Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare un gran numero di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi controllate. Ciò si ottiene preparando prima le piastre a micropozzetti per raggruppare le cellule da formare in steroidi. In una seconda fase, viene raccolta una coltura del tipo di cellula desiderato, che fornisce la sospensione cellulare che determina le dimensioni e la composizione degli OID.

La sospensione cellulare viene quindi centrifugata nei micro pozzetti e incubata per consentire la formazione di steroidi dopo l'incubazione. Gli steroidi risultanti sono altamente uniformi e possono essere raccolti o coltivati nei micro pozzetti in cui si sono formati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è possibile produrre contemporaneamente un numero molto elevato di aggregati uniformi.

Le persone che non conoscono questo metodo potrebbero scoprire che il loro carburante è di dimensioni molto grandi. È importante assicurarsi che la sospensione della cella sia distribuita uniformemente sulla piastra e che i supporti della piastra oscillante nel Fuge centrale si muovano liberamente in modo che la forza sia perpendicolare alla superficie. Per iniziare, preparare una piastra agro well 400 sterile aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di risciacquo contenente tensioattivo a ciascun pozzetto.

L'uso di tensioattivo assicura che le cellule non interagiscano con la superficie del micropozzetto. Per evitare di intrappolare bolle d'aria nei micro pozzetti, aggiungere del liquido su un lato e lasciarlo diffondersi sulla superficie piuttosto che lasciarlo cadere verticalmente sulla superficie. Dopo aver aggiunto la soluzione ai pozzetti, riposizionare il coperchio.

Assicurarsi che il rotore sia correttamente bilanciato prima di centrifugare le piastre per due minuti a 2000 volte G.To rimuovere le bolle utilizzando un microscopio invertito a basso ingrandimento, verificare che le bolle siano state rimosse dai micro pozzetti. Incubare la piastra per almeno 30 minuti con il coperchio a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Aspirare la soluzione di risciacquo dai pozzetti e lavare la piastra con acqua sterile o PBS immediatamente prima dell'uso.

Non lasciare che le piastre si asciughino dopo la codifica. I dettagli della preparazione cellulare variano a seconda del tipo di cellula specifico studiato. Tuttavia, abbiamo osservato che questa condizione è efficace per un'ampia gamma di cellule, comprese le linee di cui abbiamo discusso qui, così come le cellule staminali embrionali umane e neuronali, le cellule staminali pluripotenti indotte umane, i fibroblasti, gli endone putativi, primitivi e le cellule stromali Per preparare le cellule, iniziare con la fiaschetta T 75 di cellule HT 29.

Aspirare il terreno di coltura dal pallone e aggiungere tre millilitri di tripsina. Incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Fermare la digestione della tripsina aggiungendo tre millilitri di terreno di coltura.

Trasferire il resto in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi, da una provetta da 15 millilitri, prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule. Centrifugare le celle per cinque minuti a 200 volte G mentre la centrifugazione è in corso.

Conta le celle. Quindi, aspirare la miscela di terreno di prova e sostituirla con una nuova crescita. Terreno ad un volume determinato dalla densità cellulare richiesta precedentemente calcolata come descritto nel protocollo di testo come passaggio opzionale.

Passare la sospensione cellulare attraverso un colino per rimuovere eventuali grumi. Gli sferoidi possono essere generati in una varietà di formulazioni di terreno, tuttavia le prove iniziali dovrebbero essere effettuate utilizzando il terreno in cui le cellule sono state coltivate. Per distinguere le conseguenze del passaggio a un sistema di coltura tridimensionale dalle conseguenze del cambiamento della composizione del terreno, iniziare aggiungendo 0,4 millilitri di terreno di coltura a ciascuna centrifuga a 2000 volte G.To rimuovere le bolle utilizzando un microscopio invertito a basso ingrandimento, verificare che le bolle siano state rimosse dai micro pozzetti.

Quindi, aggiungere 0,4 millilitri di sospensione cellulare alla densità richiesta ai micro pozzetti. Quindi mescolare delicatamente pipettando su e giù senza introdurre bolle d'aria nei micro pozzetti, assicurandosi che le cellule siano distribuite uniformemente in tutto il pozzetto. Per ottenere steroidi coerenti.

Centrifugare la piastra per cinque minuti a 200 volte. G, la piastra deve essere bilanciata internamente e contro l'altra piastra in modo che il peso sia distribuito uniformemente su entrambi i lati del portapiastre. Ciò garantisce che la piastra si autolivella durante la centrifugazione, in modo che non si verifichino correnti di convezione che si traducono in una distribuzione non uniforme delle celle tra i micro pozzetti.

Utilizzando un microscopio invertito, verificare che le cellule si siano raggruppate all'interno dei micro pozzetti e che siano distribuite uniformemente sul pozzetto prima di incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Osservare il processo di formazione degli sferoidi utilizzando un microscopio invertito. Alcune linee cellulari formeranno steroidi compatti entro 24 ore.

Altri potrebbero richiedere più tempo. La progressione da cluster ad aggregato nelle cellule HT 29 è mostrata qui. La parte più difficile di questa procedura è quella di estrarre gli steroidi intex senza disturbare le strutture Per estrarre gli steroidi dai micro pozzetti, pipetare su e giù molto delicatamente per far uscire gli sferoidi dai micro pozzetti.

Quindi inclinare la piastra per aspirare la miscela di steroidi medi. Utilizzare punte di pipette a orifizio largo per steroidi di dimensioni maggiori per evitare di abbattere lo steroide. Dopo aver recuperato lo steroide dai micro pozzetti, trasferirlo nella coltura in sospensione spruzzandoli delicatamente con una pipetta.

In alternativa, la rosa grave può essere mantenuta in convulsioni con una sostituzione media. La durata dipende dalle dimensioni iniziali e dal tasso di crescita, che definisce il tempo fino a quando non diventano troppo grandi per i micro pozzetti. Bene, sono stati formati per sostituire il mezzo senza perdere steroidi.

Aspirare il terreno sul bordo del pozzo. Usando una pipetta da pascolo, abbassare lentamente la punta fino a quando non inizia ad aspirare il liquido dal menisco e seguire il menisco verso il basso mentre scende. Quindi aggiungere un terreno fresco contro la parete del pozzo nello stesso punto.

Quando si aggiunge il terreno fresco, ricordarsi di spingere delicatamente il pipettatore e di tenere la punta contro la parete per evitare il disturbo del PHE nei micropozzetti. Alcuni steroidi possono essere persi. Tuttavia, se il fluido viene sempre aspirato e sostituito nella stessa posizione, questo numero rimarrà piccolo.

Rispetto al gran numero nel pozzetto, gli steroidi provenienti da più linee tumorali di diverse origini anatomiche possono essere facilmente estratti in sospensione. Il controllo costante delle dimensioni ottenibile con questo metodo è dimostrato qui con popolazioni di steroidi altamente uniformate. In ogni condizione formata da 700 o 1.500 cellule.

Chiare differenze interline nel comportamento sono visibili anche con le cellule tumorali del colon HT 29 e le cellule tumorali esofagee TE six che formano steroidi densamente impacchettati con confini ben definiti. Al contrario, le cellule tumorali della prostata lin cap danno origine a steroidi meno coerenti con confini irregolari. Le forze interne più forti negli aggregati più coerenti hanno anche provocato il collasso in una forma più simmetrica, anche mentre erano ancora nei micropozzetti in cui si sono formati.

Tuttavia, gli aggregati lin cap, in particolare alle dimensioni maggiori, mantengono visibilmente la geometria parametallica quadrata dei micro pozzetti. Una volta padroneggiato, questo processo può essere eseguito in circa un'ora più il periodo di incubazione necessario affinché le cellule aderiscano e producano fluidi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che bolle un altro, viaggiando nei micro pozzetti prima di aggiungere le cellule.