><td>Feniltiocarbomide (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC è altamente tossico. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e maschera antipolvere.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Orologiaio' s) Modello di pinza n. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cluster di colture cellulari a sei pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>I cestelli sono realizzati in rete di nylon e provette Eppendorf</td><td>Preparazione</td><td></td> interna <td>Per realizzare i cestelli, tagliare le provette Eppendorf (1,5 ml) con o senza bordi per rimuovere l'estremità conica. Tagliare la rete di nylon in piccoli pezzi corrispondenti alla dimensione di&nbsp; le estremità tagliate delle provette Eppendorf. Posizionare i tubi con la rete di nylon che copre l'estremità tagliata su un impianto elettrico. piastra riscaldante fino a quando sia il tubo che la rete di nylon non si uniscono (eseguire in cappa aspirante). Tagliare la rete in eccesso dai cestelli e conservarli in metanolo al 100% fino al momento dell'utilizzo.</td></tr><tr><td>Poliossietilenesorbitano Monolaurato (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolammina</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, grado di purezza</td><td>elevato Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina-Citrato di sodio Tampone (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA da lievito di birra tipo X Sigma</td><td></td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Levamisolo cloridrato</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide anidro (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Irritante, tossico, combustibile e sospetto teratogeno. Maneggiare con un abbigliamento di sicurezza adeguato, inclusi guanti e occhiali.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Proteggere questa soluzione dalla luce.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Proteggi questa soluzione dalla luce.</td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino, frazione purificata V (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Pecora Anti-digossigenina-AP Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di acquari</td> <td>oceanici istantanei</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

alta risoluzione intero monte<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Questo articolo si concentra su tutto il montaggio di ibridazione in situ (WISH) di embrioni di zebrafish. La tecnologia WISH facilita la valutazione dell&#39;espressione genica sia in termini di distribuzione tissutale e stadio di sviluppo. Protocolli sono descritti per l&#39;uso di DESIDERIO di embrioni di zebrafish utilizzando RNA antisenso sonde marcate con digossigenina. Le sonde sono generati da incorporare nucleotidi digoxigenin-linked attraverso la trascrizione in vitro su modelli genetici che sono stati clonati e linearizzato. Le chorions di embrioni raccolte a stadi di sviluppo definiti vengono rimossi prima dell&#39;incubazione con sonde specifiche. A seguito di una procedura di lavaggio per rimuovere la sonda in eccesso, gli embrioni vengono incubate con anticorpo anti-digossigenina coniugata con fosfatasi alcalina. Impiegando un substrato cromogenico della fosfatasi alcalina, specifica espressione genica può essere valutata. A seconda del livello di espressione genica l&#39;intera procedura può essere completata entro 2-3 giorni.

Utilizzando il protocollo con 50 embrioni per cesto (per gene / per condizione sperimentale) il pattern di espressione di tale gene può essere ottenuto in un esperimento. Quasi tutti gli embrioni presentano profili di espressione simili per un gene particolare. Esempi rappresentativi di ibridazione in situ colorazione sono mostrati nelle Figure 3-6. Sia il senso e anti-senso ribosonde stati sintetizzati dai cDNA corrispondenti a PC5.1 PC5.2, 6, 7, SCL/tal...

Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L&#39;espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere determinata<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione. Nostra migliore protocollo permette l&#39;individuazione di bassi trascritti abbondanti con basso segnale sfondo non specifico.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'espressione temporale spaziale di specifici geni di interesse all'interno di embrioni di zebrafish in stadi. Ciò si ottiene generando prima sonde CD NA incorporando l'ossigeno digo nei nucleotidi collegati utilizzando la trascrizione in vitro. Successivamente, gli embrioni vengono raccolti in fasi di sviluppo definite.Il corium viene rimosso e gli embrioni vengono conservati in metanolo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Successivamente, dopo la digestione e la post fissazione, gli embrioni vengono ibridati con le apposite sonde. Infine, gli embrioni vengono colorati con il gene antidico e gli anticorpi e il segnale viene sviluppato con substrati per la fosfatasi alcalina.In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la distribuzione tissutale dell'espressione genica in un dato stadio di sviluppo attraverso l'ibridazione e l'imaging in situ dell'intera montatura. Sebbene questo metodo possa fornire maggiori informazioni sulla normale espressione del gene bersaglio, può essere applicato anche ad altre condizioni come l'espressione del gene bersaglio nel modello di malattia e quando altri geni sono sovra o

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Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.

Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

Scopri l'ibridazione in situ a montaggio totale ad alta risoluzione per analizzare l'espressione genica spaziotemporale in embrioni di Danio rerio. Questo metodo migliora la sensibilità nella rilevazione di trascritti a bassa abbondanza riducendo il segnale di fondo.

Alta Risoluzione intero monte

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