Name: Induzione farmacologica di melanina epidermica e di protezione contro le scottature in un modello di topo umanizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Scopri come indurre melanina epidermica con forskolina in un modello murino umanizzato per proteggere la pelle dai danni UV. Questo metodo farmacologico offre nuove strategie contro le scottature solari.

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Gli autori desiderano ringraziare Malinda Spry per l&#39;assistenza tecnica. Riconosciamo inoltre fonti di finanziamento attuali e passati: il National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will causa Cancer Research Fund, il Cancer Foundation Markey, i bambini Miracle Network e Jennifer e David Dickens Melanoma Research Foundation.

1. Preparazione di forskolina per topica Amministrazione da un greggio estratto di radice della pianta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Protocolli per esperimenti murini hanno seguito le linee guida per una condotta etica nella cura e l&#39;uso di animali e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l&#39;Università del Kentucky (protocollo # 00768M2004). L&#39;estratto di radice è composto al 40% peso / volume in una base dermatologica tenore di etanolo al 70%, 30% di glicole propilenico. </li><li> Pesare 200 g di estratto di radice forskolina greggio e trasferirlo in un becher. Per fare 500 ml di 40% (w / v), risospendere 200 g di estratto di radice forskolina grezzo aggiungendo maggior parte ma non tutto il volume del veicolo (70% etanolo, 30% di glicole propilenico) e portare la soluzione al circa 450 ml. </li><li> Agitare per un&#39;ora a temperatura ambiente. La soluzione sarà leggermente viscoso e può richiedere agitazione manuale &quot;lift&quot; dell&#39;estratto in soluzione primal&#39;ancoretta è in grado di prendere il sopravvento. </li><li> Dopo un&#39;ora di agitazione, si versa la miscela in un cilindro graduato e portare il volume a 500 ml con veicolo che è stato utilizzato per &quot;lavare&quot; il becher utilizzato per mescolare l&#39;impasto (per massimizzare il recupero di forskolina dal bicchiere) . </li><li> Trasferire l&#39;impasto per 50 ml provette per centrifuga in polipropilene. Centrifuga (1.500 xg, a temperatura ambiente, 15 min) utilizzando una centrifuga da tavolo. A questo punto, il materiale insolubile sarà abbastanza compatta, permettendo il supernatante di essere facilmente travasato. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso una membrana di acetato di cellulosa 0,22 micron per rimuovere il materiale insolubile residuo dall&#39;estratto. Utilizziamo un sistema per bottiglia progettata per coltura cellulare, insieme con l&#39;uso di prefiltri fornite con l&#39;unità per evitare un precoce intasamento della membrana da componenti insolubili della radice estratto. Quando si effettuano grandi volumi di dell&#39;estratto, filtrare circa 100 ml per volta, cambiando la scommessa prefiltroween ogni volume aggiunto. </li><li> Se conservato a temperatura ambiente, l&#39;estratto mantiene l&#39;attività biologica per fino ad un anno. </li></ol> 2. Preparazione di C57Bl / 6 K14-Scf Mice per trattamenti topici <ol><li> Rimuovere la pelliccia dorsale dagli animali da taglio elettrico. Brevemente anestetizzare gli animali con isoflurano inalatoria per facilitare taglio di pelliccia dorsale con cesoie elettriche attrezzati con una testa di preparazione chirurgica 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferibilmente utilizzare un solo tipo di anestesia (es ketamina / xilazina) per minimizzare il rischio di overdose di anestetico. La camera di inalazione satura comporta dei rischi sul lavoro quando viene utilizzato al di fuori di una cappa aspirante e fornisce quantità sconosciuta di anestetico per animali. Idealmente dovrebbe essere usato un vaporizzatore precisione. </li><li> Per rimuovere stoppie capelli residui, trattare gli animali con un depilatorio chimico. Somministrare anestesia per l&#39;animale con una iniezione ip di ketamina 40 mg / kg e xilazina 4 mg / kg </li&gt; <li> Una volta che gli animali sono adeguatamente anestetizzati (come giudicato da pinch tep), applicare una quantità dito dimensioni di crema depilatoria per la pelle dorsale tranciato con un dito guantato. Strofinare la crema sulla pelle per 30-60 secondi o fino a quando i capelli sono chiaramente visibili nella crema come viene spostato. Lasciare la crema solo per il tempo minimo necessario per la depilazione come l&#39;esposizione prolungata porta a bruciare chimica della pelle, ripartizione epidermica e la morte da perdita di integrità epidermica. </li><li> Pulire la pelle dorsale con garza imbevuta di acqua più volte fino a tutto crema è stato rimosso. Animali asciugare con asciugamani di carta morbidi, e consentire loro di recuperare in un luogo appartato caldo (ad esempio le gabbie pulite collocati su un tappetino di riscaldamento). Depilare gli animali uno per uno e monitorare attentamente tutta la procedura. </li></ol> 3. Somministrazione topica di forskolina o Vehicle Control <ol><li> Gli animali devono essere trattati uno alla volta. Brevemente anestetizzare con inspirazioned isoflurano posizionando il mouse sulla cima di un filtro di nylon permeabile all&#39;aria forma-misura in base al quale è stato posto un tovagliolo di carta isoflurano satura in un barattolo di vetro con coperchio isoflurano satura in una cappa aspirante. Esporre il mouse per isoflurano per un tempo sufficiente per sopprimere i movimenti muscolari volontari ma per preservare la respirazione spontanea (tipicamente 10-20 sec). Lasciando l&#39;animale in isoflurane troppo a lungo si tradurrà in soppressione respiratoria e morte. E &#39;meglio sbagliare sul lato di &quot;andare luce&quot; e dover ri-esporre il mouse brevemente più isoflurano, piuttosto che a un eccesso di esporre l&#39;animale alla morte di droga e di rischio. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera di isoflurano e posizionare su una panchina pad assorbente pulita. </li><li> Usando una micropipetta 1.000 ml dotato di una punta in polipropilene monouso, elaborare 400 ml di 40% di estratto di forskolina greggio (animali di controllo del veicolo riceveranno il 70% di etanolo, 30% glicole propilenico solo). </li><li> Trasferire l&#39;estratto suldorso dell&#39;animale per gocciolamento esso sulla pelle e poi, usando il lato della punta della pipetta, spalmare l&#39;estratto sulla pelle dorsale finché tutta la pelle è stata coperta. Non c&#39;è bisogno di asciugare la pelle dopo l&#39;applicazione. </li><li> Riportare il mouse per sua gabbia, e osservare attentamente fino a che non recupera dall&#39;anestesia. </li><li> In modo che gli effetti cAMP non-pigmento non devono confondere gli esperimenti di sensibilità ai raggi UV, interrompere tutti i trattamenti topici 2 giorni prima della esposizione ai raggi UV (effetto pigmento dura diversi giorni al di là ultimo trattamento topico). </li></ol> 4. Pelle misurazione del colore da riflettente Colorimetry <ol><li> Brevemente anestetizzare il mouse con isoflurano inalato (vedi sopra). </li><li> Calibrare un colorimetro Minolta posizionando la testa portatile sulla superficie bianca standard predisposta con il colorimetro. </li><li> Posizionare la testa di misura portatile del filo colorimetro con la pelle dorsale dell&#39;animale garantire che il 1 cm2 turno aperture è completamente premuto sulla pelle. Prendere almeno tre misurazioni distinte in diverse aree della pelle dorsale. </li><li> Calcola medio di L * punteggio ± SD per animale e per gruppo di trattamento. Colorimetria riflettente può essere fatto in qualsiasi punto nell&#39;esperimento. </li></ol> 5. Determinazione della sensibilità UV da Calcolo di &quot;Minimal eritematosa Dose&quot; (MED) <ol><li> Utilizzare animali che sono stati pre-trattati con veicolo o forskolina come descritto sopra. Anestetizzare gli animali con l&#39;iniezione intraperitoneale di una miscela standard di ketamina e xilazina (vedi sopra). </li><li> Preparare un pezzo di nastro UV-occlusiva per il test MED. Per generare buchi nel nastro, usare un buco pugno pesante con un 1 cm 2 ritaglio circolare (Figure 2A e B). Avere fori di dimensioni definite e disposizione simmetrica nel nastro facilita il riconoscimento di alterazioni cutanee dopo l&#39;irradiazione. Più di ogni foro nel nastro, applicare una piccola ma facilmente staccabile pezzo<html> di nastro che può essere rimosso in tempi definiti durante l&#39;esposizione UV per consentire la somministrazione di dosi UV diversi. </li><li> Una volta che gli animali siano adeguatamente sedato, posizionare il nastro sulla superficie dorsale. Lubrificante occhio deve essere sempre utilizzato sotto anestesia. </li><li> Accendere la sorgente UV costituito da due Westinghouse F15T8UV-B lampade con una potenza massima di 313 nm e una gamma di 280-370 nm. Lasciare che la lampada raggiunga la un&#39;uscita UV costante come misurato da un fotometro UV con un sensore UVB (richiede in genere un paio di minuti per le lampade per riscaldare). </li><li> Sulla base della velocità di trasmissione UV misurata dal fotometro UV, calcolare il tempo di esposizione UV per ogni dose desiderata. Ad esempio, le misure di uscita della nostra lampada UVB 2,4 mW / cm 2. Pertanto, per amministrare 5 kJ / m 2, la pelle dovrebbe essere esposto a 208 sec (che è 3 min e 28 sec) di radiazione UVB, calcolata di seguito: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Posizionare animali sedati (ciascuna con nastro occlusiva in luogo) ventrale superficie fino a garantire l&#39;esposizione anche ai raggi UV. Per amministrare le dosi scelte di radiazioni UV, in sequenza rimuovere i piccoli nastri occlusive che coprono i fori per esporre uno centimetri 2 zone di pelle alle corrette dosi di radiazioni. Pertanto, usando l&#39;esempio precedente, se il 40 kJ / m 2 è la più grande dose di nell&#39;esperimento, poi l&#39;animale sarebbe sotto la lampada per 27 min e 47 sec totale e la pelle nella condizione 40 kJ / m 2 avrebbe alcun sovrastante il nastro tutto il tempo. Tuttavia, nastro sovrastante la condizione 5 kJ / m 2 verrebbe eliminato quando c&#39;è 208 sec rimanente nella esposizione. Tempo di rimozione del nastro dovrebbe essere fatto in modo tale che ciascuna condizione termina contemporaneamente. </li><li> Dopo l&#39;esposizione ai raggi UV, staccare il nastro dalla pelle dorsale con attenzione, facendo attenzione a non strappare la pelle con movimenti bruschi o eccessivamente forti. Mettere gli animali in un luogo caldo e tranquillo per consentirerecupero dall&#39;anestesia. </li><li> Controllo topi per 24-48 ore a cercare le zone discrete di eritema (arrossamento) o edema (gonfiore) corrispondenti ai siti anatomici trattati con la dose specifica di irradiazione UV. Documentare i risultati della pelle fotograficamente. </li><li> MED valore corrisponde alla dose minima di UV che causa l&#39;infiammazione come definito da eritema e / o edema dell&#39;intero cerchio di pelle esposta. Si noti che la pigmentazione della pelle può impugnare la determinazione del MED, tuttavia, eritema ed edema possono ancora generalmente essere valutati con precisione, grazie anche alla forma definita delle aperture del nastro durante l&#39;esposizione ai raggi UV. </li></ol> 6. Analisi statistica Analizzare i dati tra coorti di topi da una ANOVA con test post Bonferroni (grafico Pad Prism). Valori di p &lt;0,05 sono considerati statisticamente significativi.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Utilizzando un modello animale dell&#39;essere umano pelle chiara, troviamo che l&#39;applicazione topica di un estratto di radice di greggio ricco di forskolina scurisce con fermezza l&#39;epidermide stimolando la produzione di melanina nella pelle. Epidermal melanizzazione dipende dalla espressione del fattore di cellule staminali nell&#39;epidermide basali, come avviene in pelle umana ma non in pelle geneticamente modificato mouse. La pelle dorsale di topi geneticamente modificato manca un numero sufficiente di melan...

L&#39;incidenza del melanoma, la forma più letale di cancro della pelle, è aumentato drasticamente negli ultimi decenni negli Stati Uniti, in particolare tra gli individui di pelle chiara. Prova molecolare ed epidemiologiche forte implica radiazioni UV come un importante fattore ambientale causale 2-5. Esposizione ai raggi UV Aumento in forma di esposizione al sole e l&#39;uso lettino abbronzante è probabile che sia responsabile di gran parte degli aumenti di incidenza melanoma 6-7. Rischio di melanoma sembra particolarmente legata scottature 8, in particolare quelli in giovane età 9-10. Rischio di scottature è legata non solo alla dose e intensità di esposizione UV, ma anche da fattori ereditari che influenzano reazione cutanea alle radiazioni UV. Pigmentazione della pelle è uno dei fattori determinanti più importanti di sensibilità ai raggi UV, il rischio di scottature e rischio di cancro. Il melanoma si verifica circa venti volte più spesso nelle persone di pelle chiara rispetto a individua pelle scuraLS 11-13. La melanina, un pigmento prodotto dai melanociti nell&#39;epidermide, è il principale determinante della carnagione. La melanina viene in due varietà principali: (1) eumelanina, un marrone / nero pigmento scuro efficace per assorbire l&#39;energia della radiazione UV, e (2) Feomelanine, un rossastro / pigmento bionda meno efficace ad impedire la penetrazione di fotoni UV nella pelle. Il colore della pelle, la sensibilità ai raggi UV e rischio di melanoma sono in gran parte determinate dal contenuto epidermica eumelanina 14-15. Eumelanina più nell&#39;epidermide, meno fotoni UV può penetrare nella pelle. A causa dei bassi livelli innate di eumelanina, individui dalla pelle chiara sono molto più inclini a effetti acuti e cronici delle radiazioni UV 16-18. Pigmentazione della pelle, rischio di melanoma e la capacità di &quot;tan&quot; dopo l&#39;esposizione ai raggi UV tutto correlano con la capacità di segnalazione del recettore melanocortina 1 (MC1R), G s-coupled sette transmembrana srecettore urface su melanociti 19-22. Quando MC1R vincola il suo affine ligando ad alta affinità, α-melanocita ormone stimolante (α-MSH), vi è l&#39;attivazione di adenilato ciclasi e la produzione del secondo messaggero cAMP 23. La normale risposta fisiologica della pelle dopo l&#39;esposizione UV comprende la produzione epidermica di α-MSH dai cheratinociti 24-29. Noi e altri ipotizziamo che cheratinociti derivata α-MSH lega a MC1R su melanociti epidermici, avviando la produzione a valle del secondo messaggero cAMP attraverso l&#39;attivazione di adenilato ciclasi 30. livelli di cAMP controllano molti aspetti di differenziazione dei melanociti, comprese le vie di sopravvivenza, la riparazione del DNA e la sintesi del pigmento. Segnalazione MC1R e cAMP inducono chiaramente i livelli degli enzimi del pigmento e la produzione di eumelanina. Quando la segnalazione MC1R è intatto e livelli di cAMP melanocitici sono robusti, eumelanina viene prodotta e la pelle si scurisce. Tuttavia, se la segnalazione MC1R è difettoso elivelli di cAMP citoplasmatici restano bassi, feomelanina è prodotto invece 1. Sintesi di eumelanina può essere stimolata farmacologicamente da agenti che aumentano i livelli di cAMP 1,14,31-35. Poiché la proteina MC1R è un importante regolatore del rischio di melanoma negli esseri umani 36-46, siamo interessati a meccanismi attraverso i quali MC1R protegge contro i melanociti carcinogenesi indotta da UV. Come base per i nostri studi, abbiamo generato un MC1R-variante di modello murino transgenico su un C57BL / 6 background genetico puro 1. In questo modello, fattore delle cellule staminali (SCF) è costitutivamente espressa nell&#39;epidermide basali e melanociti epidermici interfollicolari vengono mantenuti nella pelle per tutta la vita 47, in contrasto con i topi non transgenici in cui melanociti localizzare al derma nei follicoli piliferi. Con il transgene K14-Scf incorporato, la epidermide diventa pigmentato con la particolarità melanina pigmenti del pigmentoceppo degli animali 1. topi K14-SCF sullo sfondo genetico C57BL / 6 con il tipo selvatico segnalazione MC1R avere la pelle nerissima caratterizzata da livelli molto elevati di pigmento eumelanina. Non sorprendentemente, questi animali sono altamente resistente ai raggi UV. Al contrario, geneticamente abbinati K14-SCF C57BL / 6 animali che ospitano un mutante inattivo MC1R non hanno quasi alcun eumelanina nell&#39;epidermide. Invece, questi animali &quot;estensione&quot; (MC1R e / e) hanno una carnagione chiara della pelle causata da deposizione di pigmento feomelanina (Figura 1A) e sono molto più UV-sensitive 48-49. Composti farmacologici con proprietà chimiche che consentono la penetrazione nella pelle hanno mostrato di indurre potentemente eumelanina nell&#39;estensione (MC1R e / e) K14-Scf modello animale manipolando direttamente i livelli di cAMP in melanociti epidermici nella pelle. La melanina upregulation in questo modello è stato reported dall&#39;attivazione ciclasi 1 nonché della fosfodiesterasi 4 inibizione 35. In questo articolo, dimostriamo la preparazione e l&#39;applicazione topica di forskolina in estensione (MC1R e / e) animali K14-SCF quale modello umano UV-sensitive pelle chiara. Abbiamo dimostrato che l&#39;applicazione due volte al giorno del farmaco promuove melanizzazione accelerata, che oscuramento della pelle è dovuto alla epidermica deposizione di pigmento melanina e quella indotta melanina epidermica protegge contro le scottature solari UV-indotta attraverso la misurazione di &quot;dose minima eritematosa&quot; (MED) 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Estratto di Coleus Forskoli 20%</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n/a</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurano, USP</td><td>Butler Schein NCD</td><td>11695-6776-1</td><td>Dublino, OH, USA</td></tr><tr><td>Iniezione di xilazina</td><td>anased</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, Iowa, USA</td></tr><tr><td>Ketamina HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, USA</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Glicole propilenico</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, USA</td></tr><tr><td>Crema depilatoria, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Lampada Gg germicida UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Radiometro fotometro</td><td>Luce internazionale</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA, USA</td></tr><tr><td>Cromatometro</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr><tr><td>Elaboratore dati per Chromameter CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr></tbody></table>

induzione farmacologica di melanina epidermica e di protezione contro le scottature in un modello di topo umanizzato

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Correttezza di pelle, sensibilità UV e rischio di cancro della pelle tutti correla con la funzione fisiologica del recettore melanocortina 1, una proteina di segnalazione G s-accoppiato trova sulla superficie dei melanociti. MC1R stimola ciclasi e produzione di cAMP che, a sua volta, up-regola la produzione melanocitico di melanina nella pelle. Al fine di studiare i meccanismi attraverso i quali la segnalazione MC1R protegge la pelle contro i danni UV, questo studio si basa su un modello di topo con la &quot;pelle umanizzato&quot;, basato sulla espressione epidermica di fattore della cellula staminale (SCF). K14-SCF topi transgenici mantengono melanociti nel epidermide e quindi hanno la possibilità di depositare melanina nell&#39;epidermide. In questo modello animale, di tipo selvaggio risultati dello stato MC1R in robusto deposizione di nero eumelanina pigmento e un fenotipo con protezione UV. Al contrario, gli animali K14-SCF con difettoso segnalazione MC1R capacità presentano una pigmentazione rossa / bionda, molto poco eumelanina nella pelle eun fenotipo sensibile ai raggi ultravioletti. Ragionamento che eumelanina deposizione potrebbe essere rafforzato da agenti topici che imitano la segnalazione MC1R, abbiamo scoperto che l&#39;applicazione diretta di estratto forskolina alla pelle di MC1R-difettoso topi di carnagione chiara provocato induzione eumelanina robusto e protezione UV 1. Qui si descrive il metodo per la preparazione e l&#39;applicazione di un estratto di radice naturale forscolina contenente al K14-SCF topi con la pelle chiara e segnalare un metodo per misurare la sensibilità ai raggi UV determinando la dose minima eritematosa (MED). Utilizzando questo modello animale, è possibile studiare come induzione epidermica cAMP e melanizzazione della pelle influiscono risposte fisiologiche all&#39;esposizione UV.

C57BL / 6 topi sono stati generati su sfondi eumelanotic, pheomelanotic o amelanotici incorporano il transgene K14-SCF come descritto (Figura 1A). Coorti di estensione carnagione chiara (MC1R e / e, Tyr + / +) topi sono stati trattati per via topica con dosi due volte al giorno di entrambi i veicoli (70% etanolo, 30% glicole propilenico) o del 40% di estratto di Coleus forskohlii radice di greggio (80 micron per dose) per 5 giorni (Figura 2B). Eff...

Melanina epidermica è indotta mediante applicazione topica di forskolina in un modello murino di umano UV-sensitive pelle chiara. Manipolazione farmacologica dei livelli di cAMP nella pelle e dell&#39;epidermide oscuramento fortemente a proteggere contro l&#39;infiammazione UV-mediata (scottature), come misurato dalla dose minima eritematosa (MED) dosaggio.

Induzione farmacologica di melanina epidermica e di protezione contro le scottature in un modello di topo umanizzato

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la sensibilità ai raggi UV determinando la dose minima eritematosa in topi con pelle chiara pretrattati con quattro tipi di pelle. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando la pelle dorsale dei topi da irradiare mediante rasatura e ablazione. Successivamente vengono applicati trattamenti topici di forskolina sulla pelle dorsale.Successivamente, i topi vengono esposti a diverse dosi di irradiazione UV per determinare gli effetti del melone a quattro mediatori sull'infiammazione indotta da UV. I risultati ottenuti mostrano che l'applicazione topica di forlina aumenta in modo robusto la pigmentazione cutanea e che gli animali con me aumentata farmacologicamente sono resistenti ai raggi UV, come determinato dal MED. Questi sono studi di prova di concetto che dimostrano come sia possibile indurre farmacologicamente un'abbronzatura in un individuo incapace di abbronzarsi a causa di un difetto in un gene fondamentale dei melanociti chiamato recettore della melanocortina uno o MC1R. Nelle popolazioni umane, la perdita di funzione di MC1R si correla con sensibilità ai raggi UV, tendenza alle scottature solari e incapacità di abbronzarsi, con un rischio in età avanzata fino a quattro volte maggiore di melanoma.Abbiamo scelto lo scullin come farmaco per questi studi perché è in grado di aggirare un percorso di segnalazione del recettore melanocortinico difettoso e indurre i melanociti a credere di avere un corretto percorso di segnalazione MC1R, stimolando così la produzione di una grande quantità di melanina, che viene depositata nella pelle e protegge gli animali dalle radiazioni UV. Sebbene sappiamo che questo metodo fornisca informazioni sulla pelle che può e deve essere approfondita, potrebbe risultare importante anche per la prevenzione del cancro.Dato che sappiamo che la radiazione UV è il principale agente cancerogeno per la grande maggioranza dei tumori della pelle e che migliorare l'attuazione delle protezioni cutanee riduce il danno da UV, una volta eseguite iniezioni intraperitoneali. Assicurarsi di aspirare dopo il posizionamento dell'ago e prima dell'iniezione del contenuto per verificare che l'ago non abbia penetrato un vaso sanguigno, l'intestino o la vescica urinaria. Le iniezioni IP devono essere somministrate sul lato destro per evitare la milza. Dopo aver preparato l'estrazione di forlina e anestetizzato brevemente il topo con isoflurano.Inalazione, secondo il protocollo descritto, somministrare un'anestesia aggiuntiva all'animale mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Effettuare una compressione del dito del piede per verificare lo stato di sedazione. Utilizzare un rasoio elettrico dotato di testina chirurgica preparatoria da 0,25 millimetri per rasare il pelo dorsale.Utilizzare una crema depilatoria per rimuovere i peli corti. Per evitare scottature o altri danni alla pelle, utilizzare immediatamente tamponi di garza inumiditi con acqua per pulire delicatamente la pelle dorsale finché tutta la crema non sarà stata rimossa. Utilizzare tovaglioli di carta morbidi per asciugare l'animale prima di posizionarlo in una gabbia pulita su un tappetino riscaldante per il recupero.In generale, i topi devono essere anestetizzati brevemente per facilitare la somministrazione topica di forskolina o soluzioni di controllo mediante inalazione di isoflurano sotto cappa. Iniziare con un tovagliolo di carta saturo di isoflurano in un barattolo di vetro trasparente con lettiera saturo di isoflurano. Dopo aver fissato un filtro in nylon adatto, permeabile all'aria, anestetizzare il topo posizionandolo sopra il filtro per il tempo strettamente necessario a sopprimere i movimenti muscolari volontari, con l'animale sedato appoggiato su un tappetino assorbente pulito.Dopo aver eseguito una compressione del dito del piede, trasferire 400 microlitri di estratto grezzo di forlina sul dorso dell'animale lasciandolo cadere sulla pelle. Quindi utilizzare il lato della punta per spalmare l'estratto su tutta la superficie della pelle dorsale esposta. Rimettere il topo nella sua gabbia e osservarlo attentamente fino al risveglio dall'anestesia per prevenire la non pigmentazione.Gli effetti dell'AMP ciclico derivano da esperimenti di sensibilità UV confondenti. Interrompere tutti i trattamenti topici due giorni prima dell'esposizione a UV per eseguire la colorimetria riflessiva. Dopo aver anestetizzato brevemente il topo mediante inalazione di isoflurano.Calibrare un colorimetro posizionando la testa portatile sulla superficie bianca standard fornita con il dispositivo. Posizionare la testa di misurazione portatile a filo con la pelle dorsale dell'animale, assicurandosi che l'apertura rotonda di un centimetro quadrato sia completamente premuta sulla pelle. Effettuare almeno tre misurazioni separate in diverse aree della pelle dorsale.Calcolare il punteggio medio L, più o meno deviazione standard, per ogni animale e per ogni gruppo di trattamento. Per determinare la dose eritematosa minima (MED), ogni animale verrà esposto a una serie di dosi di UV. Iniziare preparando un pezzo di nastro occlusivo UV utilizzando una perforatrice robusta con un foro circolare di un centimetro quadrato per creare aperture nel nastro sopra ogni foro.Sul nastro. Applicare un piccolo pezzo di nastro facilmente staccabile che può essere rimosso. Per l'esposizione ai raggi UV, posizionare il nastro sulla superficie dorsale del topo anestetizzato.Se gli occhi dell'animale sono aperti, applicare lacrime artificiali per prevenire lesioni dovute alla disidratazione e all'esposizione ai raggi UV. Accendere la sorgente UV costituita da due lampade UVB con un picco di emissione di 313 nanometri e un intervallo compreso tra 280 e 370 nanometri. Lasciare che l'agnello si adatti a un'uscita UV costante, quindi utilizzare un fotometro UV dotato di sensore UVB per verificare l'emissione in base alla percentuale di trasmissione UV misurata dal fotometro; calcolare il tempo di esposizione UV per ciascuna dose desiderata.Ad esempio, l'emissione UVB delle lampade misura 2,4 milliwatt per centimetro quadrato. Pertanto, per somministrare cinque chilojoule per metro quadrato, la cute dovrebbe essere esposta a 208 secondi di radiazione UVB, come calcolato qui. Successivamente, posizionare l'animale sedato con la superficie ventrale rivolta verso il basso per garantire un'esposizione uniforme agli UV e somministrare in modo sequenziale la dose prescelta di radiazione.Rimuovere i piccoli pezzi di nastro che coprono i fori nel momento appropriato. Ad esempio, se la dose massima è di 40 chilojoule per metro quadrato, il topo rimarrà sotto la lampada per 27 minuti e 47 secondi, e il foro corrispondente a questa dose verrà esposto fin dall'inizio. Tuttavia, per la condizione di cinque chilojoule per metro quadrato, il nastro verrà rimosso dopo 208 secondi di esposizione.Trascorso il tempo previsto dopo l'esposizione ai raggi UV, rimuovere con attenzione il nastro e posizionare gli animali in un luogo caldo e tranquillo per favorire il risveglio dall'anestesia prima di riportarli nelle gabbie. Il valore della dose eritematosa minima (MED) corrisponde alla dose minima di UV in grado di provocare un'infiammazione definita come eritema e/o edema dell'intero cerchio di pelle esposto. Monitorare il topo per un periodo compreso tra 24 e 48 ore al fine di individuare aree circoscritte di eritema o edema nelle zone esposte ai raggi UV.A volte la peluria residua del primo taglio ostacola l'interpretazione del test MED, mascherando l'eritema o l'edema cutaneo sottostante; bagnare la pelle con etanolo al 70% rende la pelle molto più interpretabile. Documentare qualsiasi reperto cutaneo mediante fotografie, quindi riportare i topi presso la struttura per animali. In questi esperimenti, i topi C56 black six sono stati generati su linee genetiche anodiche o con background anodico, incorporate nel transgene del fattore di crescita delle cellule staminali K14, che consente ai topi di mantenere i melanociti nell'epidermide e, di conseguenza, di depositare melanina.Nell'epidermide mostrata qui, gruppi di topi con estensione della pelle chiara sono stati trattati per cinque giorni in via topica con dosi due volte al giorno di un veicolo o di un estratto grezzo al 40% di radice di colus fors coly. Gli effetti dei trattamenti topici sulla pigmentazione epidermica sono stati determinati sia mediante ispezione visiva che mediante immagini di colore riflettente. L'applicazione dell'estratto di radice è stata associata a un marcato scurimento epidermico nel contesto transgenico K14 SCF, ma non in animali geneticamente simili non transgenici, suggerendo che i melanociti epidermici interfollicolari devono essere presenti affinché la melanina indotta farmacologicamente possa essere depositata.Nell'epidermide, sebbene l'estratto radicale sia fortemente colorato a causa della presenza di fitochimici vegetali oltre alla galina quattro, l'oscuramento cutaneo non può essere attribuito esclusivamente a un effetto di colorazione del farmaco. Poiché animali non transgenici non mostrano oscuramento cutaneo con l'estratto radicale, come dimostrato qui applicandolo topicamente due volte al giorno, gli effetti sulla melanina del forskolin sono stati osservati già in due giorni. Sebbene l'oscuramento massimo fosse evidente dopo alcuni giorni in più, mostrato in questa figura dalla colorazione di Fontana-Mason e dalla colorazione della melanina su sezioni della pelle dorsale.Il grado di melanizzazione è dose-dipendente: animali trattati con quattro applicazioni cutanee al giorno per 15 giorni o due volte al giorno per cinque giorni mostrano quantità simili di scurimento della pelle. Inoltre, non sono stati osservati effetti tossici evidenti dopo l'esposizione a quattro applicazioni cutanee in entrambi i gruppi di trattamento. Pertanto, abbiamo concluso che il trattamento accelerato di cinque giorni promuove una melanizzazione sicura della cute dorsale in modo altrettanto efficace rispetto al trattamento standard una volta al giorno.Questa figura dimostra che, come misurato tramite test MED, l'induzione di melanina epidermica mediata da forline ha determinato una protezione UV profonda, mentre il valore medio di MED nei topi K 14 SCF transgenici trattati due volte al giorno per cinque giorni con il veicolo era di 5,0 ± 0,0 chilojoule per metro quadrato. Il valore medio di MED nei gruppi trattati con forgalina topica era superiore a 30,0 ± 0,0 chilojoule per metro quadrato. In effetti, una dose di 30,0 chilojoule per metro quadrato si è rivelata insufficiente per indurre eritema. In questo esperimento, utilizzando una dose standard di forza Glen, il valore medio di MED nei topi K 14 SCF transgenici trattati è stato di 50,0 ± 7,1 chilojoule per metro quadrato.È importante notare che il pretrattamento con fours Kline non ha influenzato la MED negli animali incapaci di produrre melanina, sia per l'assenza di melanociti epidermici mediati dal K14-SCF, sia per carenza di tirosinasi. Poiché le applicazioni di fours Kline sono state interrotte due giorni prima dell'esposizione ai raggi UV e non sono state riprese successivamente, si può concludere che gli effetti non pigmentari dei CAMP non hanno avuto un ruolo nei risultati relativi alla MED. Piuttosto, i dati suggeriscono che la melanina epidermica fosse il meccanismo attraverso cui forline ha indotto la protezione contro i raggi UV in questo modello.Una volta padroneggiata, questa tecnica consente una valutazione semplice e riproducibile della risposta della pigmentazione cutanea e della sensibilità ai raggi ultravioletti. Nell'applicazione su modelli animali, l'utilizzo del forland richiede solo pochi minuti al giorno e la maggior parte del tempo sperimentale è effettivamente dedicata alla radiazione UV e ai test MED. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la pelle torna gradualmente al suo aspetto chiaro di base per via farmacologica.L'induzione della melanina è molto simile alla risposta nain, in quanto la pelle rimarrà scura finché viene stimolata, ma poi l'abbronzatura scomparirà gradualmente dalla pelle nel corso delle successive settimane una volta rimosso lo stimolo.

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