Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare la fluorescenza per quantificare la risposta allo scoppio respiratorio. Per prima cosa, caricare gli embrioni di pesce zebra nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Quindi aggiungere un substrato fluorescente e attivare lo scoppio respiratorio con un agente chimico.

Quindi quantificare la fluorescenza relativa utilizzando un fluorimetro. In definitiva, la fluorescenza viene utilizzata per mostrare il potenziale di scoppio respiratorio. Questo metodo può essere utilizzato per studiare come le manipolazioni sperimentali influenzano la salute immunitaria innata generale.

Qui lo usiamo per fornire informazioni sull'esplosione respiratoria degli embrioni di zebrafish, ma può anche essere applicato ad altri sistemi come zebrafish adulto, cellule renali e preparati cellulari di altre specie ittiche. Far crescere gli embrioni in piastre di Petri profonde a 28 gradi Celsius in acqua d'uovo fino allo stadio di sviluppo desiderato. Rimuovi tutti gli embrioni morti ogni giorno.

Decantare con cura l'acqua d'uovo vecchia e rabboccare con acqua d'uovo nuova ogni giorno. Il giorno dell'esperimento, preparare una soluzione di lavoro a fluoresceina ridotta in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri avvolta in un foglio di alluminio. Preparare anche una soluzione di lavoro di 20 microgrammi per millilitro di concentrazione finale di PMA.

Quindi preparare cinque millilitri di ciascuna soluzione di dosaggio in provette coniche da 15 millilitri come descritto nel testo allegato. Tenere le soluzioni di dosaggio sul ghiaccio prima di accendere il lettore di micropiastre e riscaldare la sorgente luminosa per misurare la fluorescenza. Imposta un programma che descrive in dettaglio le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, la sensibilità della posizione dell'ottica e includi anche una fase di agitazione di cinque secondi.

Prima della canna, predisporre le forniture sperimentali di piatti con embrioni rivestiti. Una micropiastra nera a 96 pozzetti, un pipettatore P 200 e punte un secchiello per il ghiaccio con i reagenti contenenti fluoresceina. Un pipettatore multicanale P 200, due serbatoi sterili, un foglio di alluminio e forbici.

Ora taglia la punta di una pipetta in modo che gli embrioni o i reni possano passare attraverso l'apertura. Impostare un pipettatore P 200 a 100 microlitri e trasferire un embrione insieme all'acqua d'uovo nel numero desiderato di pozzetti di una micropiastra nera a 96 pozzetti. Versare ora la soluzione di dosaggio in un serbatoio sterile da 25 millilitri con un pipettatore multicanale P 200.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione di dosaggio H 2D CFDA in una colonna delle 96. Ripetere la micropiastra per metà dei campioni di embrione di controllo e per metà dei campioni di embrioni manipolati sperimentalmente. Versare la soluzione di dosaggio contenente PMA in un nuovo serbatoio sterile da 25 millilitri.

Quindi aliquotare questa soluzione di dosaggio nelle colonne rimanenti della micropiastra a 96 pozzetti. Coprire la micropiastra con un foglio di alluminio e metterla su uno shaker per circa 20 secondi. A 150 giri/min, incubare la micropiastra a 28 gradi Celsius quando non viene letta.

Leggere la micropiastra dopo l'aggiunta di PMA. Continuare a effettuare misurazioni ogni pochi minuti per l'intervallo di tempo desiderato o incubare la micropiastra avvolta in un foglio di alluminio a 28 gradi Celsius fino a un punto temporale fisso. Successivamente, recuperare gli embrioni dai pozzetti e sopprimere gli embrioni secondo il protocollo istituzionale di cura e utilizzo degli animali.

Inoltre, smaltire la micropiastra e altri materiali usa e getta nel verniciatore per rifiuti a rischio biologico. Decidi il momento in cui desideri confrontare la fluorescenza. Sottrarre il valore medio di fluorescenza del gruppo di controllo non indotto dai valori di fluorescenza influenzale del singolo gruppo di controllo indotto da PMA.

Ripetere l'operazione per il gruppo sperimentale con e senza PMA. Quindi memorizzare questi valori di fluorescenza normalizzati in colonne, il gruppo di controllo più PMA e il gruppo sperimentale più PMA. Successivamente, calcolare le medie e le deviazioni standard per i valori di fluorescenza normalizzati del gruppo di controllo più PMA e del gruppo sperimentale più PMA.

Confrontare i valori di fluorescenza normalizzati utilizzando un test T non accoppiato per determinare la significatività statistica. Ora, rappresentando graficamente le medie del gruppo di controllo più PMA e del gruppo sperimentale più PMA con barre di errore che riflettono le deviazioni standard appropriate, registrare il livello di significatività sul grafico e nella legenda della figura. Questo esperimento confronta la risposta respiratoria burst in embrioni di zebrafish wild type di background AB a 48 ore e 72 ore dopo la fecondazione.

La fluorescenza grezza è stata misurata quattro ore dopo l'aggiunta di PMA nei gruppi indotti da PMA. I valori di fluorescenza grezza erano più alti nella popolazione di 72 HPF. Come indicato dalle medie calcolate, i valori di fluorescenza sono normalizzati per tenere conto della variabilità dei livelli di fluorescenza di fondo.

I risultati di questo test di burst respiratorio hanno rivelato che i 72 embrioni di zebrafish HPF sono in grado di produrre un numero significativamente maggiore di specie reattive dell'ossigeno e quindi di montare una risposta respiratoria più robusta rispetto ai 48 embrioni HPF dopo l'induzione con PMA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la fluorescenza per quantificare il potenziale di scoppio respiratorio degli embrioni di zebrafish. Non dimenticare che lavorare con la polvere di PMA può essere estremamente pericoloso, quindi usa precauzioni come indossare una maschera facciale mentre pesi la polvere di PMA.