Name: Antibody colorazione in C. Elegans Uso di Freeze-Cracking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Scopri la tecnica di freeze-cracking per la colorazione anticorpale in C. elegans. Questo metodo minimizza i trattamenti chimici, preservando la localizzazione proteica e migliorando la qualità dell'analisi microscopica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il finanziamento è stato fornito da NSF CCLI # 0633618 e Ohio University. Alcuni ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center. Studente laureato Reetobrata Basu appare nel video.

NOTA: Più passaggi di protocollo vengono presentati con opzioni per set-up e la preparazione a seconda delle specifiche condizioni dell&#39;esperimento. Per questi casi, passaggi alternativi vengono presentati come A, B, C, ecc Il protocollo con la procedura alternativa è illustrato in Figura 1. 1. Preparazione di diapositive Polilisina rivestite Tre diversi tipi di diapositive possono essere utilizzati a seconda del compromesso desiderato tra facilità di preparazione, relativa adesione, e il legame non specifico dell&#39;anticorpo. Dettagli di alternative preparazione dei vetrini sono riportati alla procedura 1A-1C in ordine crescente di adesione e complessità. Preparato da questi diversi metodi possono essere utilizzati insieme per un singolo esperimento. 1A. Nessuna preparazione del vetrino Disponibili in commercio polilisina rivestita diapositive forniscono bassa adesione e basso fondo. 1B. Presentazione preparation ottimale per la fissazione metanolo, acetone Adesione media e bassa priorità bassa. <ol><li> Preparare una soluzione di polilisina per immergendo i vetrini: Aggiungere 400 mg di peso molecolare molto elevato (150.000 - 300.000 D) poli-L-lisina per 200 ml di acqua distillata. Aggiungere 2 ml di 10% di sodio azide magazzino (concentrazione finale 0,1%) come conservante. ATTENZIONE: secco sodio azide è reattivo e tutte le forme sono tossici. Indossare una maschera e guanti, mentre la polvere di peso per rendere il 10% stock in acqua bidistillata. </li><li> Pulire singolo end lastre di vetro smerigliato con salviette privo di lanugine, macchie rimozione e particelle. Questo dovrebbe essere fatto anche su vetrini acquistati con la denominazione &quot;predepurata&quot;. </li><li> Collocare i vetrini back-to-back in un supporto di diapositive, vaschetta Coplin o altro contenitore di diapositive colorazione, mantenendo i bordi satinati e non del tutto perfettamente allineate (per rendere più facile la separazione in seguito). Mettere titolare fetta in coppa con il 70% di etanolo (alcool grado reagente non necessario) con 1% di HCl in diacqua calmato o compilare vaschetta di colorazione a livello di glassa. Roccia vetrini in soluzione per un minimo di 5 min. ATTENZIONE: Questa soluzione è corrosiva, indossare guanti. NOTA: Questa soluzione può essere riutilizzato più volte (fino a diversi mesi). </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 min. </li><li> Diapositive asciugare completamente in un ambiente privo di polvere o mettendo in forno a 40-60 ° C per 30-60 minuti o mantenendo notte a temperatura ambiente. </li><li> Incubare i vetrini in soluzione polilisina (che comprende parti unfrosted) il rocker per 15 min. </li><li> Ripetere l&#39;asciugatura dei vetrini. </li><li> Ripetere polilisina soluzione di incubazione e fasi di essiccazione. </li><li> Separare le diapositive utilizzando un oggetto metallico sottile come una spatola di pesatura sottile. Se sono correttamente rispettate, sono difficili da separare. Indossare appropriato equipaggiamento di sicurezza (occhiali) e lavorare su carta da banco (deve essere scartata dopo l&#39;uso), dal momento che piccoli frammenti di vetro possono volare sciolto quando le diapositive sono separati. </li><li> Conservare i vetrini in pulito(Privo di polvere), box scorrevole a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 1C. Far scorrere una preparazione ottimale per la fissazione di formaldeide Massima adesione ma di alta sfondo. <ol><li> Collocare i vetrini preparati con il metodo 1B appartamento in una pirofila-safe senza polvere (per l&#39;asciugatura in forno) o su una superficie piatta priva di polvere (per l&#39;essiccazione all&#39;aria). </li><li> Mettere una goccia 20-60 ml di soluzione di polilisina al centro di ogni diapositiva. </li><li> Diapositive asciugare completamente in forno oppure a temperatura ambiente. Il polilisina si lascerà alle spalle ovali pallidi man mano che evapora. Questi ovali sono molto adesivo. Purtroppo, anche legano agli anticorpi primari e secondari, anche dopo il blocco. </li><li> Conservare i vetrini in pulito casella di scorrimento (senza polvere) a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione del congelato Nematode Slides Preparare nematodi per la colorazione da risciacquo completamente privo di batteri utilizzando il metodo 2A (per le piastre di nematodi) o2B (per singoli nematodi). 2A. Preparazione delle diapositive da lastre di nematodi <ol><li> Posizionare un pezzo di metallo in ghiaccio secco a pre-raffreddamento. </li><li> Utilizzare acqua distillata e una pipetta di vetro (diminuisce la perdita di vermi) o micropipetta per sciacquare i vermi da piastra NGM con i batteri in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Le piastre possono essere sincronizzati o mescolati età, non utilizzare piatti con molti dauers (difficili da decifrare) o vermi affamati (aumento di autofluorescenza) a meno necessario. </li><li> Sciacquare i vermi a 3 4x con acqua distillata fino priva di batteri. (Per diminuire la perdita di vermi utilizzare la stessa pipetta di vetro.) Per far sedimentare i vermi, né lasciarli seduti in panchina per 3-5 minuti (per raccogliere lo più gli adulti sul fondo della provetta) o girare 30 secondi a ~ 1.000 giri (~ 500 g) in una centrifuga da tavolo (per raccogliere gli adulti, larva, ed embrioni). </li><li> Rimuovere la maggior parte dell&#39;acqua dal tubo di vermi, lasciando circa il doppio del volume di acqua come vermi (ma almeno 25 pl di volume totale). </li><li&gt; Etichetta lato opaco del &quot;bottom&quot; (trattato al punto 1) slides polilisina con indelebili scivoli inchiostro e posto sul bancone accanto al contenitore con ghiaccio secco, etichetta verso l&#39;alto. </li><li> Avere un numero uguale di regolari (ripulito ma non trattati polilisina) slides &quot;top&quot; disponibili. </li><li> Posto ~ 25 microlitri vermi in acqua su &quot;basso&quot; scivolo aderente e diffondere il liquido contenente i vermi sulla porzione centrale della slitta utilizzando il lato della punta della pipetta. </li><li> Lasciate che i vermi accontentarsi di 30 sec a 2 min. Se la diapositiva è opportunamente appiccicoso, le estremità dei vermi si attaccano come contattare la diapositiva. </li><li> Tenere la slitta inferiore in una mano e posizionare la slitta superiore sul vetrino fondo in modo che tutte le parti gelate ma si sovrappongono. Il liquido dovrebbe mantenere le diapositive leggermente divaricate, in modo che i vermi ancora si muovono leggermente Non lasciate che i vetrini scivolare uno sopra l&#39;altro -. Questa stravolge i vermi. </li><li> Premere delicatamente verso il basso sleggermente sulla slitta superiore, utilizzando il pollice e l&#39;indice di ciascuna mano. Con la quantità ideale di pressione, alcune delle più grandi ermafroditi sul bordo delle slitte si romperà, mentre la maggior parte degli adulti e delle larve saranno contattare ciascun vetrino ma rimarrà intatta. </li><li> Immediatamente e accuratamente (senza scivolare) mettere i vetrini sul pezzo di metallo in ghiaccio secco. I vetrini devono apparire congelato entro un minuto. Continuate a ghiaccio secco per 5 minuti fino al completo congelati. </li><li> A questo punto, i vetrini possono essere conservati in un contenitore etichettato a -80 ° C per diversi giorni. (Se sono tenuti settimane a -80 ° C, l&#39;acqua inizierà a sublimare via e vermi non macchia pure). Se i vetrini vengono conservati a -80 ° C, far loro &#39;riscaldano&#39; in ghiaccio secco per 10 minuti prima di cracking. </li><li> Passare al punto 3 (fissazione). </li></ol> 2B. Preparazione di diapositive di singoli nematodi <ol><li> Posizionare un pezzo di metallo in ghiaccio secco a preccollina. </li><li> Utilizzare un pick worm per trasferire singoli nematodi ad una goccia d&#39;acqua su una piastra NGM per liberarli dai batteri. Nematode (s) deve essere ben nutrito per diminuire autofluorescenza, se possibile. Ripetere il trasferimento di nuove macchie di acqua se necessario fino a vite senza fine (s) sono privi di batteri. </li><li> Etichettare lato opaco dei &quot;peggiori&quot; scivola polilisina con indelebili scivoli inchiostro e posto sul bancone accanto al contenitore con ghiaccio secco, etichetta verso l&#39;alto. Avere un numero uguale di meno aderente &quot;top&quot; (non trattati) slides disponibili. </li><li> Collocare un 5-10 microlitri goccia d&#39;acqua sulla regione della slitta inferiore doppio trattato con polilisina. Utilizzare il volume maggiore se il trasferimento più vermi, per evitare che l&#39;acqua evapori prima del completamento. </li><li> Trasferire il worm (s) alla goccia d&#39;acqua con il pick verme, utilizzando il microscopio a guardare come i vermi affondano a toccare la superficie del vetrino appiccicosa. Trasferimento da un minimo di un worm di ben 20 + vermi a goccia. </li><li> Tenere le s fondolide in una mano e posizionare la slitta superiore sul vetrino fondo in modo che tutte le parti gelate ma si sovrappongono. </li><li> Immediatamente e con attenzione (senza scivolare o comprimere) mettere le diapositive sul pezzo di metallo in ghiaccio secco. Tenere in ghiaccio secco per 5-30 min. (Non conservare queste diapositive a lungo termine, come le diapositive facilmente asciugare.) </li><li> Passare al punto 3 (fissazione). </li></ol> 3. Fissazione Fissativi sono necessarie per &#39;fix&#39; l&#39;antigene nel posto nella cella, da una precipitante (&quot;fissazione luce&quot;) o cross-linking (&quot;fissazione duro&quot;) l&#39;antigene. Fissazione può interrompere antigenicità; anticorpi più conosciuti funzionano meglio con una particolare condizione di fissazione. Per i nuovi anticorpi, una serie di condizioni di fissaggio deve essere testato. Per qualsiasi fissaggio, il primo passo è quello di rendere soluzione salina tamponata con fosfato. Prossime diapositive fix nematodi per gli anticorpi colorazione utilizzando il metodo A (lucefissare con metanolo e acetone) o B (fix più difficile con formaldeide o glutaraldeide). <ol><li> Preparare una sterile 10x PBS (tampone fosfato) stock soluzione aggiungendo 80 g di NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g di Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g di KH 2 PO 4, 20 ml al 10% di sodio azide magazzino. Per rendere questa soluzione, pesare sodio azide polvere per rendere soluzione al 10% in acqua bidistillata. Mescolare salina con calore dolce fino alla dissoluzione. ATTENZIONE: secco sodio azide è reattivo e tutte le forme sono tossici. Indossare una maschera e guanti quando si lavora con azide di sodio secco o soluzioni. </li><li> Sia salina fredda (Tris pH è sensibile alla temperatura), quindi il pH a 7.2 con 1-10 M NaOH. Top a 1 L con acqua bidistillata e autoclave per la sterilizzazione. Conservare a temperatura ambiente e portare a 1x, se necessario, con acqua distillata doppio sterile. ATTENZIONE: NaOH è caustico - indossare guanti durante l&#39;uso. </li></ol> 3A. Fix luce utilizzando metanolo-acetone <ol><li> Mettere metanolo 100%, 100% acetone, e 1x tampone fosfato salino (PBS) in vaschette per colorazione di pre-raffreddamento in ghiaccio per almeno 10 min. ATTENZIONE: metanolo e acetone sono tossici, indossare i guanti. </li><li> Prendete un paio di inferiore e superiore diapositive dal ghiaccio secco, rapidamente li torcere a parte, e immergere subito la diapositiva &quot;dal basso&quot; in ghiaccio metanolo freddo per 2 min. La slitta &quot;top&quot; può essere scartata. </li><li> Trasferire i vetrini da metanolo per ghiaccio acetone freddo per 4 min. Se i vetrini avevano molti vermi, la maggior parte (90%) si cadere nella correzione, anche con le diapositive meglio preparati. Se i vetrini singoli vermi sono stati adeguatamente preparati, i vermi dovrebbero rimanere aderito. </li><li> Posizionare o immergere i vetrini nel vaso con PBS (per risciacquare fissativo) e passare al punto 4 (colorazione). </li></ol> 3B. Fix duro con formaldeide o glutaraldeide <ol><li> Diluire grado di formaldeide reagente o soluzione di glutaraldeide in PBS 1x a concentrazione finale 0,5-4%. Aliquote (1,5 ml) may essere conservato ben chiuso a -20 a -30 ° C; scongelare aliquote su ghiaccio poco prima dell&#39;uso. NOTA: Le soluzioni di formaldeide degradano nel tempo e con l&#39;esposizione all&#39;aria. ATTENZIONE: formaldeide e glutaraldeide sono tossici, indossare guanti e lavorare nel cappuccio. </li><li> Prendete un paio di inferiore e superiore diapositive dal ghiaccio secco, rapidamente li torcere a parte, e collocare immediatamente l&#39;slide &quot;basso&quot; con i vermi nel piatto piatto con coperchio. (La slitta superiore può essere scartato). </li><li> Pipettare immediatamente 200 microlitri fissativo tossico sul centro della superficie del vetrino con vermi. Il fissativo sarà parzialmente congelare sul posto, poi sciogliere per coprire una regione più ampia della diapositiva. </li><li> Se i vermi non sono totalmente coperti con fissativo, immediatamente e accuratamente aggiungere più fissativo utilizzando una micropipetta. Non permettere fissativo di scendere oltre il bordo della diapositiva. </li><li> Coprire il piatto con un coperchio e lasciar riposare per 10 minuti durante la notte a temperatura ambiente. Assicurarsi che il piatto viene umidificata se incubazione più lunghi are usata - questo può essere fatto con l&#39;aggiunta di salviette filacciosi bagnato piegati al piatto. Non lasciate che le salviettine toccare le diapositive. </li><li> Dopo la fissazione è completa, pipetta accuratamente il fissativo con i vermi sciolti in una provetta da 1,5 ml e immergerlo in una vaschetta di colorazione con PBS. </li><li> Gira il tubo con i vermi che venivano sciolti ad alta velocità per 30 secondi a pellet. Risciacquare i vermi due volte con PBS, poi elaborare in parallelo con i vermi sui vetrini (facendo passi in provette per microcentrifuga, piuttosto che sui vetrini). </li><li> Passare al punto 4 (colorazione). </li></ol> 4. Anticorpo colorazione Il protocollo di colorazione anticorpale è simile ai protocolli standard per qualsiasi tessuto su vetrini. Questo protocollo è uguale per tutte le diapositive indipendentemente dalla preparazione nei passaggi 1-3. <ol><li> Preparare Antibody Buffer miscelando 700 ml di acqua bidistillata, 100 ml 10x PBS, 5 ml di Triton X-100 (0,5% finale), 2 ml di 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM finale), 1 g BSA (0,1% finale), 5 ml 10% az sodiosoluzione ide (0,05% finale). pH a 7.2 con HCl, quindi aggiungere acqua bidistillata a 1 L; conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare Block ricostituendo siero asino con acqua bidistillata, quindi aggiungendo siero 5 ml a 45 ml di tampone di anticorpo (siero finale 10%). </li><li> Preparare primarie e secondarie soluzioni di anticorpi diluendo nel tampone dell&#39;anticorpo più 1% BSA. Diluizioni consigliate sono 1:50-1:2,000 per gli anticorpi primari e 1:1,000-1:5,000 per anticorpi secondari (Cy3or OG488 anticorpi asino coniugati contro le specie utilizzate per sollevare anticorpo primario). </li><li> Preparare DAPI magazzino mescolando 2,5 mg / ml in acqua bidistillata; negozio in 8 microlitri aliquote congelate a -30 ° C. ATTENZIONE: DAPI è un colorante legame al DNA tossici, indossare i guanti durante la pesatura e dosaggio in aliquote. </li><li> Preparare 10 ml Piano di montaggio, mescolando 200 mg n-propile gallato, 0.3 ml di 1 M Tris pH 9, 2.7 ml di acqua distillata in una provetta da 15 ml. Riscaldare a 65 ° C per circa 10 minuti fino a completa dissoluzione.Aggiungere 7 ml di glicerolo e un&#39;aliquota 8 ml di DAPI e vortex bene. Medio Aliquota in provette da 1,5 ml, avvolgere in un foglio, e conservare al buio a 4 ° C (sia aria e luce degradano il medium - se diventa più giallo, scartare nei rifiuti Biohazard). ATTENZIONE: n-propil gallato è un reattivo anti-ossidante, indossare guanti durante la pesatura. </li><li> Trasferire i vetrini in una vaschetta di colorazione con il blocco per 1 ora a temperatura ambiente o una notte a 4 ° C (durante la notte preferibile per il disco fisso). Evitare di agitazione per evitare di perdere i vermi. </li><li> Trasferire i vetrini per la colorazione vaso con anticorpo primario o mettere i vetrini appartamento in un piatto umidificata e top ciascuno con 100-500 anticorpo primario microlitri. Incubare i vetrini una notte a 4 ° C senza agitazione. </li><li> Dopo l&#39;anticorpo primario incubazione, trasferimento scivola alle macchie barattolo di PBS. </li><li> Filtro di blocco tramite imbuto foderato con carta da filtro e conservare a 4 ° C; se sterili filtrati ogni 1-2 settimane, Block può essere riutilizzato per uno o più mesi. Allo stesso modo, filtrare e salvareanticorpo primario a 4 ° C per il riutilizzo (fino a 10 o più giri di colorazione). </li><li> Sciacquare i vetrini tre volte (~ 20 min ciascuna) in tampone dell&#39;anticorpo. </li><li> Porre i vetrini in anticorpo secondario in un contenitore a tenuta di luce di colorazione e incubare 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Trasferire i vetrini per la colorazione barattolo di PBS. Filtro e salvare anticorpo secondario a 4 ° C per il riutilizzo (fino a 10 o più giri di colorazione). </li><li> Sciacquare i vetrini tre volte (~ 20 min ciascuna) in tampone dell&#39;anticorpo. </li><li> Trasferire i vetrini di PBS e lasciate in PBS (minuti per una notte a 4 ° C) fino al momento di montare. </li><li> Lavorare rapidamente sulle singole diapositive, in modo che i vermi sulla parte anteriore del vetrino rimanere bagnato. Rimuovere un vetrino dal PBS, asciugare retro del vetrino con un libero di lanugine pulire, e posto su un tovagliolo di carta. </li><li> Luogo ~ 20 ml di mezzo di montaggio sopra i vermi in modo che non vi siano parti approssimativamente uguali medie e PBS sulla trasparenza e l&#39;inclinazione scorrevole delicatamente per miscelare le due soluzioni. CAUTION: Montaggio medio è tossico. </li><li> Tilt diapositiva bordo in modo smerigliato è più basso e la soluzione raccoglie nei pressi di glassa, poi mettere un bordo di 24 x 60 mm coprioggetto sulla soluzione. </li><li> Abbassare delicatamente il vetrino per ridurre al minimo le bolle d&#39;aria (che aumentano il candeggio e interrompono la visione). Se si formano bolle, sollevare il bordo del vetrino lentamente, poi relower senza scivolare il vetrino di tutti i vermi. </li><li> Asciugare con cura il bordo della diapositiva senza spostare il vetrino, comprimendo i bordi con un libero di lanugine pulire. Il bordo relativamente secco del vetrino deve essere visibile in tutto il bordo del vetrino </li><li> Sigillare il vetrino con 2-3 strati di smalto. I vetrini possono essere collocati in un portavetrini piatto durante la preparazione e la conservazione al riparo dalla luce. Una diapositiva è ben sigillato e asciutto, pulire il vetrino e posteriore della diapositiva. </li><li> Vetrini ben sigillati possono essere conservati al buio per giorni a settimane, 4 ° C oa -20 ° C. Più di periodi più lunghi, DAPI staining del DNA e la maggior parte dei coloranti verdi (ad esempio 488 nm di eccitazione) dissolvenza. Richiudere il vetrino con più smalto, se necessario, ad esempio, dopo l&#39;utilizzo di qualsiasi obiettivo immersione in olio. </li></ol>

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

L&#39;autore dichiara che lei non ha interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo di congelamento di cracking è uno dei diversi metodi per la colorazione degli anticorpi in C. elegans. Esso fornisce un modo relativamente semplice per colorare i vermi, ma richiede reagenti specifici e pratica per ottenere risultati ottimali. Passaggi critici (descritti nella Figura 1) includono: 1) preparazione del vetrino (vedi punti 1 e 2) la compressione manuale dei nematodi (vedere i passi 2 e 3) di fissaggio rapido (vedi punto 3). In primo luogo, per massimizzare l&#39;ades...

Per determinare la localizzazione cellulare e subcellulare di proteine, gli scienziati hanno tradizionalmente etichettati tessuti con anticorpi selezionati per riconoscere specificamente particolari proteine ​​1. In alcuni organismi modello come C. elegans, colorazione anticorpale è stato spesso sostituito da tecniche genetiche molecolari, che danno risultati più rapidamente. Questi includono organismi trasformante con costrutti costituiti da fusioni geniche tra il promotore e regioni codificanti del gene di interesse e proteina fluorescente verde. Tuttavia, le tecniche molecolari sono soggette a una serie di manufatti, compresi i problemi connessi conoscere il vero promotore e cambiamenti nell&#39;espressione di costrutti ad alto numero di copie (le usuali tecniche di C. elegans) 2,3. Pertanto, la colorazione con anticorpi rimane un obiettivo per molti scienziati che studiano la funzione delle proteine ​​in vivo. Colorazione tessuti con anticorpi può essere difficile, in quanto untibodies possono riconoscere solo la loro antigene in una particolare conformazione 1. Ad esempio, gli anticorpi possono riconoscere solo antigene denaturato o intatta fissato in modo particolare e non possono riconoscere l&#39;antigene in situ. Il problema di colorazione anticorpale nei nematodi è aggravata dal fatto che la cuticola del nematode forma una barriera relativamente impermeabile, bloccando l&#39;accesso di anticorpi ai tessuti. Ci sono diversi metodi utilizzati per la colorazione degli anticorpi in C. elegans (recensito nel nostro precedente lavoro 4). Per macchiare intatti &#39;vermi, «metodi sono stati sviluppati per congelare e scongelare in un fissativo relativamente dura (formaldeide o glutaraldeide), i cicli di gelo-disgelo contribuiscono a rompere la cuticola per consentire una rapida penetrazione del fissativo 5. Dopo la fissazione, la cuticola stata permeabilizzate per consentire la penetrazione dell&#39;anticorpo; metodi inclusi il trattamento con agenti riducenti, collagenasi, o entrambi 5-7. Queste treatments conservati morfologia, ma spesso ridotti o distrutti riconoscimento anticorpale. Metodi alternativi includono dissezione 8 per consentire la penetrazione anticorpo. &quot;Freeze-cracking&quot; è un modo per ottenere l&#39;accesso all&#39;interno del verme semi-intatte per consentire colorazione anticorpale 9-10. Freeze-fessurazione può essere eseguita con una varietà di condizioni di fissaggio evitando trattamenti collagenasi e di riduzione. I nematodi sono posti tra due adesivi diapositive, congelati e quindi i vetrini sono separati, lasciando la maggior parte del nematode sul vetrino fondo e gran parte della cuticola sulla slitta superiore. La slitta inferiore può essere posizionato in fissativo e l&#39;intera diapositiva da nematodi aderito viene trasferita attraverso la procedura di colorazione anticorpale. Il metodo non presentano due grandi difficoltà. In primo luogo, è difficile applicare la giusta quantità di pressione necessaria per dividere i nematodi senza deformarli seriamente. In secondo luogo, molti dei vermi non sarà stick a uno scivolo, e sarà perso nel fissativo o risciacqui. Tuttavia, con le diapositive e prassi corrette, il metodo rapidamente produrre nematodi con ragionevole morfologia che può essere utilizzato con una vasta gamma di fissativi e anticorpi. Il metodo può essere leggermente variato, a seconda della porta dello sperimentatore. Se si desidera una colorazione di singoli nematodi (ad esempio per determinare se un singolo trasformante ha modificato colorazione anticorpale), poi scivola con adesione massima (ma superiore colorazione di fondo) può essere utilizzato, ad esempio diapositive-laboratorio preparati con polilisina supplementare (vedi sotto). Per formaldeide o fissazione glutaraldeide, diapositive di adesione superiori (slides polilisina-laboratorio preparati) devono essere utilizzati, dal momento che i nematodi aderiscono più male di polilisina dopo queste fissazioni. Se wild-type nematodi sono stati fissati con metanolo e / o acetone, poi scivola con l&#39;adesione sempre più in basso la colorazione di fondo deve essere utilizzato (commerciale oppure lvetrini aboratory preparati). Se una varietà di anticorpi e fissativi sono utilizzati nel laboratorio, una selezione di diapositive può essere preparato in anticipo e conservato fino al momento dell&#39;uso. Dopo l&#39;accesso al tessuto nematode è stata acquisita, le procedure di anticorpi colorazione seguono metodi standard (con incubazione più caratteristici dei tessuti, piuttosto che le cellule 1,11).

<table><tbody><tr><td>vetrino in poli-L-lisina (marca ESCO)</td> <td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>vetrini di marca Sigma adatti anche</td></tr> in <tr><td>poli-L-lisina bromidrato</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td><forte>IMPORTANTE: </forte> Marca e alto peso molecolare dei</td></tr><tr><td>vetrini con bordo smerigliato singolo</td> critico in polilisina <td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr><tr><td>azoturo di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOSSICO, indossare guanti e maschera mentre si pesa la polvere per fare il 10% di scorta. Indossare i guanti durante il pipettaggio della soluzione madre</td></tr><tr><td>vaso di colorazione coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr><tr><td>Mailer a 5 vetrini</td><td>Microscopia elettronica Scienza</td><td>71549-01</td><td>Una delle tante marche diverse di piccoli portavetrini, adatto per la colorazione</td></tr> di <tr><td>Paraformaldeide</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><forte>IMPORTANTE:</forte> Le normali soluzioni di formalina (37% di formaldeide) NON sono adatte. 1) Sciogliere la paraformaldeide crisatlalina in tampone fosfato e conservarla in piccole aliquote congelate. O 2) acquistare paraformaldeide di grado microscopico elettronico in aliquote. TOSSICO - indossare guanti; Smaltire il lavello in eccesso con acqua.</td></tr><tr><td>Soluzione di glutaraldeide, 25% in acqua</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td>IMPORTANTE: acquistare glutaraldeide di grado per microscopia elettronica in fiale; TOSSICO - indossare guanti; Smaltire il lavello in eccesso con acqua.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina Fisher</td><td></td><td>ICN820451</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr><tr><td>Siero d'asino, liofilizzato</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Questa azienda è consigliata per anticorpi multi-label di alta qualità (con affinità depleta). Selezionare il colorante e l'antigene appropriati (animale utilizzato per allevare l'anticorpo primario). </td></tr><tr><td>n-propil gallato</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr><tr><td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOSSICO. Indossare i guanti ed erogare in piccole aliquote e tassare per ridurre al minimo l'esposizione</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filtri da 15 cm di diametro</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti #1 1/2 rettangolo 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 lo spessore è otticamente migliore</td></tr><tr><td>Cartella per vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>Altre marche sono adatte</td></tr></tbody></table>

antibody colorazione in<em&gt; c. elegans</em&gt; uso di &quot;freeze-cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Per macchiare C. elegans con anticorpi, la cuticola relativamente impermeabile devono essere aggirati con metodi chimici o meccanici. &quot;Freeze-cracking&quot; è un metodo utilizzato per estrarre fisicamente la cuticola da nematodi comprimendo nematodi tra due diapositive aderenti, il congelamento, e tirando le diapositive a parte. Freeze-fessurazione fornisce un modo semplice e rapido per ottenere l&#39;accesso ai tessuti senza trattamenti chimici e può essere utilizzato con una varietà di fissativi. Tuttavia, porta alla perdita di molti dei campioni e la compressione richiesta distorce meccanicamente il campione. La pratica è necessaria per massimizzare il recupero di campioni con buona morfologia. Freeze-fessurazione può essere ottimizzato per le condizioni specifiche di fissazione, recupero di campioni, o bassa colorazione non specifica, ma non per tutti i parametri contemporaneamente. Per gli anticorpi che richiedono condizioni di fissazione molto duri e tollerano i trattamenti chimici necessari per permeabilize chimicamente la cuticola, treatment di nematodi intatte in soluzione può essere preferito. Se l&#39;anticorpo richiede una correzione chiara o se le condizioni ottimali di fissaggio sono sconosciute, liofilizzazione di cracking fornisce un modo molto utile per saggiare rapidamente l&#39;anticorpo e può produrre specifiche informazioni di localizzazione subcellulare e cellulare per l&#39;antigene di interesse.

Quando i vermi sono adeguatamente compressi, incrinato, e leggermente fissi, praticamente l&#39;intero worm può essere accessibile a colorazione anticorpale (vedi figura 2). La posizione dei nuclei come indicato dalla colorazione DAPI indica quali parti del verme sono intatti Quando i vermi sono sottoposti ad un fissativo più duro, come la formaldeide, la morfologia della vite senza fine può essere distorta (come si vede dalla comparsa innaturale ondulata del muscoli nelle figure 3a-D)....

&quot;Freeze-cracking,&quot; un metodo per esporre i tessuti interni del nematode C. elegans di anticorpi per la localizzazione delle proteine, è dimostrata.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una colorazione con anticorpi su C. elegans. Per far ciò, i nematodi vengono risciacquati, distribuiti sui vetrini e delicatamente compressi tra due vetrini adesivi, che vengono quindi congelati sul ghiaccio secco. Successivamente, i vetrini vengono separati per rompere i nematodi e immediatamente posti nel fissativo.I nematodi vengono quindi colorati utilizzando tecniche standard di colorazione con anticorpi; l'analisi mediante microscopia fluorescente rivela una colorazione con anticorpi riuscita su nematodi semi-integri. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la fissazione di nematodi integri, è che minimizza il trattamento chimico del campione. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché la preparazione dei vetrini e dei nematodi è piuttosto delicata da eseguire.La procedura sarà eseguita da me e da RTO Basu, uno studente laureato del mio laboratorio. Per preparare le lastre di nematodi per la colorazione, iniziare posizionando un pezzo di metallo piatto sul ghiaccio secco per raffreddarlo; quindi sciacquare con acqua distillata e una pipetta di vetro. Trasferire i vermi coltivati su una piastra NGM da 60 millimetri con batteri in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. I vermi possono essere sincronizzati o di età mista, ma evitare l'uso di piastre con molti fiori, che sono difficili da rompere, o vermi in stato di fame, che aumenterebbero l'autofluorescenza, utilizzando la stessa pipetta di vetro.Lavare i vermi da tre a quattro volte con acqua distillata per liberarli dai batteri. Successivamente, per raccogliere principalmente adulti, lasciarli in posa sul banco per tre-cinque minuti. Dopo che i vermi si sono depositati sul fondo del tubo, rimuovere la maggior parte dell'acqua dal tubo, lasciando un volume di acqua pari a circa il doppio di quello dei vermi, ma comunque un volume totale di almeno 25 microlitri.Etichettare il lato opaco dei vetrini di polilisina con inchiostro indelebile e posizionare i vetrini sul banco da lavoro accanto al contenitore con ghiaccio secco, con il lato etichettato rivolto verso l'alto. Questo servirà da vetrino inferiore. Avere un numero uguale di vetrini puliti non trattati con polilisina.Disponibili vetrini superiori. Successivamente, pipettare circa 25 microlitri di vermi in acqua sul vetrino adesivo inferiore e, utilizzando il lato della punta della pipetta, distribuire i vermi al centro del vetrino. Lasciarli depositare per 30 secondi fino a due minuti.Le estremità dei vermi aderiranno quando entrano in contatto con il vetrino. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nel mantenere i vermi il meno distorti possibile durante i prossimi passaggi. Il modo migliore per farlo è essere pazienti, avere tutto pronto prima di iniziare e non bere troppa caffeina, in modo che le mani siano ben ferme.Tenendo il vetrino inferiore con una mano, posizionare il vetrino superiore sopra di esso in modo che si sovrappongano tutti i lati tranne le parti smerigliate. Il liquido deve mantenere i vetrini leggermente distanziati in modo che i vermi conservino una certa mobilità. Evitare che il vetrino scivoli sull'altro, poiché ciò potrebbe torcere i vermi.Successivamente, utilizzando i pollici e gli indici di ciascuna mano, premere con attenzione direttamente verso il basso sul vetrino superiore. Applicando la giusta quantità di pressione, alcuni dei maschi ermafroditi più grandi si romperanno sul bordo del vetrino. Mentre la maggior parte degli adulti e delle larve entrerà in contatto con i vetrini rimanendo intatti, posizionarli immediatamente e con attenzione sul pezzo di metallo posto sul ghiaccio secco, senza permettere ai vetrini di scivolare. Entro un minuto, i vetrini appariranno congelati, ma mantenerli in tale condizione per cinque minuti per assicurarsi che siano completamente congelati.I vetrini sono ora pronti per la fissazione. Se non si procede immediatamente, conservare i vetrini in una scatola etichettata a meno 80 gradi Celsius per alcuni giorni. Dovrebbero essere utilizzati entro circa una settimana dalla preparazione.Non utilizzare i vetrini dopo un immagazzinamento a lungo termine. Singoli nematodi possono anche essere preparati su vetrini con un metodo simile a quello appena mostrato in precedenza. Posizionare un pezzo piatto di metallo sul ghiaccio secco per raffreddarlo.Successivamente, utilizzare un puntale per vermi per trasferire singoli nematodi in una goccia d'acqua su una piastra NGM per liberarli dai batteri. I nematodi devono essere ben nutriti per ridurre l'autofluorescenza. Se possibile, ripetere il trasferimento in nuovi punti d'acqua secondo necessità, finché il verme non è privo di batteri.Successivamente, preparare i vetrini superiore e inferiore come in precedenza. Quindi, posizionare una goccia di acqua di cinque-dieci microlitri sull'area del vetrino inferiore trattata con polilisina, osservando al microscopio. Utilizzare un bastoncino per prelevare i vermi e trasferire fino a 20 vermi nella goccia d'acqua.I vermi dovrebbero scendere fino a toccare la superficie adesiva del vetrino. Quindi posizionare il vetrino superiore come in precedenza, senza comprimere, assicurandosi però che i vetrini non scivolino immediatamente. Posizionare i vetrini sul metallo sopra il ghiaccio secco.Mantenere su ghiaccio secco per cinque fino a 30 minuti e procedere immediatamente alla fissazione. Questi vetrini non possono essere conservati per un uso successivo. Per fissare leggermente i vermi, iniziare posizionando barattoli per colorazione contenenti soluzioni di fissaggio sul ghiaccio per raffreddarli per 10 minuti.Le soluzioni necessarie sono metanolo al 100%, acetone al 100% e soluzione salina tampone al fosfato. Prendere rapidamente una coppia di vetrini superiore e inferiore dal ghiaccio secco, separarli ruotandoli e immergere immediatamente il vetrino inferiore in metanolo ghiacciato per due minuti, quindi scartare il vetrino superiore. Successivamente, trasferire i vetrini dal metanolo all'acetone ghiacciato per quattro minuti.Se i vetrini contenevano molti vermi, la maggior parte di essi cadrà comunque nel fissativo, anche con vetrini ben preparati. Se i vetrini con singoli vermi sono stati preparati correttamente, i vermi dovrebbero rimanere aderenti. Infine, per rimuovere il fissativo, immergere i vetrini nel barattolo contenente PBS.I vetrini sono ora pronti per la colorazione e per eseguire una fissazione con formaldeide o glutaraldeide. Iniziare diluendo una soluzione di formaldeide o glutaraldeide di grado reagente in PBS fino a una concentrazione finale compresa tra lo 0,5% e il 4%. Aliquote possono essere conservate a meno 20 fino a meno 30 gradi e scongelate all'occorrenza. Ricordare che formaldeide e glutaraldeide sono molto tossiche, quindi è necessario indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante.Prendere una coppia di vetrini inferiori e superiori dal ghiaccio secco e separarli immediatamente con una rapida torsione. Posizionare il vetrino inferiore, che contiene i vermi, in una capsula piana con coperchio, scartare subito il vetrino superiore e pipettare 200 microlitri di fissativo al centro dell'area del vetrino. Il fissativo si congelerà parzialmente sul posto, poi si scioglierà coprendo una zona più ampia del vetrino.Se i vermi non sono immediatamente e accuratamente ricoperti dal fissativo, aggiungere altro fissativo utilizzando una micropipetta. Non permettere al fissativo di fuoriuscire dal bordo del vetrino. Aggiungere tamponi in tessuto non tessuto piegati e inumiditi al piatto per mantenerlo umidificato.Non permettere che le salviette tocchino i vetrini. Quindi coprire la piastra con un coperchio e lasciarla da 10 minuti a tutta la notte a temperatura ambiente dopo il completamento della fissazione; utilizzare una pipetta per trasferire con attenzione il fissativo con i vermi liberi in una provetta da 1,5 millilitri. Successivamente immergere il vetrino in un barattolo per colorazione contenente PBS.Centrifugare il tubo contenente i vermi ad alta velocità per 30 secondi per formare il pellet. Lavare i vermi due volte con PBS. Procedere quindi alla colorazione in parallelo con i vermi sul vetrino.Il protocollo di colorazione con anticorpi è simile ai protocolli standard per qualsiasi tessuto su vetrini ed è descritto in dettaglio nel documento allegato. Dopo la colorazione, trasferire i vetrini in PBS e lasciarli in questa soluzione fino a 12 ore a quattro gradi Celsius, fino al momento del montaggio. Per montare i vetrini, rimuovere un vetrino dal PBS.Utilizzare un panno senza lanugine per asciugare il lato posteriore e quindi appoggiarlo brevemente su un tovagliolo di carta in modo rapido. Applicare circa 20 microlitri di mezzo di montaggio sui vermi in modo che ci siano parti approssimativamente uguali di mezzo e PBS sul vetrino.Inclinare delicatamente il vetrino per mescolare le due soluzioni. Attenzione: il mezzo di montaggio è tossico. Tenere il bordo smerigliato.Inclinare il vetrino in modo che la soluzione si accumuli vicino al vetro smerigliato. Quindi appoggiare un bordo di un coprioggetto di 24 per 60 millimetri sulla soluzione per ridurre al minimo le bolle d'aria, che aumentano lo sbiancamento e disturbano l'osservazione. Abbassare delicatamente il coprioggetto.Se si formano bolle, sollevare lentamente il bordo del vetrino coprioggetto, quindi abbassarlo nuovamente senza farlo scivolare sui vermi. Aggiungere altro PBS se necessario per eliminare le bolle d'aria.Utilizzando un panno senza lanugine, premere delicatamente i bordi del coprioggetto e del vetrino per asciugarne i margini. Il bordo del vetrino deve essere visibile lungo tutto il perimetro del coprioggetto e non deve essere eccessivamente umido. Sigillare il coprioggetto applicando due o tre strati di smalto per unghie sul bordo.Una volta che il vetrino è ben sigillato e asciutto, pulire il coprioggetto e il retro del vetrino e posizionarlo nelle apposite alloggiamenti. I vetrini sigillati possono essere conservati per giorni a quattro gradi Celsius o per settimane a meno venti gradi Celsius per periodi più lunghi. La colorazione di DAPI del DNA e la maggior parte dei coloranti verdi tendono a sbiadire; sigillare nuovamente il coprioggetto con ulteriore smalto per unghie secondo necessità, in particolare dopo aver utilizzato un obiettivo ad immersione in olio.Le seguenti immagini rappresentative sono state ottenute utilizzando vetrini preparati durante i primi tentativi di colorazione con anticorpi effettuati da studenti universitari in un corso di laboratorio di biologia cellulare. Questa immagine mostra un esempio delle teste di due ermafroditi adulti correttamente compresse, fratturate e fissate leggermente con metanolo acetone. Sono state marcate con diversi anticorpi e coloranti.In questo caso, virtualmente l'intero verme è accessibile agli anticorpi. La colorazione, che mostra la localizzazione dei nuclei indicata dalla colorazione con DPI, indica quali parti del verme sono integre. Quando i vermi vengono sottoposti a un fissativo più aggressivo come il formaldeide, la morfologia del verme può risultare distorta.Questo può essere osservato in queste immagini come un aspetto ondulato dei muscoli mostrati in rosso. Un altro problema comune associato all'uso di fissativi più duri è la fissazione o la penetrazione irregolare di determinati tessuti. Questo può essere visto qui, dove il muscolo mostrato in rosso è colorato solo in una parte del verme.Qui, la presenza di altre colorazioni, inclusa quella del DNA, mostrata in blu, indica che almeno una parte del corpo era presente. Il modello risultante di colorazione parziale può essere facilmente identificato con la pratica, in modo da determinare l'intera distribuzione della colorazione anche quando un singolo verme presenta una colorazione irregolare. Di seguito sono illustrati i problemi comuni riscontrati durante la rottura criogenica con qualsiasi condizione di fissazione.Il problema più comune è la torsione del campione dovuta al movimento relativo tra i due vetrini. Durante la compressione, la morfologia dei tessuti colorati indica che il corpo del verme è torcito appena posteriormente alla faringe. Questa immagine mostra anche il problema della colorazione di fondo causata dall'adesione dell'anticorpo alla polilisina che ricopre il vetrino.Questo può essere evitato utilizzando il microscopio confocale. Si noti che, anche con la pratica, molti vermi singoli andranno perduti o mostreranno alcuni dei problemi illustrati qui. Una volta acquisite le competenze, la preparazione e la fissazione possono essere completate in un'ora e la colorazione può essere eseguita in un giorno.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una varietà di metodi di fissazione al fine di ottimizzare la colorazione per un determinato anticorpo e tessuto.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo un metodo per localizzare fluorescente proteine ​​marcate nel microscopio elettronico. Fluorescenza viene prima localizzato con foto-attivato microscopia localizzazione su sezioni ultrasottili. Queste immagini vengono quindi allineati al microscopio elettronico della stessa sezione.

Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

L'abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi...

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Questo video descrive il freeze-cracking, un metodo per rendere i tessuti di C. elegans accessibili per la colorazione degli anticorpi distruggendo la cuticola.

Congelamento dei nematodi: un metodo per esporre i tessuti interni dei vermi per la colorazione

Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Presentiamo un metodo di imaging basata immunofluorescenza per la localizzazione spaziale e temporale di ERK attivo nel sezionato C. elegans gonade. Il protocollo qui descritto può essere adattato per la visualizzazione di qualsiasi segnalazione o proteina strutturale in C. elegans gonadi, disponibile un opportuno anticorpo è disponibile.

Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Linea germinale

Il trasparente c. elegans intestino può servire come una"nel vivo del tessuto camera" per lo studio della biogenesi di membrana e lume di apicobasal a livello di singola cellula e subcellulare durante tubulogenesis multicellulari. Questo protocollo viene descritto come combinare etichettatura standard, perdita di funzione genetica/RNAi e approcci al microscopio dissezionare questi processi a livello molecolare.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.

Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Il seguente protocollo descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione di un flusso di lavoro ad alto rendimento per la coltivazione di vermi, l'imaging a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini per quantificare gli aggregati di poliglutammina come valutazione dei cambiamenti nella proteostasi.

Automatizzare la quantificazione aggregata in Caenorhabditis elegans

Questo è un metodo comunemente usato per la dissezione delle gonadi di C. elegans seguita da crack congelato, che produce campioni della linea germinale per l'immunofluorescenza tramite colorazione anticorpale o per la semplice colorazione DAPI per visualizzare il DNA. Questo protocollo ha avuto successo per gli studenti universitari in un laboratorio di ricerca e in un'esperienza di ricerca universitaria basata sul corso.

C. elegans Dissezione delle gonadi e crack congelati per immunofluorescenza e colorazione DAPI

La microscopia a super-risoluzione può fornire una visione dettagliata dell'organizzazione dei componenti all'interno del complesso sinaptonemale nella meiosi. Qui, dimostriamo un protocollo per risolvere le singole proteine del complesso sinaptonemale Caenorhabditis elegans .

Microscopia a super-risoluzione del complesso sinaptonemale all'interno della linea germinale di Caenorhabditis elegans

Scopri la tecnica di freeze-cracking per la colorazione anticorpale in C. elegans. Questo metodo minimizza i trattamenti chimici, preservando la localizzazione proteica e migliorando la qualità dell'analisi microscopica.

Antibody colorazione in

Esplora altri video