Un metodo per la coltura embrionale C. elegans Celle

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dissociare e coltivare in vitro cellule embrionali ed eleganti come quelle marine. Ciò si ottiene coltivando prima grandi quantità di animali da tomba. Successivamente, le uova vengono isolate dagli adulti.

Quindi le uova vengono trattate con chitinasi per sciogliere il guscio d'uovo. Infine, le cellule vengono dissociate manualmente e piastrate per la coltura. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'espressione di marcatori specifici cellulari attraverso l'immunofluorescenza, la microscopia, l'elettrofisiologia e le tecniche di imaging del calcio.

A dimostrare la procedura sarà rel ti, un laboratorio post-dottorato. Dopo aver coltivato almeno quattro piatti di eleganza marina allo stadio GR adulto e aver preparato terreni e soluzioni secondo il protocollo del testo. Iniziare l'isolamento delle uova facendo prima scorrere un tubo di soluzione madre di lectina di arachidi precedentemente preparata.

Posizionare i vetrini coprioggetti per autoclave nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 200 microlitri di lectina di arachidi a ciascun vetrino coprioggetti, incubare per almeno un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aspirare la soluzione e utilizzare acqua sterile per lavare i pozzetti. Una volta rimosse tutte le tracce di lectina di arachidi per prevenire l'aggregazione cellulare.

Quindi, utilizzando acqua sterile per autoclave, lavare gli adulti GR dalle piastre di agar e raccogliere la sospensione in due provette coniche sterili da 50 millilitri. Posizionare le provette sul ghiaccio per un massimo di cinque minuti per consentire ai vermi di depositarsi sul fondo Con una pipetta di trasferimento, rimuovere l'acqua e sostituirla con una centrifuga d'acqua autoclave fresca e sterile. I vermi a 200 g per 10 minuti.

Dopo il lavaggio finale, risus, sospendere i vermi in acqua fresca sterile e trasferirli in un tubo conico sterile da 15 millilitri prima di centrifugare nuovamente a 200 g per 10 minuti. Se i vermi non sono completamente pellettati, posizionare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti. Una volta che i vermi si sono completamente depositati, rimuovere l'acqua e aggiungere da cinque a sei millilitri di soluzione di lisi.

Quindi agitare delicatamente la sospensione per cinque-10 minuti e ogni due o tre minuti, posizionare una goccia di sospensione su un vetrino coprioggetti e controllare la lisi con uno stereomicroscopio. Quando il 72-80% dei vermi viene lisato, fermare la reazione di lisi aggiungendo nove millilitri di tampone d'uovo prima di girare da questo punto in poi, accendere un bruciatore bunsen e tenerlo acceso per evitare la ricontaminazione delle uova, rimuovere con cura il surnatante e utilizzare il tampone d'uovo per lavare accuratamente il pellet tre o quattro volte fino a quando la soluzione non è limpida. Successivamente, dopo aver rimosso il surnatante finale per separare le uova dalle carcasse animali, sospendere il pellet in due millilitri di tampone sterile per uova e aggiungere due millilitri di saccarosio al 60% in tampone per uova.

Mescolare bene le uova in soluzione prima di centrifugare per 20 minuti. A 200 g, rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga. Le uova galleggeranno nella parte superiore della soluzione.

Pertanto, utilizzare un pipettatore e punte sterili da un millilitro per trasferire le uova in una provetta conica fresca sterile da 15 millilitri. Utilizzare un tampone sterile per lavare le uova tre volte mentre si lavora sotto una cappa a flusso laminare. Per evitare l'introduzione di contaminazioni batteriche, sospendete le uova pellettate in un millilitro di due milligrammi per millilitro chinasi e trasferitele in una provetta conica fresca da 15 millilitri.

Far oscillare il tubo per 10-30 minuti a temperatura ambiente, a seconda della freschezza dell'enzima, quando circa l'80% dei gusci d'uovo viene digerito. Centrifugare le uova a 900 g per tre minuti. Dopo aver rimosso con cura il surnatante, aggiungere tre millilitri di terreno L 15, trasferire gli ovuli in una piastra di sei centimetri di diametro e iniziare la dissociazione manuale utilizzando una siringa sterile da 10 millilitri con ago calibro 18.

Per monitorare il grado di dissociazione, mettere una goccia di sospensione in una capsula di Petri fresca e osservare al microscopio. Continuare fino a quando circa l'80% delle cellule non si è dissociato. Per rimuovere i grumi cellulari, le uova non digerite e le larve schiuse, filtrare delicatamente la sospensione attraverso un filtro da cinque micron e far passare altri quattro o cinque millilitri di terreno L 15 attraverso il filtro per recuperare le cellule per coltivare le cellule.

Dopo aver centrifugato il filtrato a 900 G per tre minuti, sospendere nuovamente le cellule in un mezzo completo di L 15 lavorato a un millilitro per pozzetto e conservare le piastre in una camera umida sigillata a 20 gradi Celsius in aria ambiente. Per differenziare, le cellule embrionali isolate di elegan devono aderire a un substrato. Il processo di differenziazione inizia circa due o tre ore dopo la placcatura e continua per circa 24 ore.

Le caratteristiche morfologiche in vitro sono notevolmente simili a quelle in vivo. Ad esempio, come mostrato qui, un LM e un PLM touch neuron sviluppano solo due processi neuronali, uno più lungo dell'altro come fanno in vivo. Ciò suggerisce che almeno alcuni dei meccanismi molecolari che guidano la differenziazione nelle cellule elegan sono autonomi e quindi possono essere ricapitolati.

In vitro si possono osservare anche marcatori proteici in vitro e modificazioni post-traduzionali specifiche per le cellule. Ad esempio, l'alfa tubulina è un sazio solo nei neuroni tattili nell'elgan marino, come mostrato qui nei processi in vitro dei neuroni tattili che si colorano con un anticorpo sollevato contro un'alfa tubulina saziata. Inoltre, come si vede in questo pannello, i neuroni tattili in coltura esprimono il canale mutante tossico MEC four D, che causa la morte dei neuroni tattili in vivo.

I neuroni che esprimono GFP preparati da un ceppo MEC quattro DPE 4G FP sono inizialmente presenti in coltura, ma poi degenerano. Tuttavia, proprio come in vivo, le cellule possono essere salvate dalla morte mediante trattamento con un IDE e dantrolene, come mostrato qui. Le tecniche di patch clamp sono utilizzate per studiare i canali onici, onici, non selettivi e dipendenti dal trasportatore della dopamina del potassio in cellule coltivate di alghe marine.

A causa delle piccole dimensioni della cella, le pipette di vetro devono avere una punta piccola e quindi un cono largo per compensare l'aumento della resistenza di ingresso. Inoltre, un maggiore successo si ottiene applicando un impulso ad alta tensione al pezzo di membrana sotto la punta della pipetta rispetto all'accesso all'intera cellula tramite aspirazione che può danneggiare la cellula. In questa figura per studiare il ruolo dei canali del calcio voltaggio-dipendenti, ION 4 viene utilizzato per permeare la membrana e per calibrare i neuroni tattili che esprimono il camaleonte YC due punti 12 per l'imaging del calcio in assenza o presenza di calcio.

Inoltre, è stato determinato che la concentrazione media di calcio libero nei neuroni tattili è di 200 molari nanomolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e coltivare la vitro. Vedi eleganza, cellule embrionali.