A base di acido Polymalic Nano biopolimeri per il targeting di più marcatori tumorali: un'opportunità per la medicina personalizzata?

L'obiettivo generale è quello di sviluppare una piattaforma a scala nanometrica aperta, che consenta un protocollo universale per la sintesi di farmaci personalizzati in base al profilo genetico della malattia di un individuo, in particolare per il cancro. In primo luogo, produrre e purificare l'acido polimalico dal microrganismo *Polycephalum*, quindi attivare chimicamente il PMLA purificato sui suoi gruppi carbossilici laterali. Attaccare i gruppi funzionali di piccole dimensioni e il linker MEA mediante sostituzione dei gruppi attivati e riconvertire i gruppi attivati non utilizzati in gruppi carbossilici tramite idrolisi.

Successivamente, aggiungere gli anticorpi e le molecole antisenso tramite i gruppi sulfidrilici dello spaziatore, MEA e cap. Lo spaziatore non utilizzato mediante reazione con PDP al termine del test ne verifica la composizione e la funzione del composto principale. Il farmaco nano deriva da un modello animale come topi portatori di tumori umani aggressivi.

I tumori mammari positivi per HER2 possono determinare l'efficacia del trattamento e anche se il trattamento è privo di effetti collaterali indesiderati. Il principale vantaggio della bioproduzione rispetto ai metodi sintetici esistenti, come la polimerizzazione a catena, è che il biopolimero mantiene una purezza ottica completa e non è contaminato da sottoprodotti. Questa famiglia di nano farmaci PolyPhen può bersagliare qualsiasi tipo cellulare in base a un indirizzamento specifico e regolare l'espressione proteica.

In generale, il trattamento del cancro mediante farmaci nanostrutturati a base di PHE risulta molto efficace in diversi modelli animali, in particolare nei tumori primari del cervello e del seno. Abbiamo inizialmente sviluppato questo metodo per bloccare la sintesi della laminina specifica del glioblastoma nelle sue forme iso, e successivamente abbiamo dimostrato che è possibile indirizzare e inibire le proteine del recettore HER2 e quelle del carcinoma mammario triplo negativo, impedendo così la crescita tumorale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono anche alla diagnosi del cancro mediante l'uso di imaging ottico e risonanza magnetica.

I farmaci polinano possono fornire informazioni utili per la somministrazione di farmaci nel trattamento del cancro. Possono inoltre essere applicati ad altre condizioni patologiche come malattie infettive, alleviamento del dolore e disturbi neurologici. Dopo aver coltivato una cultura iniziale di plasmodio da spial su auger, inoculare 100 millilitri di mezzo di coltura basale e far crescere la coltura a 25 gradi Celsius.

L'incubatore Thermos produce una quantità di microplasma modia compattato per gravità in assenza di luce. Per evitare la sporulazione in un reattore biologico da 10 litri, sciogliere 80 grammi di carbonato di calcio in otto litri di mezzo basale, quindi trasferire il microplasma modia compattato nel reattore montato e impostare il processo biotecnologico per 75 ore a 25 gradi Celsius, con un flusso d'aria filtrata di 10 litri al minuto e un'agitazione a 150 giri al minuto mediante un'asta agitatrice segmentata.

Quando il brodo di coltura raggiunge un pH di 4,8, interrompere la coltura per misurare la produzione di acido polimaleico. Raffreddare ora il brodo a 17 gradi Celsius e lasciare sedimentare le cellule per gravità, quindi rimuovere il sopranatante di coltura dal reattore. Regolare il pH a 7,5.

Ora pompare il soprannatante dal fondo attraverso una colonna di cellulosa DEAE da 1,5 litri equilibrata con cloridrato di tris 20 millimolare pH 7,5 a cinque gradi Celsius. Successivamente, far passare tre volumi di tampone di lavaggio contenente cloruro di sodio 0,3 molare dal fondo alla sommità della colonna ed eluire il PMLA in presenza di cloruro di sodio 0,7 molare. Regolare la frazione di PMLA eluita a cloruro di calcio 0,1 molare e aggiungere etanolo ghiacciato all'80% per precipitare il calcio PMLA. Successivamente, effettuare una frazionatura per dimensione del calcio PMLA utilizzando cidex G 25 e acqua.

Infine, far passare ogni frazione su una colonna illuminata da luce ambrata e congelare immediatamente il flusso di acido polimalico in azoto liquido, quindi liofilizzare prima di conservare a meno 20 gradi Celsius. Per attivare i gruppi carbossilici del PMLA, mescolare un millimole di unità maliche di P-M-L-A-H in un millilitro di acetone anidro e un millimole ciascuno di idrossi CIN ammide e cicloesil carbodiimmina in due millilitri di dimetilformammide; dopo aver agitato a 20 gradi Celsius per tre ore, aggiungere 0,05 millimoli di metil Pega ammina in un millilitro di DMF, seguiti da 0,05 millimoli di trietilammina.

Quindi, aggiungere in modo goccia a goccia 0,4 millimoli di estere etilico della leucina e, dopo un'ora, verificare il completamento della reazione mediante risposta negativa al test dell'ossidrileamina su cromatografia su strato sottile. Analogamente, aggiungere 0,1 millimoli di 2-mercaptoetilammina e 0,5 millimoli di TEA. Rimuovere l'eccesso di estere NHS mediante idrolisi spontanea con soluzione salina tamponata al fosfato.

Desalare su una colonna PD 10 e liofilizzare per ottenere una polvere bianca; conservare questo pre-coniugato secco a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 30 milligrammi di anticorpo in 4,5 millilitri di cloruro di sodio 150 millimolare in fosfato di sodio 100 millimolare a pH 5,5. Ridurre i legami disolfuro con tris 5 millimolare, cloridrato di due carbossi etil fosfina, e purificare su una colonna PD 10.

Ora sciogliere l'IDE PEG IDE in due millilitri del tampone sopra indicato, anche se a pH 6,3. Aggiungere l'anticorpo ridotto e agitare a 20 gradi Celsius per un'ora. Concentrare fino a 2,5 millilitri su AVEVA spin 20 con esclusione di 30 kilodalton, quindi purificare su cidex G 75.

Ora verificare il prodotto mediante SEC HPLC. Misurare la quantità a 280 nanometri e confermare anche l'assenza di impurezze ad altre lunghezze d'onda. Successivamente, mescolare 50 milligrammi del pre-coniugato con 200 MLEs dell'anticorpo coniugato con PEG IDE in cinque millilitri di tampone a pH 6,3.

Regolare la concentrazione di sulfhydrol a due millimolari e incubare a 20 gradi Celsius per tre ore. Per ottenere una resa del 98%, solubilizzare l'oligonucleotide antisenso amino in posizione tre prime facendolo reagire con un volume di SPDP, purificare l'A-O-N-P-D-P su Sephadex LH-20 in metanolo, quindi evaporare il metanolo, sciogliere il prodotto in acqua e liofilizzare. Incubare ora 800 nanomoli dell'aos attivato con il pre-coniugato anticorpo-PEG al MEA-SH durante la notte. Quando la reazione di scambio disolfuro è terminata, incorporare il blocco con il colorante fluorescente, bloccare gli eccessi di sulfhydrol con PDP e purificare su Sephadex G-75.

Conservare il nano farmaco finale a base di acido polimalico a meno 20 gradi Celsius. Per stimare il contenuto di acido polimalico durante la produzione, procedere come segue: aggiungere a 320 microlitri di campione 160 microlitri di cloruro di idrossilammonio al 10% e 160 microlitri di idrossido di sodio al 10%. Dopo 10-15 minuti, mescolare con 160 microlitri di soluzione di cloruro ferrico al 5% e visualizzare la formazione di un colore viola scuro a 540 nanometri. Successivamente, idrolizzare il nano farmaco durante la notte in acido cloridrico due molare a 110 gradi Celsius utilizzando un saggio con ampolla sigillata per l'acido malico mediante cromatografia a fase inversa.

Utilizzando campioni arricchiti con standard di acido maleico. Ora scindere il farmaco nano con diidrossi tre etolo 100 millimolare e misurare gli oligonucleotidi antisenso morph mediante HPLC a fase inversa quantitativa rispetto agli standard di ON morpho a. Utilizzando il farmaco nano scisso, misurare il contenuto di anticorpo mediante un kit per saggio proteico per quantificare il contenuto di Malik PEG.

Prima, far reagire con tiocianato di ammonio, quindi estrarre con cloroformio e misurare l'assorbanza a 510 nanometri. Verificare l'attività dell'anticorpo e la co-legatura mediante ELISA utilizzando cinque microlitri di nano farmaco per pozzetto e 0,5 microgrammi per pozzetto di Her2 come antigene immobilizzato sulla piastra. Infine, calcolare la percentuale ottenuta per l'oligonucleotide antisenso, EG e l'anticorpo in relazione all'acido maleico.

Confrontare con la percentuale prevista dalla progettazione del farmaco. Questo approccio strategico bimodale nei confronti del farmaco nano utilizza l'Herceptin per inibire la via di segnalazione HER2 e un oligonucleotide antisenso specifico per HER2 per bloccare la trascrizione del recettore HER2; gli anticorpi facilitano la transcitosi attraverso il recettore della transferrina endoteliale (TFR) dei vasi tumorali. La piattaforma nanoconiugata di acido polimalico è stata prodotta mediante microplassma coltivato e purificata; l'attivazione dei gruppi carbossilici del PMLA ha facilitato la sintesi dello scaffold pre-coniugato.

E infine, il nanocongiugato contenente piombo. Saggi ELISA hanno dimostrato il mantenimento di anticorpi monoclonali attivi durante l'intera sintesi del farmaco nanostrutturato. Con entrambi gli anticorpi assemblati sulla stessa piattaforma polimerica, la microscopia confocale a fluorescenza ha permesso di seguire l'assorbimento cellulare del farmaco nanostrutturato.

Le immagini sovrapposte a zero e tre ore sono state analizzate insieme agli endosomi marcati. I coefficienti di correlazione di Pearson per la codistribuzione indicano il rilascio del nano farmaco dagli endosomi nel citoplasma e la dissociazione di un oligonucleotide dal nano farmaco mediante scissione disolfidica dipendente dal glutatione nel citoplasma. In vitro, il nano farmaco principale ha inibito in modo significativo la crescita in maniera più efficace nella linea cellulare che sovraesprime HER2.

Gli esperimenti in vivo in topi portatori di carcinoma mammario umano BT474, con sovraespressione di HER2, hanno mostrato un'inibizione della crescita superiore al 95% grazie al nano farmaco principale contenente Herceptin. Inoltre, analisi ex vivo mediante Western blot specifici per HER2 hanno indicato l'inibizione sia della sintesi di HER2 sia della fosforilazione di AKT, mentre la scissione di PARP ha evidenziato l'apoptosi. La regressione tumorale in risposta al trattamento farmacologico è dimostrata dal ridimensionamento del tumore e dalla deplezione delle cellule tumorali osservata all'esame istologico.

Ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare una piattaforma nano biocompatibile per ottenere un trattamento personalizzato efficace, privo di effetti collaterali, e realizzare un farmaco nano con una composizione controllata e attività funzionali verificate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita con elevata riproducibilità dopo il suo sviluppo. Questa metodica, che impiega una piattaforma nano a base di acido poliacrilico per il rilascio mirato di oligonucleotidi antisenso, apre la strada ai ricercatori nel campo della medicina nano personalizzata per esplorare trattamenti antitumorali diretti verso specifici marcatori molecolari tumorali identificati mediante analisi genetiche personalizzate. Dal punto di vista farmacologico, agenti attivi e cellule possono risultare estremamente pericolosi.

Precauzioni come indossare maschera e guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.