Antibody colorazione in C. Elegans Uso di "Freeze-Cracking"

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la colorazione degli anticorpi su C elegance. Per fare ciò, i nematodi vengono risciacquati, sparsi su vetrini e accuratamente compressi tra due vetrini adesivi, che vengono poi congelati su ghiaccio secco. Successivamente, i vetrini vengono separati per aprire i nematodi e immediatamente posti in fissativo.

I nematodi vengono quindi colorati utilizzando anticorpi standard L'analisi delle tecniche di colorazione al microscopio a fluorescenza rivela il successo della colorazione degli anticorpi dei nematodi semi intatti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la fissazione di nematodi intatti è che riduce al minimo il trattamento chimico del campione. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché preparare i vetrini e i nematodi è un po' difficile da dimostrare.

La procedura sarà io e RTO Basu, uno studente laureato del mio laboratorio Per preparare le piastre di nematodi per la colorazione, iniziare posizionando un pezzo di metallo piatto sul ghiaccio secco per raffreddarlo usando acqua distillata e una pipetta di vetro, risciacquare. Vermi cresciuti su una piastra NGM da 60 millimetri con batteri in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri. I vermi possono essere sincronizzati o di età mista, ma evita di usare piastre con molte doti difficili da rompere o vermi affamati, che aumenteranno l'autofluorescenza usando la stessa pipetta di vetro.

Sciacquare i vermi tre o quattro volte con acqua distillata per liberarli dai batteri. Quindi, per raccogliere la maggior parte degli adulti, lasciali sedere sulla panchina per tre o cinque minuti. Dopo che i vermi si sono depositati sul fondo del tubo, rimuovere la maggior parte dell'acqua dal tubo, lasciando circa il doppio del volume d'acqua dei vermi, ma almeno 25 microlitri di volume totale.

Etichettare il lato smerigliato dei vetrini in polilisina con inchiostro indelebile e posizionare i vetrini sul piano di lavoro accanto al contenitore con l'etichetta del ghiaccio secco rivolta verso l'alto. Questo servirà come scivolo inferiore. Avere un numero uguale di non polilisina pulita trattata.

Diapositive superiori disponibili. Quindi pipettare circa 25 microlitri di vermi in acqua sul vetrino di aderenza inferiore e, utilizzando il lato della punta della pipetta, distribuire i vermi al centro del vetrino. Lasciateli riposare per 30 secondi o due minuti.

Le estremità dei vermi si attaccheranno quando entreranno in contatto con il vetrino. L'aspetto più difficile di questa procedura è evitare che i vermi si distorcano troppo quando si eseguono i passaggi successivi. Il modo migliore per farlo è essere pazienti, avere tutto pronto e non bere troppa caffeina in modo che le tue mani siano belle e ferme.

Tenendo la slitta inferiore in una mano, posizionare la slitta superiore su di essa in modo che tutte le parti tranne quelle smerigliate siano sovrapposte. Il liquido dovrebbe tenere i vetrini leggermente divaricati in modo che i vermi abbiano ancora una certa mobilità. Non lasciare che lo scivolo scivoli l'uno sull'altro, il che torcerà i vermi.

Quindi, usando i pollici e gli indici di ciascuna mano, premere con cautela verso il basso sul vetrino superiore Con la giusta quantità di pressione, alcuni degli ermafroditi più grandi si romperanno sul bordo del vetrino. Mentre la maggior parte degli adulti e delle larve entreranno in contatto con ogni vetrino, ma rimarranno intatti immediatamente e con attenzione senza lasciare che i vetrini scivolino, metteteli sul pezzo di metallo su ghiaccio secco. Entro un minuto, i vetrini appariranno congelati, ma tienili lì per cinque minuti per assicurarti che siano completamente congelati.

I vetrini sono ora pronti per il fissaggio. In caso contrario, conservare immediatamente i vetrini in una scatola etichettata a meno 80 gradi Celsius per diversi giorni. Dovrebbero essere utilizzati entro una settimana circa dalla loro produzione.

Non utilizzare i vetrini dopo una conservazione a lungo termine. I singoli nematodi possono anche essere preparati su vetrini con un metodo simile a quello appena mostrato in precedenza. Metti un pezzo di metallo piatto sul ghiaccio secco per raffreddarlo.

Quindi, usa un plettro per vermi per trasferire i singoli nematodi in una goccia d'acqua su una piastra NGM per liberarli dai batteri. I nematodi devono essere ben nutriti per diminuire l'autofluorescenza. Se possibile, ripetere il trasferimento in nuovi punti d'acqua secondo necessità fino a quando il verme non è privo di batteri.

Quindi, prepara le diapositive superiore e inferiore come prima. Quindi posizionare una goccia d'acqua da cinque a 10 microlitri sull'area trattata con polilisina del vetrino inferiore durante l'osservazione con un microscopio. Usa un plettro per trasferire fino a 20 vermi nella goccia d'acqua.

I vermi dovrebbero affondare fino a toccare la superficie appiccicosa dello scivolo. Quindi posizionare la guida superiore come prima, ma non comprimere assicurandosi che le guide non scivolino immediatamente. Posizionare i vetrini sul metallo su ghiaccio secco.

Tenere su ghiaccio secco per cinque-30 minuti e procedere immediatamente al fissaggio. Questi vetrini non possono essere conservati per un uso successivo. Per fissare leggermente i vermi, inizia mettendo barattoli coloranti contenenti soluzioni di fissaggio sul ghiaccio per raffreddarli per 10 minuti.

Le soluzioni necessarie sono metanolo al 100%, acetone al 100% e soluzione salina tamponata con fosfato. Prendi un paio di vetrini inferiore e superiore dal ghiaccio secco, attorcigliali rapidamente e immergi immediatamente il vetrino inferiore in metanolo ghiacciato per due minuti, scartando il vetrino superiore. Quindi, trasferire i vetrini dal metanolo all'acetone ghiacciato per quattro minuti.

Se i vetrini avevano molti vermi, la maggior parte di essi cadrà nel fissativo anche con vetrini ben preparati. Se i vetrini a vite senza fine sono stati preparati correttamente, i vermi dovrebbero rimanere aderenti. Infine, per risciacquare il fissativo, immergere i vetrini nel barattolo con PBS.

I vetrini sono ora pronti per la colorazione per eseguire un fissaggio duro utilizzando formaldeide o glutaraldeide. Iniziare diluendo la soluzione di formaldeide o glutaraldeide di grado reagente in PBS a una concentrazione finale compresa tra 0,5 e 4%Le aliquote possono essere conservate a una temperatura compresa tra meno 20 e meno 30 gradi e scongelate secondo necessità. Ricorda, la formaldeide e la glutaraldeide sono sempre molto tossiche, quindi devi indossare i guanti e lavorare in una cappa aspirante.

Prendi un paio di diapositive inferiori e superiori dal ghiaccio secco e ruotale rapidamente immediatamente. Posizionare il vetrino inferiore che contiene i vermi in un piatto piano con coperchio, scartare immediatamente il vetrino superiore, pipettare immediatamente 200 microlitri di fissativo al centro dell'area del vetrino. Con i vermi, il fissativo si congela parzialmente sul posto, quindi si scioglie per coprire una regione più ampia del vetrino.

Se i vermi non sono completamente coperti di fissativo immediatamente e con attenzione, aggiungere altro fissativo utilizzando una micro pipetta. Non lasciare che il fissativo scorra oltre il bordo del vetrino. Aggiungi salviette bagnate piegate senza lanugine al piatto per mantenerlo umidificato.

Non permettere che le salviette tocchino i vetrini. Quindi coprire il piatto con un coperchio e lasciarlo per 10 minuti per una notte a temperatura ambiente dopo che il fissaggio è completo, utilizzare una pipetta per trasferire con cura il fissativo con vermi sciolti in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi immergere il vetrino in un barattolo di colorazione contenente PBS.

Girare il tubo contenente i vermi ad alta velocità per 30 secondi per pellettarli. Sciacquare i vermi due volte con PBS. Quindi procedere alla colorazione parallelamente ai vermi sul vetrino.

Il protocollo di colorazione degli anticorpi è simile ai protocolli standard per qualsiasi tessuto sui vetrini ed è descritto in dettaglio nel documento di accompagnamento. Dopo la colorazione, trasferire i vetrini su PBS e lasciarli lì fino a 12 ore a quattro gradi Celsius fino al momento del montaggio. Per montare le diapositive, rimuovere una diapositiva dal PBS.

Usa un panno privo di lanugine per asciugare il retro e poi posizionalo brevemente su un tovagliolo di carta rapidamente. Posizionare circa 20 microlitri di terreno di montaggio sui vermi in modo che ci siano parti approssimativamente uguali di terreno e PBS. Sulla diapositiva.

Inclinare delicatamente la slitta per mescolare le due soluzioni. Attenzione: il mezzo di montaggio è tossico. Tenendo il bordo smerigliato.

Inclinare la slitta in modo che la soluzione si raccolga vicino alla glassa. Quindi posizionare un bordo di un vetrino coprioggetti da 24 x 60 millimetri sulla soluzione per ridurre al minimo le bolle d'aria che aumentano lo sbiancamento e interrompono la visione. Abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti.

Se si formano delle bolle, sollevare lentamente il bordo del vetrino coprioggetto. Quindi, senza scivolare sui vermi, abbassarlo. Aggiungi più PBS se necessario per eliminare le bolle d'aria.

Utilizzando un panno privo di lanugine, comprimere i bordi del vetrino coprioggetti e farlo scorrere con cautela per asciugare il bordo. Il bordo del vetrino deve essere visibile tutt'intorno al bordo del vetrino coprioggetti e non deve essere troppo bagnato. Sigillare il vetrino coprioggetto e applicare due o tre strati di smalto sul bordo.

Una volta che il vetrino è ben sigillato e asciutto, pulire il vetrino coprivetrino e il retro del vetrino e posizionarlo in un pozzetto portavetrini. I vetrini sigillati possono essere conservati giorni a quattro gradi Celsius o settimane a meno 20 gradi Celsius per periodi più lunghi. La colorazione del DNA e la maggior parte dei coloranti verdi sbiadiscono risigillando il vetrino coprioggetto con più smalto per unghie secondo necessità, in particolare dopo aver utilizzato qualsiasi lente ad immersione in olio.

Le seguenti immagini rappresentative sono state raccolte utilizzando vetrini realizzati durante i primi tentativi di colorazione degli anticorpi degli studenti universitari in un corso di laboratorio di biologia cellulare. Questa immagine mostra un esempio delle teste di due ermafroditi adulti che sono adeguatamente compresse, screpolate e leggermente fissate con acetone metanolo. Sono stati etichettati con più anticorpi e coloranti.

In questo caso, praticamente l'intero verme è accessibile agli anticorpi. La colorazione qui, la posizione dei nuclei come indicato dalla colorazione DPI indica quali parti del verme sono intatte. Quando i vermi sono sottoposti a un fissativo più duro come la formaldeide, la morfologia del verme può diventare distorta.

Questo può essere visto in queste immagini come un aspetto ondulato dei muscoli mostrati in rosso. Un altro problema comune associato all'uso di fissativi più duri è la fissazione o la penetrazione irregolare di particolari tessuti. Questo può essere visto qui dove il muscolo mostrato in rosso è colorato solo in una parte del verme.

Qui, la presenza di altre colorazioni, incluso il DNA, mostrate in blu indica che almeno una parte del corpo era presente. Il modello risultante di colorazione parziale può essere facilmente identificato con la pratica in modo che l'intera distribuzione della colorazione possa essere determinata anche se un singolo verme mostra una colorazione non uniforme. Di seguito sono illustrati i problemi più comuni riscontrati con il freeze cracking in qualsiasi condizione di fissaggio.

Il problema più comune è la torsione del campione a causa del movimento relativo dei due vetrini. Durante la compressione Qui, la morfologia dei tessuti colorati indica che il corpo del verme è attorcigliato appena dietro la faringe. Questa immagine mostra anche il problema con la colorazione dello sfondo dovuta all'attaccamento dell'anticorpo alla polilisina che riveste il vetrino.

Questo può essere evitato utilizzando il microscopio confocale. Si noti che anche con la pratica, molti singoli vermi andranno persi o mostreranno alcuni dei problemi mostrati qui. Una volta padroneggiata, la preparazione e il fissaggio possono essere eseguiti in un'ora e la colorazione può essere eseguita in un giorno.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una varietà di metodi di fissazione al fine di ottimizzare la colorazione per un dato anticorpo e tessuto.