Un Decellularization Metodologia per la produzione di un naturale acellulare intestinale Matrix
7 ottobre 2013
L'articolo descrive un metodo per la produzione di una matrice acellulare di ratto intestino. La derivazione di ponteggi intestinale è importante per le future applicazioni in ingegneria dei tessuti, biologia delle cellule staminali e test anti-droga.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un'impalcatura acellulare naturale per l'ingegneria dei tessuti intestinali. Ciò si ottiene incannulando prima un'arteria mesenterica superiore di ratto o SMA e prelevando l'intestino tenue insieme all'accesso vascolare. Nella seconda fase, i detriti intraluminali vengono lavati via e le cannule intraluminali e vascolari vengono collegate a una pompa peristaltica.
Successivamente, l'intestino tenue viene perfuso con acqua deionizzata per 24 ore a quattro gradi Celsius. Nella fase finale, l'intestino tenue viene perfuso con sodio desossi, coate e DNA a temperatura ambiente. In definitiva, la completa decellularizzazione dell'intestino tenue, così come la sua architettura e i suoi componenti, possono essere visualizzati rispettivamente mediante istologia e microscopia elettronica.
Attualmente ci troviamo di fronte al problema clinico dell'insufficienza intestinale, condizione devastante che colpisce sia i bambini che gli adulti. La nutrizione parentale e il trapianto convenzionale non forniscono una cura completa. La produzione di scaffold intestinali vascolarizzati tridimensionali, come dimostrato nel video seguente, si estende verso la terapia dell'insufficienza intestinale.
Ciò che è notevole di questa tecnica è che l'uso di delicati prodotti chimici di digitalizzazione preserva la microarchitettura intestinale, come evidente dai risultati del microscopio elettronico. Inoltre, il mantenimento della rete vascolare gerarchica che segue la civiltà consente la semina di una struttura che può essere ricollegata all'ospite. Afflusso di sangue Iniziare inserendo una pompa peristaltica con due tubi, quindi far scorrere l'etanolo al 70% attraverso i tubi della pompa peristaltica per 15 minuti alla massima velocità, seguito da PBS AA appena preparato per altri 15 minuti.
Dopo aver sciacquato la pompa, spruzzare e pulire l'addome di un ratto spra dolly da 250 a 350 grammi eutanasia con etanolo al 70%. Quindi, utilizzando strumenti chirurgici sterilizzati in autoclave, eseguire un'incisione laparotomica pubica XO sull'addome per garantire un campo chirurgico chiaro, eviscerare l'intestino tenue sul lato destro dell'animale su un tovagliolo di carta spruzzato con etanolo al 70%. Fare attenzione a bagnare continuamente l'intestino con P-B-S-A-A per evitare la disidratazione del tessuto e la denaturazione della matrice extracellulare.
Quindi, individua la SMA, che nasce con un angolo di 90 gradi dall'aorta verso l'intestino. Posizionare una sutura attorno alla SMA e preparare un nodo. Utilizzare una cannula calibro 27 per entrare nella SMA dall'aorta, quindi ritirare rapidamente l'ago per evitare di strappare la parete del vaso.
Ora fai avanzare il tubo di plastica della cannula nella SMA, fissando il tubo con le suture Vicryl five oh, quindi inietta 10 millilitri di P-B-S-A-A per confermare l'incannulamento. Quindi, utilizzare le forbici per incidere l'aorta prossimale e distale rispetto alla SMA per rilasciare la cannula per evitare la fuoriuscita di feci durante la dissezione dell'intestino crasso, posizionare un nodo di sutura di seta cinque oh sull'estremità prossimale della giunzione ileocecale e uno all'estremità distale del colon sigmoideo. Tagliate quindi l'ileo terminale e il colon tra i due nodi e rimuovete l'intestino crasso.
Ora taglia l'intestino tenue alla giunzione duodenale di Giunone e libera l'intestino da qualsiasi connessione del tessuto connettivo che potrebbe avere con l'addome. Trasferire l'intestino tenue in una capsula di Petri contenente PBS aa. Quindi utilizzare una pipetta posteriore di plastica per incannulare la sezione prossimale dell'intestino, fissandola in posizione con punti di sutura.
Infine, tagliare la pipetta in modo che si adatti al blocco dell'esca di una siringa da 60 millilitri, quindi lavare il lume intestinale con due lavaggi da 60 millilitri di P-B-S-A-A per rimuovere eventuali feci e detriti Prima di iniziare il processo di decellularizzazione, assicurarsi che non siano presenti bolle all'interno del lume intestinale e delle cannule vascolari. Collegare quindi un rubinetto di arresto a tre vie alla cannula vascolare e posizionare la capsula di Petri in un contenitore per raccogliere l'eventuale soluzione traboccante. Quindi, inizia a far scorrere l'acqua deionizzata attraverso la pompa a rulli a velocità variabile master flex LS a 0,6 millilitri all'ora.
Maneggiare il tessuto con cura per assicurarsi che le bolle escano dall'estremità distale. Una volta rimosse tutte le bolle dalle cannule, trasferire l'apparecchio nella cella frigorifera. Quindi iniziare il processo di decellularizzazione perfondendo sia il lume intestinale che l'albero vascolare con acqua deionizzata corrente per 24 ore a 0,6 millilitri all'ora durante la prima ora.
Controllare regolarmente l'apparecchio per assicurarsi che tutti i collegamenti siano sicuri. La perdita è minima e non sono presenti bolle all'interno dell'intestino. Dopo 24 ore, riportare l'apparecchio di decellularizzazione a temperatura ambiente.
Il colore dell'intestino dovrebbe essere cambiato in un rosa chiaro sotto una cappa di aspirazione. Pesare una quantità sufficiente di sodio deossicoto per ottenere una soluzione al 4% in 300 millilitri di acqua deionizzata. Usa un vortice per mescolare la soluzione fino a quando non è limpida.
Ora, sostituisci la soluzione deionizzata con il deossi collato di sodio. Controllare i collegamenti. Eliminate eventuali bolle e perfondete l'intestino tenue a 0,6 millilitri all'ora per quattro ore.
Dopo la fase di deossicollazione del sodio, il tessuto diventa trasparente. Il mantenimento della rete vascolare diventa evidente anche dopo l'aggiunta di PBS AA alla pompa. Lavare l'intestino con PBS AA per 30 per evitare qualsiasi interazione tra il sodio desossi, il coto e il DNA.
Quindi perfondere il tessuto con DNA appena preparato, uno a temperatura ambiente a una velocità di 0,6 millilitri all'ora. Dopo tre ore, trasferire l'impalcatura in una cappa di coltura tissutale e, utilizzando una tecnica settica, cambiare la piastra. Risterilizzare il tubo della pompa peristaltica facendo scorrere l'etanolo.
Lavare l'intestino un'ultima volta con P-B-S-A-A per 30 minuti per assicurarsi che tutti i resti delle soluzioni di decellularizzazione vengano rimossi. Infine, trasferire lo scaffold su un reticolante UV ed eseguire due cicli di sterilizzazione. Quindi riporre l'impalcatura in P-B-S-A-A.
Cambio della soluzione ogni tre giorni. Una volta completata la decellularizzazione, lo scaffold dovrebbe avere un aspetto macroscopico simile a quello dell'intestino nativo, ma con pareti traslucide. La conservazione della macro architettura dovrebbe essere evidente anche dalla pervietà dell'albero vascolare.
Quando il colorante viene iniettato attraverso la cannula SMA, dovrebbe distribuirsi uniformemente in tutta l'impalcatura e raggiungere l'albero capillare. L'impalcatura dovrebbe essere priva di materiale nucleare e citoplasmatico, qualcosa che può essere valutato. Utilizzando un kit di quantificazione del DNA e una semplice analisi istologica, la colorazione con ematina ed eoina dovrebbe dimostrare l'assenza di materiale nucleare e citoplasmatico preservando gli strati intestinali tenui, come dimostrato in questa immagine.
In particolare, il mantenimento dei villi e dei crips sul lato luminale dovrebbe essere evidente dopo la microscopia elettronica a scansione. Ci si dovrebbe aspettare anche un'ulteriore conservazione dei componenti della matrice extracellulare come il collagene, l'elastina e i glicani glicoamminici, come mostrato qui. Ad esempio, la colorazione Massen Tri CHRO consente la dimostrazione del tessuto connettivo intatto nell'impalcatura.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare l'impalcatura intestinale cellulare naturale.
Panoramica
Questo articolo presenta una metodologia per la creazione di una matrice acellulare a partire dall'intestino di ratto, fondamentale per applicazioni nell'ingegneria tissutale e nei test farmacologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Biologia delle cellule staminali
- Test farmacologici
Sfondo
- La insufficienza intestinale è una condizione critica che colpisce sia bambini che adulti.
- I trattamenti convenzionali come la nutrizione parenterale e il trapianto spesso risultano insufficienti.
- Lo sviluppo di un impalcatura intestinale tridimensionale vascolarizzata potrebbe offrire nuove opzioni terapeutiche.
- La preservazione della microarchitettura intestinale è fondamentale per la funzionalità dell'impalcatura.
Scopo dello studio
- Sviluppare una matrice acellulare naturale per l'ingegneria tissutale intestinale.
- Visualizzare il processo di decellularizzazione e l'architettura della matrice.
- Affrontare il problema clinico dell'insufficienza intestinale.
Metodi Utilizzati
- Canulazione dell'arteria mesenterica superiore del ratto per il prelievo dell'intestino tenue.
- Perfusione dell'intestino con acqua deionizzata e deossicolato di sodio.
- Analisi istologica e al microscopio elettronico per valutare la descellularizzazione.
- Mantenimento della rete vascolare durante il processo di descellularizzazione.
Risultati principali
- Il processo di descellularizzazione ha conservato con successo l'architettura intestinale.
- La rete vascolare è rimasta intatta, consentendo una potenziale rivascolarizzazione.
- L'analisi istologica ha confermato la rimozione completa dei componenti cellulari.
- Il scaffold ha mostrato un aspetto macroscopico simile a quello dell'intestino nativo.
Conclusioni
- La metodologia sviluppata offre un approccio promettente per la creazione di impalcature intestinali.
- Questa tecnica potrebbe migliorare le future terapie per l'insufficienza intestinale.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare l'integrazione funzionale di queste impalcature in vivo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per gli Esperti
La creazione di uno scaffold intestinale acellulare vascolarizzato affronta una lacuna fondamentale nella modellizzazione dell'insufficienza intestinale e nella valutazione di terapie rigenerative. Questo metodo di descellularizzazione preserva l'asse villosità-cripta e l'architettura della matrice extracellulare, consentendo valutazioni precliniche più predittive dell'integrazione e della funzionalità dello scaffold. Mantenendo una rete vascolare pervia, l'approccio supporta potenziali strategie di rivascolarizzazione, riducendo l'ambiguità meccanicistica nei programmi di ingegneria tissutale intestinale nelle fasi iniziali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni tra ospite e scaffold e del segnale della matrice extracellulare in un microambiente intestinale fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Fornisce un modello di tessuto descellularizzato riproducibile per valutare la compatibilità dei biomateriali e l'infiltrazione cellulare senza variabili immunitarie interferenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Offre un impalcatura standardizzata con microarchitettura preservata per valutare l'efficienza di semina cellulare, la migrazione e la differenziazione in condizioni di perfusione controllate.
- Valore operativo: Permette la scalabilità del saggio grazie alla produzione costante di impalcature mediante cannullazione vascolare e perfusione, facilitando lo screening ad alto contenuto di candidati terapeutici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene segnali strutturali rilevanti per la malattia (asse villosità-crittogramma, collagene, elastina, glicosaminoglicani) che informano la modellizzazione predittiva del rimodellamento e dell'integrazione dello scaffold in vivo.
- Valore operativo: Consente la valutazione longitudinale della pervietà vascolare e della stabilità della matrice extracellulare, fondamentale per ridurre i rischi nelle decisioni di avanzamento nei programmi di medicina rigenerativa intestinale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un impalcatura acellulare caratterizzata che supporta la verifica di ipotesi nell'ingegneria tissutale intestinale, la prontezza per saggi nello studio del comportamento cellulare e la continuità traslazionale grazie alla conservazione dell'architettura e della rete vascolare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su percorsi dipendenti dalla matrice extracellulare e sulle risposte cellulari in un microambiente intestinale simile al nativo.
- Screening: Fornisce impalcature pronte per i saggi, con microstruttura riproducibile e capacità di perfusione vascolare, per una valutazione cellulare standardizzata.
- Analisi: Permette una valutazione quantitativa dell'efficacia della descellularizzazione mediante quantificazione del DNA, istologia e microscopia elettronica per confermare la purezza e l'integrità strutturale dell'impalcatura.
- Ricerca traslazionale: Preserva i componenti specifici della matrice extracellulare intestinale e l'architettura vascolare, supportando la validazione preclinica dell'integrazione dell'impalcatura e del rimodellamento da parte dell'ospite.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile di descellularizzazione basata sulla perfusione, applicabile a diversi tipi di tessuto, riducendo lo sforzo di ri-sviluppo nei programmi di impalcature specifiche per organo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva preservando la microarchitettura intestinale e la composizione della matrice extracellulare, riducendo i falsi negativi nelle valutazioni precliniche dell'efficacia.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso parametri standardizzati di perfusione e concentrazioni di reagenti per la decellularizzazione, minimizzando la variabilità tra diversi lotti.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo impalcature vascolarizzate che prevedono in modo più accurato l'integrazione in vivo e gli esiti funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati per la rigenerazione intestinale in base al rischio, grazie a modelli di impalcature validati che riducono l'insuccesso biologico in fasi avanzate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella cannulazione vascolare microchirurgica e nell'allestimento del sistema di perfusione per mantenere l'integrità dello scaffold durante la decellularizzazione.
- È vincolato all'accesso a pompe peristaltiche, tubi sterili e ambienti a temperatura controllata (4°C e temperatura ambiente) per le fasi sequenziali di perfusione.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione dei reagenti (ad esempio, deossicolato di sodio al 4%, DNAasi) e per il controllo qualità, al fine di garantire la completa rimozione cellulare senza danneggiare la matrice.
- Richiede l'adattamento delle pressioni e dei tempi di perfusione quando si passa a segmenti intestinali più grandi o a specie diverse, mantenendo intatta l'architettura villocriptica.
- Le limitazioni pratiche includono la necessità di rimuovere con attenzione tutte le bolle durante la perfusione per evitare danni vascolari e assicurare una decellularizzazione uniforme in tutto lo scaffold.
