Name: I saggi di redditività per le cellule in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Impara saggi di vitalità cellulare per biologia cellulare usando ATP, immunomarcatura e imaging infrarosso. Questo metodo combina analisi funzionali e strutturali per valutare la salute cellulare in modo oggettivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Riconosciamo Juliann Jaumotte per l&#39;idea di risparmiare sui volumi di reagenti nel saggio ATP. Siamo profondamente grati per l&#39;eccellente supporto amministrativo di Maria Caruso, Deb Willson, e Jackie Farrer e alla Scuola di Farmacia Mylan per fornire un sostegno finanziario per questi studi. Un ringraziamento anche a causa delle malattie Hunkele temuto Fondazione e il Parkinson e Disordini del Movimento Fondazione per il sostegno finanziario degli studi primarie neuronali.

Nessuno degli autori ha conflitti da dichiarare.

Abbiamo scoperto che la potenza del segnale in tutte e tre saggi di vitalità è lineare e correlazione con la densità di placcatura. Tuttavia, non tutti i saggi sono ugualmente sensibili a 2 volte o cambiamenti di 1,5 volte in densità di placcatura. Per le cellule N2a, i saggi infrarossi sono meno sensibili di dosaggio ATP, particolarmente a basse densità di placcatura. Sebbene i saggi infrarossi sono meno sensibili di ATP, i DRAQ5 + zaffiro saggi e saggi α-tubulina sono in buon accordo in che rivelano l&#39;impatto alta...

Il saggio vitalità più comune nelle scienze biologiche comporta la conta delle cellule. Ciò è dimostrato da un&#39;analisi delle superiori (più recenti) 200 pubblicazioni apparse in PubMed sia con le parole chiave &quot;in vitro&quot; o &quot;cultura&quot; a 2013/04/29 e 2013/04/30. Di queste pubblicazioni, il 23,5% utilizzati saggi di conta delle cellule, compresi i manuali numero di cellulare conteggi, numero di cellulare automatizzata conta con il software di imaging, e Trypan esclusione blu. Il / dosaggio Morto Live è stato usato in 1% di queste pubblicazioni. Il numero di pubblicazioni che utilizzano il MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) test per la vitalità metabolica era l&#39;11%. Questa rassegna della letteratura mostra anche che il numero di pubblicazioni usando saggi come MTT in combinazione con saggi conteggio cellulare era solo 3,5%. Nonostante la tendenza ad utilizzare un dosaggio vitalità di per sé, la valutazione della funzione cellulare in associazione con il numero di cellule sembra la scelta migliore per valutare i cellularintegrity. Conta delle cellule da soli non sono sufficienti perché le cellule rimanenti non possono essere funzionali o sani anche se sono presenti nel pozzo 1,2. Viceversa, misure funzionali quali ATP possono aumentare o diminuire in assenza di variazioni parallele nel numero di cellule. Il disaccoppiamento di letture metaboliche da numero di cellulare suggerisce che ATP e MTT test non dovrebbero mai essere utilizzati come unico saggio di redditività. Nella presente relazione, tre saggi di vitalità che il sondaggio sia le strutture cellulari e funzione metabolica sono descritti, per una visione più completa della integrità cellulare di qualsiasi test di per sé può permettersi. Due dei nostri saggi richiedono un Termovisore che misura la fluorescenza nei canali 700 e 800 nm. Il rumore è basso nelle lunghezze d&#39;onda infrarosse, portando a maggiori rapporti 3 segnale-rumore. L&#39;imager Odissea che usiamo ha una gamma dinamica 4,5 log e un po &#39;profondità di 16, Translating di 2 16 o 65.536 tonalità di infrarossi. Questo può essere contrapposta a immagini a colori a 8 bit, che offre solo 2 8 o 256 tonalità di colore per ogni lunghezza d&#39;onda. Così, a 16 bit di imaging ha una risoluzione più fine. Va notato che le immagini infrarosse originali vengono pseudocolored verde (800 nm) e rosso (700 nm) in rapporti pubblicati per la presentazione. Imager Odyssey sono comunemente utilizzati sia per Western blotting e In-Cell western 4-7. In-Cell western sulle cellule formaldeide-fisso utilizzano anticorpi primari contro qualsiasi proteina di interesse ed etichettarli in giro con anticorpi secondari fluorescenti a raggi infrarossi. Questa tecnica è nota per essere particolarmente utile per gli endpoint fosforilazione 6. Nella nostra In-Cell western, abbiamo macchiare cellule fissate per le proteine ​​del citoscheletro α-tubulina o microtubuli neuronali proteina associata 2 (MAP2) nel canale 800 nm. Queste proteine ​​sono abbastanza abbondanti per produrre elevati rapporti segnale-rumore. Abbiamo anche macchiare i nostri piatti in 700canale nm per nuclei con la macchia DRAQ5 e per il citoplasma con la macchia zaffiro. Entrambe le proteine ​​del citoscheletro e le DRAQ5 + macchie Sapphire riflettono quindi le strutture cellulari. Il terzo saggio di redditività misura la funzione metabolica e si chiama &quot;Cell Titer Glo.&quot; In questo saggio basato luciferasi-, valori di luminescenza sono direttamente proporzionali ai livelli di ATP. Saggi ATP sono comunemente usati per quantificare cellule vitali 8-12. Tuttavia, compresa la parola &quot;titolo&quot; nel nome del saggio è un termine improprio perché ATP uscita per cella può cambiare in funzione di trattamenti tossina e quindi non è sempre proporzionale al numero di cellule 8. Livelli di ATP possono anche essere influenzati da ritmi circadiani 13 e 14 la divisione cellulare e la differenziazione cellulare 15. Tuttavia, il saggio ATP mostrato qui è semplice da eseguire e utile perché ATP è una misura robusta metabolicaredditività 16-21, se non cellulare il numero di per sé. Usando questo test per completare l&#39;infrarosso In-Cell western cede quindi un quadro più completo della integrità cellulare di qualsiasi saggio da solo.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Acquista in quantità da 100 ml e aliquota, invece di acquistare la più costosa quantità da 10 ml. I reagenti ricostituiti e non utilizzati possono essere ricongelati a -20 gradi C per almeno 21 settimane</td></tr><tr><td>18% Formalina</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>L'acquisto di questo fissativo evita la pesatura delle polveri di formaldeide e l'ebollizione della soluzione; l'esposizione ai vapori è quindi ridotta al minimo</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Non è indispensabile aggiungerlo alle soluzioni di formaldeide ma migliora l'aspetto delle celle fisse</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Questo siero di pesce può essere acquistato all'ingrosso e congelato a -20 gradi; C per uso a lungo termine</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Conserviamo una soluzione madre al 10% di Triton-X 100 in acqua sterile a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Si possono anche acquistare compresse di PBS o 10 soluzioni PBS, ma sono più costose</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Vedi sopra</td></tr><tr><td>Sodio azide (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Non comprare la polvere perché l'azide di sodio è molto tossica. Conserviamo tutti i nostri anticorpi usati in 1x sodio azide a 4 gradi C fino a quando non vengono contaminati da detriti</td></tr><tr><td>Anti-alfa;-tubulina di topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Questo anticorpo è costoso ma può essere notevolmente diluito ed è altamente specifico</td></tr><tr><td>Anti-MAP2 di topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Questo anticorpo è costoso ma è altamente specifico (un prerequisito per In-Cell Westerns)</td></tr><tr><td>800 nm IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Altre aziende vendono anche anticorpi secondari a infrarossi. Assicurati di acquistare gli anticorpi altamente adsorbiti in modo incrociato e tieni presente che le concentrazioni di IgG possono variare a seconda della fonte</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Questo composto veniva venduto da LI-COR a 1 mM</td></tr><tr><td>Zaffiro</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 contatore multilabel</td><td></td>1420</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore/miscelatore</td><td>Research Products International</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

i saggi di redditività per le cellule in coltura

Viability Assays for Cells in Culture

Conta delle cellule manuali su un microscopio sono un mezzo sensibile per valutare la vitalità cellulare, ma sono in termini di tempo e quindi costoso. Test di vitalità computerizzati sono costose in termini di attrezzature, ma può essere più veloce e più obiettivo di conta delle cellule manuali. La presente relazione descrive l&#39;uso di tre di questi test di vitalità. Due di questi saggi sono infrarossi e uno è luminescente. Entrambi i saggi infrarossi si basano su un Imager Odyssey 16 bit. Un saggio infrarossi utilizza la macchia DRAQ5 per nuclei combinati con la macchia zaffiro per citosol e viene visualizzato nel canale 700 nm. L&#39;altra analisi a raggi infrarossi, un In-Cell occidentale, utilizza anticorpi contro le proteine ​​del citoscheletro (α-tubulina o microtubuli proteina associata 2) e le etichette nel canale 800 nm. Il terzo saggio vitalità è un saggio luminescente comunemente usato per ATP, ma usiamo un quarto del volume consigliato di risparmiare sui costi. Queste misurazioni sono affatto lineare e correlazione con il numero di ceLLS placcato, ma variano in sensibilità. Tutti e tre saggi eludere microscopio che richiede tempo e assaggiare l&#39;intero bene, riducendo errore di campionamento. Infine, tutti i saggi possono facilmente essere completata entro un giorno della fine dell&#39;esperimento, consentendo un maggior numero di esperimenti da eseguire entro brevi tempi. Tuttavia, tutti si basano sul presupposto che il numero di cellule rimangono in proporzione alla potenza del segnale dopo il trattamento, un presupposto che a volte non viene soddisfatta, soprattutto per ATP cellulare. Inoltre, se le cellule aumentano o diminuiscono in dimensioni dopo il trattamento, questo potrebbe influenzare la potenza del segnale senza compromettere numero di cellulare. Concludiamo che tutti i saggi di redditività, inclusi i conteggi manuali, risentono di una serie di avvertimenti, ma che i test di vitalità informatici sono ben merita l&#39;investimento iniziale. Utilizzando tutti e tre saggi insieme produce una visione completa della struttura e della funzione cellulare.

Il fattore limitante in questi esperimenti è la colorazione infrarossi, come il saggio ATP è relativamente breve durata. Per i saggi infrarossi, anticipiamo che otto piastre da 96 pozzetti possono essere colorati e scansione entro un giorno incredibile cifra di due lotti di quattro piastre ciascuno (vedi Figura 1). Questa stima assume 20 min di fissazione, 30 min di lavaggio, 30 min di blocco, 2 ore di incubazione anticorpo primario seguita da 30 minuti di lavaggi, 1 ora di incubazione anticorpo seconda...

Composti terapeutici sono spesso prima esaminate in vitro con saggi di vitalità. Conta delle cellule cieche da un osservatore umano può essere molto sensibile alle piccole variazioni di numero di cellulare, ma non valutare la funzione. Test di vitalità computerizzati, come qui descritto, in grado di valutare sia la struttura e la funzione in modo obiettivo.

I saggi di redditività per le cellule in coltura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire più saggi di vitalità che forniscono una visione più completa dell'idoneità cellulare rispetto a quanto possibile con un singolo saggio. Ciò viene ottenuto innanzitutto misurando i livelli di ATP nelle cellule piastrate al fine di valutare la funzione metabolica. Il secondo passaggio consiste nell'immunomarcare proteine del citoscheletro come la tubulina alfa o la proteina associata ai microtubuli due, utilizzando anticorpi a infrarossi con lunghezze d'onda di 800 nanometri.Successivamente, le cellule vengono marcate con drac cinque infrarosso e sapphire per colorare il nucleo e il citoplasma a 700 nanometri. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire l'immagine dell'alpha tubulina o della map due e del drac cinque più sapphire alle lunghezze d'onda di 700 e 800 nanometri su un rilevatore infrarosso. In definitiva, questi saggi luminiscenti e infrarossi forniscono informazioni sia sulle strutture anatomiche che sulla funzione fisiologica.Il principale vantaggio di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di vitalità MTT, è la misurazione rapida e sensibile di diversi aspetti dell'integrità cellulare. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della neuroscienze e della farmacologia, ad esempio se composti terapeutici siano in grado di proteggere le strutture anatomiche e la funzione metabolica. Per iniziare, raccogliere e rinfondere le cellule in 100 o 200 microlitri di mezzo a diverse densità cellulari in una piastra a 96 pozzetti come descritto nel protocollo allegato, riempiendo i pozzetti circostanti con 200 microlitri di acqua sterile per ridurre gli effetti di evaporazione ai bordi.Lasciare che le cellule aderiscano tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con atmosfera controllata di CO2. Il giorno successivo, rimuovere 50 dei 100 microlitri di mezzo oppure 150 dei 200 microlitri di mezzo, in modo da lasciare 50 microlitri di mezzo in ogni pozzetto. Successivamente, aggiungere 25 microlitri del reagente Cell Titer Glow in ciascuno dei pozzetti interni delle colonne due fino a sei.Per ottenere un'analisi da uno a due nelle colonne da sette a undici e nelle righe da B a D, aggiungere 50 microlitri del reagente Cell Titer-Glo per ottenere un'analisi uno a uno nelle pozzette rimanenti. Colonne da sette a undici, righe da E a G. Non rimuovere alcun mezzo, ma aggiungere invece 100 microlitri di reagente Cell Titer-Glo per ottenere un'analisi uno a uno in un volume totale di 200 microlitri. Posizionare immediatamente la piastra su un agitatore verticale o orbitale per 10 minuti per mescolare i campioni durante l'incubazione.Quindi trasferire 60 microlitri da ogni pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con pareti bianche. I valori di luminiscenza sono più elevati nelle piastre bianche rispetto a quelle trasparenti o nere poiché riflettono la luce verso l'alto, in direzione del rivelatore. Se durante il trasferimento si formano bolle d'aria, eliminarle utilizzando un getto d'aria forzata proveniente dalla pompetta di una pipetta di plastica.Poi entro 12 minuti dall'aggiunta dei reagenti, posizionare la piastra su un luminometro e leggere i valori di luminescenza. Calcolare la media dei valori luminiscenti provenienti dalle tre o sei pozzette di ciascun gruppo e riportarli in funzione del numero di cellule, procedendo con la diluizione più alta dei reagenti che comunque fornisce risultati lineari e proporzionali come definito nel testo allegato. Questo permetterà di ridurre i costi per i saggi infrarossi; raccogliere quindi le cellule e risospendere a diverse densità come descritto nel protocollo di testo allegato.Riempire le pozzette circostanti con 200 microlitri di acqua sterile per ridurre l'effetto dei gradienti di temperatura e dell'evaporazione ai bordi. Lasciare aderire le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore tamponato con CO2, quindi fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di un fissativo, ad esempio 4% formaldeide e 4% saccarosio in tampone fosfato 0,1 molare. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi rimuovere il fissativo e lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS.Successivamente, diluire la soluzione di blocco uno a uno in PBS e aggiungere il 0,3% di Triton X-100 come agente permeabilizzante per le cellule. Quindi aggiungere 35 microlitri della soluzione di blocco in ogni pozzetto, avendo cura di evitare la formazione di bolle d'aria nei pozzetti. Incubare la piastra con la soluzione di blocco per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Durante questa incubazione, diluire gli anticorpi primari per le proteine di interesse. Ad esempio, diluire l'anticorpo primario Antifa tubulinino, uno a 10.000 in una miscela uno a uno di buffer bloccante e PBS con 0,3% TRITTON X 100 durante l'ottimizzazione della procedura di prova. Ulteriori diluizioni di anticorpi qui, l'anticorpo primario Antifa tubulinino viene anche diluito uno a 5.000 in una miscela uno a uno di buffer bloccante e PBS con 0,3% Triton X 100. Successivamente, aggiungere gli anticorpi alle concentrazioni indicate qui alle cellule fissate sulla piastra. Assicurarsi di lasciare i pozzetti del controllo negativo nella colonna due nella soluzione di blocco, poiché saranno esposti solo agli anticorpi secondari. Incubare le cellule con gli anticorpi primari da una a due ore a temperatura ambiente oppure tutta la notte a quattro gradi Celsius.Successivamente, preparare gli anticorpi secondari anti-topo IgG da 800 nanometri diluendoli uno a 1000 o uno a 2000 in una miscela uno a uno di buffer bloccante e PBS con 0,3% di Triton X-100, dopo l'incubazione con l'anticorpo primario. Lavare le pozzette tre volte per 10 minuti ciascuna con 200 microlitri di PBS per pozzetta, quindi aggiungere 35 microlitri di anticorpi secondari nelle pozzette.Aggiungere il saggio in diluizione 1:1000 alla metà superiore della piastra e il saggio in diluizione 1:2000 alla metà inferiore. Incubare le cellule con gli anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce. Successivamente, rimuovere gli anticorpi secondari non legati eseguendo tre lavaggi di 10 minuti ciascuno con PBS, utilizzando 200 microlitri per pozzetto ogni volta.Successivamente, diluire il DRAC five stock di uno a 10.000 per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micromolare e il sapphire stock di uno a 1000 in PBS con 0,3% di Triton X-100. Aggiungere 35 microlitri di questa miscela alla metà sinistra della piastra, ma non aggiungere nulla ai pozzetti di controllo negativo della colonna due. Per la metà destra della piastra, aggiungere 35 microlitri di drac five diluito di uno a 20.000 e di sapphire diluito di uno a 2000.Incubare in queste soluzioni per 30 minuti a temperatura ambiente, al buio. Quindi lavare la piastra tre volte con 200 microlitri di PBS per pozzetto, per 10 minuti ciascun lavaggio. Iniziare scansionando le piastre sull'immaginatore a infrarossi con intensità cinque e una risoluzione di 169 micrometri.Impostazioni di qualità media o bassa sono sufficienti. Quindi eseguire la scansione a diversi offset di messa a fuoco di 2,5 millimetri, 3,0 millimetri, 3,5 millimetri e 4,0 millimetri per determinare dove si ottiene il rapporto segnale-rumore più elevato e un segnale più nitido. Una volta ottimizzato l'offset di messa a fuoco, utilizzare la funzione incel western del software per posizionare una griglia delle dimensioni appropriate sull'immagine della piastra ed esportare i dati in Microsoft Excel.Sottrarre la media delle intensità integrate nei pozzetti di controllo negativo da ogni punto dati corrispondente nei canali a 700 e 800 nanometri. Successivamente, calcolare la media delle intensità del segnale integrato per ogni gruppo di pozzetti e riportare i dati in un grafico a dispersione in funzione della densità cellulare dopo l'ottimizzazione. L'intensità del segnale in tutti e tre i saggi è risultata significativamente correlata al numero di cellule per pozzetto; sebbene tutti e tre i saggi fossero altamente lineari, non erano equivalenti in termini di sensibilità.Il saggio ATP ha mostrato la sensibilità più elevata tra i tre, definita come la variazione più proporzionale dell'emissione luminosa in seguito alla riduzione del numero di cellule nelle cellule neuronali primarie di ratto. Le concentrazioni ottimali dei reagenti erano diverse e i saggi hanno mostrato una minore linearità nell'intero intervallo del saggio. Tuttavia, entrambi i saggi si sono dimostrati lineari e sensibili a densità di semina inferiori a 100.000 cellule, come mostrato qui.Le nostre curve di risposta alla dose di cellule di neuroblastoma trattate con MG 132, un inibitore del proteasoma, hanno mostrato che MG 132 è stato applicato in presenza o in assenza del precursore del glutatione e della N-acetilcisteina; la N-acetilcisteina sposta tutte e tre le curve verso destra. Ad esempio, la IC50 misurata mediante DRAC5 più sapphire era di 1,64 micromolare di MG 132 in assenza di N-acetilcisteina e di 4,64 micromolare di MG 132 in presenza di N-acetilcisteina. Questo risultato è simile ai valori ottenuti nel saggio dell'alfa-tubulina, pari rispettivamente a 1,96 micromolare e 6,35 micromolare di MG 132.Tuttavia, i livelli di ATP sono aumentati a basse concentrazioni di MG 132, un fenomeno chiamato ormesi. Questi dati mostrano che i livelli di ATP non sono necessariamente proporzionali al titolo cellulare dopo il trattamento e che l'N-acetilcisteina può proteggere anche la funzione metabolica. Una volta padroneggiato, il saggio luminometrico dell'ATP può essere completato entro 30 minuti, mentre la colorazione a infrarossi può essere facilmente completata entro otto ore.Nel tentativo di eseguire queste procedure, è importante ricordare che esse non misurano il numero di cellule nello stesso modo di un microscopio ad alta risoluzione. Ad esempio, un limite è che i livelli della proteina alfa-tubulina o i livelli di TP potrebbero essere modificati dai trattamenti in assenza di variazioni parallele nel numero di cellule.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Determinazione del numero di cellule in coltura è importante nella standardizzazione delle condizioni di coltura e nello svolgimento di esperimenti di quantificazione precisa. In questo video ci dimostra come le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro.

Conteggio e determinazione della vitalità delle cellule in coltura

L'applicabilità del test clonogenica per valutare la vitalità riproduttiva è stata stabilita da oltre 50 anni. Qui mostriamo la procedura generale per l'esecuzione del test clonogenica con cellule aderenti.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

Un modificato 3-D in vitro del sistema è presentato in cui caratteristiche di crescita di diverse linee cellulari tumorali in membrana basale ricostituita in correlazione con il comportamento inattivo o proliferativa delle cellule tumorali in un sito secondario...

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Questo video descrive una tecnica basata sull'impedenza cellulare per studiare la cinetica di sopravvivenza dei virus che inducono effetti citopatici. Il metodo misura l'impedenza elettrica delle cellule aderenti infettate da virus pretrattate con soluzione fisiologica.

Saggio cinetico di sopravvivenza basato sull'impedenza cellulare per valutare la sopravvivenza del virus

Descriviamo un semplice test su cellule-base per la rilevazione, la quantificazione e il monitoraggio dell'attività dei membri della famiglia endoteliale vascolare del fattore di crescita dei leganti. Il saggio utilizza recettori chimerici espressi in una linea cellulare fattore dipendente per fornire una valutazione semiquantitativa o quantitativa di legame recettoriale e reticolazione del legante.

Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell&#39;endotelio vascolare

Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.

Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l'efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.

Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Questo protocollo presenta saggi di citotossicità comunemente usati (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red, e MTT assays) adattati per la valutazione della citotossicità in linee cellulari di embrioni di zebrafish (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti.

Saggi di citotossicità con linee cellulari di zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare la sopravvivenza post-stress in campioni di lievito. Il test utilizza due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e ioduro di propidio (PI), per quantificare l'integrità della membrana plasmatica. Utilizza la citometria a flusso per fornire stime quantitative e riproducibili delle frazioni cellulari vive, morte e danneggiate per campioni di stress post-ossidativo.

Un test LIVE/DEAD ottimizzato abbinato alla citometria a flusso per quantificare la sopravvivenza post-stress nelle cellule di lievito

Impara saggi di vitalità cellulare per biologia cellulare usando ATP, immunomarcatura e imaging infrarosso. Questo metodo combina analisi funzionali e strutturali per valutare la salute cellulare in modo oggettivo.

I saggi di redditività per le cellule in coltura

Esplora altri video