Alta Risoluzione intero monte
19 ottobre 2013
Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere determinata In situ Ibridazione. Nostra migliore protocollo permette l'individuazione di bassi trascritti abbondanti con basso segnale sfondo non specifico.
L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'espressione temporale spaziale di specifici geni di interesse all'interno di embrioni di zebrafish in stadi. Ciò si ottiene generando prima sonde CD NA incorporando l'ossigeno digo nei nucleotidi collegati utilizzando la trascrizione in vitro. Successivamente, gli embrioni vengono raccolti in fasi di sviluppo definite.
Il corium viene rimosso e gli embrioni vengono conservati in metanolo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Successivamente, dopo la digestione e la post fissazione, gli embrioni vengono ibridati con le apposite sonde. Infine, gli embrioni vengono colorati con il gene antidico e gli anticorpi e il segnale viene sviluppato con substrati per la fosfatasi alcalina.
In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la distribuzione tissutale dell'espressione genica in un dato stadio di sviluppo attraverso l'ibridazione e l'imaging in situ dell'intera montatura. Sebbene questo metodo possa fornire maggiori informazioni sulla normale espressione del gene bersaglio, può essere applicato anche ad altre condizioni come l'espressione del gene bersaglio nel modello di malattia e quando altri geni sono sovra o sottoespressi. Utilizzando la tecnologia di microiniezione Utilizzando il CDNA per un gene di interesse, impostare una reazione di marcatura dell'RNA per sintetizzare l'ossigeno digo in sonde di RNA marcate in una fiala di reazione libera da RNA aggiungendo da uno a cinque microgrammi di DNA stampo purificato a RNA sterili privi di acqua distillata fino a un volume di 13 microlitri.
Raffreddare la reazione su ghiaccio e aggiungere i seguenti reagenti dopo aver mescolato delicatamente centrifuga a 2000 RPM per 30 secondi a temperatura ambiente prima di incubare la reazione per due ore a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione, rimuovere il DNA stampo aggiungendo due microlitri di RNA liberi. I DNA incubano per 30 minuti a 37 gradi Celsius e interrompono la reazione aggiungendo due microlitri di EDTA 0,2 molari, precipitano i prodotti della reazione aggiungendo 2,5 microlitri di cloruro di litio molare e 75 microlitri di etanolo al 100%. Mescolare la soluzione e incubare a 20 gradi Celsius negativi per 45 minuti o durante la notte.
Centrifugare la sospensione per 30 minuti a 13.000 giri/min e quattro gradi Celsius. Quindi lavare il pellet con ghiaccio freddo, etanolo al 70% dopo la centrifuga per 10 minuti. Asciugare il pellet per due minuti prima di risus, sospendendolo in 50 microlitri di nucleasi, acqua doppia distillata libera.
Quindi incubarlo per 30 minuti. A 37 gradi Celsius, far scorrere uno o due microlitri della sonda su un gel all'1% di aros per circa 30 minuti per verificarne la qualità e l'integrità. Quindi utilizzare uno spettrofotometro per quantificare la sonda per reidratare gli embrioni precedentemente fissati e congelati.
Inizia creando cestini tagliando le estremità coniche di microtubi da 1,5 millilitri. Quindi rimuovere i bordi superiori da metà di essi. Taglia piccoli pezzi di rete di nylon per coprire le estremità, quindi in una cappa leggera, riscalda le estremità del tubo su una piastra elettrica e premile nella rete dopo che si sono raffreddate.
Rimuovere la rete di nylon in eccesso e conservare i cestelli in metanolo al 100% a temperatura ambiente. Dopo aver preparato una successiva diluizione del metanolo in PBS, secondo il protocollo di testo e l'aggiunta di quattro millilitri di ciascuno nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti, posizionare gli embrioni in cestelli individuali per ogni sonda e incubarli nella serie PBS di metanolo per cinque minuti per pozzetto, terminando con tre lavaggi in PBST. Permeare gli embrioni con proteinasi K a temperatura ambiente, utilizzando i seguenti tempi di incubazione per fase di sviluppo.
Quindi fissare gli embrioni in aldeide paraforme al 4% in PBS per 20 minuti e lavarli in PBST tre volte per cinque minuti ciascuna. Successivamente, preparare la miscela di acetilazione secondo il protocollo di testo e incubare gli embrioni due volte per 10 minuti ciascuno. Quindi lavare gli embrioni e PBST due volte per 10 minuti ciascuno.
Trasferire gli embrioni in microprovette sterili e incubare con 200 microlitri di miscela di ibridazione o HM, in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per due o quattro ore. Aggiungere da 100 a 200 nanogrammi di sonda alla soluzione e incubare per una notte a 70 gradi Celsius a bagnomaria. Sostituire la soluzione della sonda con HM preriscaldato e incubare i campioni a 70 gradi Celsius per 15 minuti.
Dopo aver sottoposto i campioni a una serie H-M-S-S-C e aver bloccato gli embrioni secondo il protocollo di testo, incubare gli embrioni in una diluizione da uno a 5.000 di anticorpi anti-D AP in tampone bloccante durante la notte a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione il giorno successivo. Lavare gli embrioni sei volte per 15 minuti ciascuna. Dopo aver colorato gli embrioni, incubarli in BCIP e NBT.
Aggiungere la temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Utilizzare uno stereomicroscopio per monitorare la reazione di colorazione ogni 30 minuti per fermare la reazione. Trasferire i cestelli degli embrioni in pozzetti contenenti la soluzione di arresto due volte per 10 minuti ciascuna con una leggera agitazione.
Dopo aver fissato gli embrioni con il 4% di para formaldeide in PBS per 20 minuti. Monta gli embrioni trasferendoli nella minor quantità possibile di PBS in piastre a sei pozzetti contenenti glicerolo al 100%. Cullare delicatamente gli embrioni al buio a temperatura ambiente, immagine notturna in glicerolo al 100% sotto uno stereomicroscopio.
Qui vengono mostrati esempi rappresentativi di colorazione situ-ibridazione. La colorazione viola osservata dopo l'ibridazione con la sonda ribo di interesse rappresenta sia l'abbondanza che i siti di espressione di un particolare gene. Ad esempio, PC 5.1 mostra un'espressione molto discreta all'interno della parte anteriore e posteriore della vescicola otica e della linea laterale primordiale a 24 ore dopo la fecondazione ed è fortemente localizzato all'interno delle linee neuro anteriori e posteriori entro 72 ore dopo la fecondazione.
Al contrario, il PC 5.2 mostra un'espressione ubiquitaria all'interno del SNC con una distinta regionalizzazione all'interno della vescicola otica dei somiti e del dotto fric prono, ed è altamente espresso all'interno del fegato e dell'intestino a 96 ore dopo la fecondazione. L'assenza di espressione genica quando si utilizzano le rispettive sonde Ribo sensoriali funge da controllo negativo, come si vede qui. Le analisi di espressione dei marcatori ematici hanno mostrato la colorazione di SCL T one all'interno delle cellule craniche bilaterali e nella massa cellulare intermedia o ICM.
Sebbene la colorazione per gata one sia visibile anche all'interno dell'ICM, il modello di espressione è diverso. L'espressione di F-L-K-K-D-R-L è stata osservata all'interno dei vasi principali e intersegmentali del cervello posteriore, e nell'ICM è stata osservata la colorazione per il riccio sonico nel no cord. In questi esempi, l'espressione di DLX due a 34 ore dopo la fecondazione è localizzata nell'ipotalamo Talon Cephalon e negli archi cranio mesenchimali e nell'FK D seven Fox, un'espressione a 24 ore dopo la fecondazione è osservata principalmente nella placca del pavimento e nell'espressione di HypoChlor.
I modelli dei marcatori pancreatici hanno mostrato una colorazione dell'insulina nel pancreas endocrino e della tripsina nel pancreas esocrino. I risultati che mostrano pattern di espressione ad alta risoluzione confermano il successo del protocollo delineato per la rilevazione dell'espressione di geni sia ad alta che a bassa abbondanza mostrati. Ecco alcuni esempi di esperimenti condotti in alcune condizioni ottimali.
Ad esempio, un segnale di fondo elevato con scarsa espressione sonica del riccio risultava da un'ibridazione inadeguata, permeabile e compresa tra 55 e 60 gradi Celsius. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'intera montatura in due ibridazione di embrioni di pesce zebra utilizzando sonde di RNA marcate con fossato, colorazione post-ibridazione e imaging.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo perfezionato per valutare l'espressione spaziale e temporale di geni specifici negli embrioni di pesce zebra. Il metodo migliora il rilevamento di trascritti poco abbondanti riducendo al minimo i segnali di fondo non specifici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Analisi dell'espressione genica
Sfondo
- Il pesce zebra è ampiamente utilizzato come organismo modello per lo studio dello sviluppo dei vertebrati.
- L'ibridazione in situ è una tecnica fondamentale per la visualizzazione dell'espressione genica.
- Protocolli migliorati possono portare a una migliore rilevazione di trascritti a bassa abbondanza.
- Comprendere la funzione dei geni è fondamentale per ottenere informazioni sui processi dello sviluppo e sulle malattie.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per rilevare l'espressione genica negli embrioni di pesce zebra.
- Migliorare la sensibilità delle tecniche di ibridazione in situ.
- Facilitare lo studio della funzione genica durante lo sviluppo.
Metodi Utilizzati
- Generazione di sonde di cDNA mediante trascrizione in vitro.
- Isolamento di embrioni in stadi di sviluppo definiti.
- Conservazione degli embrioni in metanolo a -20 gradi Celsius.
- Ibridazione degli embrioni con sonde specifiche e successiva colorazione.
Risultati principali
- Rilevamento efficace di trascritti a bassa abbondanza negli embrioni di zebrafish.
- Segnali di fondo non specifici ridotti rispetto ai metodi precedenti.
- Visualizzazione migliorata dei pattern di espressione genica.
- Protocollo applicabile a diverse fasi dello sviluppo del zebrafish.
Conclusioni
- Il protocollo migliorato potenzia in modo significativo l'analisi dell'espressione genica nel pesce zebra.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione della funzione genica nello sviluppo dei vertebrati.
- Questo metodo può rappresentare uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'ibridazione in situ su preparato intero (WISH) ad alta risoluzione in embrioni di pesce zebra consente una mappatura spaziale e temporale precisa dell'espressione genica, supportando la validazione precoce del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistica nella scoperta di farmaci. Questo approccio fornisce prove solide riguardo alla funzione genica e all'espressione tissuto-specifica, orientando le decisioni di portafoglio e le strategie di ricerca traslazionale. La capacità del metodo di distinguere trascritti sia ad alta che a bassa abbondanza migliora l'affidabilità predittiva in punti critici della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della funzione genica e del coinvolgimento nelle vie metaboliche in un modello vertebrale.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici mediante la visualizzazione dell'espressione genica specifica per tessuto e nello sviluppo.
- Facilita la previsione dell'affidabilità nella selezione del bersaglio attraverso dati spaziali ad alta risoluzione.
- Fornisce evidenze per la validazione funzionale del bersaglio in contesti rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara modelli validati di pesce zebra per flussi di lavoro di screening fenotipico successivi.
- Standardizza le letture dell'espressione genica per garantire riproducibilità e confronti quantitativi.
- Permette la scalabilità del saggio supportando l'analisi multiplex di sonde attraverso diverse fasi di sviluppo.
- Fornisce dati affidabili sull'espressione spaziale per la valutazione di composti e la preparazione allo screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli di espressione genica a modelli di malattia per la scoperta traslazionale di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica in sistemi vertebrati.
- Supporta l'avanzamento basato sul rischio chiarificando la funzione genica in tessuti rilevanti.
- Fornisce una riduzione del rischio di tipo meccanicistico per i bersagli candidati prima degli studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
WISH negli embrioni di pesce zebra si integra nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale delle ipotesi all'identificazione dei candidati e alla validazione preclinica, offrendo una piattaforma riutilizzabile per l'analisi dell'espressione genica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la mappatura dell'espressione genica in situ.
- Screening: Fornisce letture spaziali quantitative e riproducibili per lo sviluppo di saggi e flussi di lavoro di screening.
- Analisi: Offre immagini ad alta risoluzione e dati quantitativi sull'espressione genica per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega la ricerca di base e la ricerca preclinica allineando l'espressione genica ai modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e scalabile per studi ripetuti sull'espressione genica in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dell'analisi dell'espressione genica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale chiarificando precocemente il rischio biologico.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione di programmi di scoperta adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei zebrafish, nella sintesi delle sonde e nell'analisi delle immagini.
- Richiede l'accesso a strumentazione di biologia molecolare e a microscopia ad alta risoluzione.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la progettazione delle sonde e i protocolli di ibridazione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse fasi di sviluppo o bersagli genici.
- Limitazioni potenziali includono segnali di fondo qualora le condizioni di permeabilizzazione o di ibridazione non siano ottimali.
