Name: Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza luso di un solvente organico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Scopri un saggio di micropiastre a fluorescenza per valutare gli effetti del triclosan sulla degranulazione delle mastociti RBL-2H3 senza solventi organici. Questo metodo rapido e sensibile permette di quantificare il rilascio di beta-esosaminidasi.

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LMW e RHK sono supportati dalla Scuola di Dottorato di Scienze Biomediche e Ingegneria (GSBSE) di UMaine; RHK è stato supportato anche dal Maine Agricultural Experiment Station &amp; Forest. Ulteriori finanziamenti è stato fornito dal National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), il Maine Agricultural Experiment Station &amp; Foresta (Grant Numero ME08004-10, JAG), l&#39;Università del Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF concedere # 1.008.498) , e una ricerca Starter di Grant in Farmacologia / Tossicologia dalla fondazione PhRMA (JAG). Ringraziamo Drs. David Holowka e Barbara Baird per l&#39;antigene e cellule. Siamo grati a Hina Hashmi, Alejandro Velez, e Andrew Abovian aiuto con attrezzature e gli ordini. Questo è il Maine Agricultural Experiment Station &amp; Forest numero di pubblicazione 3311.

Nel 2004, Naal et al. 1 ha sviluppato un biosensore mastociti per la prova high-throughput di degranulazione. Si tratta di un test affidabile che abbiamo adattato per i nostri studi TCS e dettagliato in questo video. Prima della Naal et al. 1 assay, degranulazione mastocitaria era stata regolarmente valutata mediante β-hexosaminidase 59-61, ma questi primi metodi utilizzati fluorimetri in cui un campione è stata letta a volta. È importante sottolineare che, Naal et al. stabilito co...

I mastociti sono altamente granulato cellule immunitarie effettrici che fungono da mediatori chiave in asma, allergie, parassiti della difesa e della carcinogenesi 13-16. Essi risiedono in quasi ogni tessuto vascolarizzato 15, dove archiviare in modo sicuro i mediatori infiammatori e allergici in granuli citoplasmatici fino attivato per degranulano. Degranulazione è l&#39;esocitosi di granuli legati alla membrana, che provoca il rilascio di mediatori farmacologicamente attivi come istamina, triptasi e leucotrieni 15. Questo processo determina l&#39;avvio di tipo I reazioni di ipersensibilità che sono fondamentali per la difesa contro i parassiti di montaggio, nonché avviare le risposte allergiche, asma, e cancerogeni 15. Mastociti e basofili esprimono recettori FcεRI, i recettori ad alta affinità per le immunoglobuline E (IgE) 17. Esposizione ad un allergene o antigene provoca aggregazione di più IgE-bound recettori FcεRI 17, ed è questa so-chiamato &quot;reticolazione&quot; di IgE-bound recettori Fc che avvia il processo di degranulazione: una cascata di eventi tirosin-fosforilazione, l&#39;attivazione della fosfolipasi C, passaggio di calcio dai depositi interni e afflusso di calcio nelle cellule 18. Questo flusso di calcio è necessario per la degranulazione, e, inoltre, segnala granulo fusione con la membrana prima di causare granuli esocitosi 15. Sperimentalmente, un calcio ionoforo può essere usato per il calcio navetta direttamente attraverso la membrana cellulare 19, che bypassa essenzialmente tutto trasduzione del segnale passi prima della fase di afflusso di calcio 20, consentendo l&#39;identificazione di un bersaglio percorso da una sostanza tossica come a monte oa valle dei segnalazione di calcio 20. Degranulazione può essere misurata rapido ed efficace monitorando il rilascio di β-hexosaminidase nel supernatante cellulare, che viene rilasciata linearmente dai granuli accanto istamina 6, ma is molto più facile da rilevare con una semplice reazione enzima-substrato e di un lettore di micropiastre per saggiare il prodotto fluorescente. Questo saggio micropiastre, come dettagliato nella sezione del protocollo, si basa su un metodo robusto originariamente sviluppato da Naal et al. 1, che quantifica il clivaggio del substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil-N-acetil-β-D-glucosaminide da β- hexosaminidase. Abbiamo modificato il dosaggio per gli effetti di test di farmaci e sostanze tossiche, con triclosan evidenziato qui. Questo metodo quantifica affidabile degranulazione, è un&#39;alternativa economica a, per esempio, il flusso di metodi di rilevamento mediante citometria a base 21, e ha il potenziale per prestarsi bene a high-throughput screening di una vasta gamma di farmaci anti-allergia, così come immunotossico o prodotti chimici allergizzanti. Quest&#39;ultimo punto è particolarmente importante alla luce del 2007 National Research relazione del Consiglio &quot;Test di tossicità nel 21 ° secolo: una visione e di una Strattegia &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), che sostiene per lo sviluppo di test tossicologici high-throughput che utilizzano colture cellulari di ridurre l&#39;uso di animali da laboratorio costoso tradizionali come topi. Il protocollo sviluppato da degranulazione Naal et al. 1 e modificato da noi 2, utilizza la linea cellulare RBL-2H3, che è un modello ben accettato omologa ai mastociti mucosali umani o basofili 3-5. (Metodi per la coltura di cellule RBL-2H3 sono dettagliate nel Hutchinson et al. 22). Questo dosaggio può probabilmente essere adattata a qualsiasi tipo mastociti allegata. Triclosan (TCS) è un antimicrobico ad ampio spettro che è stato usato per più di 30 anni negli ospedali, per la cura personale e beni di consumo 23,24. La modalità di azione antimicrobica per la caratteristica di TCS è l&#39;inibizione della biosintesi di acidi grassi, probabilmente inibendo enoil-acilproteina carrier reduttasi 25,26. Si trova in tutto il mondo in una vasta gamma di prodotti di consumo come gel doccia, lozione per le mani, dentifricio, collutorio, e in saponi a concentrazioni fino allo 0,3% o 10 mm 24. L&#39;impiego diffuso di TCS ha portato a livelli rilevabili nell&#39;uomo 27-29 e nei corsi d&#39;acqua 30. Uno studio fatto da Allmyr et al. Ha dimostrato che 27 TCS e dei suoi metaboliti sono presenti sia nel plasma e latte di madri che allattano. È importante sottolineare che, TCS è facilmente assorbito nella pelle 31-37. Queckenberg et al. Trovato 37 ~ 10% l&#39;assorbimento di un ~ 70 mm TCS crema nella pelle umana entro 12 ore, con conseguente significativa concentrazione nella pelle, dove i mastociti risiedono. TCS è stato dimostrato clinicamente per la gestione della malattia allergica della pelle umana 7-11, ma il meccanismo con cui TCS allevia le malattie allergiche della pelle è rimasta sconosciuta 38. Usando la fluorescenza per micropiastre saggio detailed in questo video, abbiamo recentemente dimostrato che TCS, a concentrazioni a partire da 2 micron, attenua significativamente la funzione dei mastociti e degranulazione, fornendo una potenziale spiegazione per questi dati clinici 2. Oltre a fornire una spiegazione per questi dati clinici, i nostri risultati in Palmer et al. 2 suggeriscono che TCS rivolge molecole di segnalazione a valle del flusso di calcio. A causa dell&#39;importanza del calcio segnalazione in molti immunologico e altri processi biologici, TCS potrebbe potenzialmente avere effetti negativi su un&#39;ampia varietà di processi biologici necessari. Infatti, Udoji et al. Ha dimostrato che 39 TCS sopprime cellula attività umana natural killer litico, un altro importante funzione immunitaria innata. Oltre al suo potenziale come un aiuto terapeutico nella malattia allergica della pelle (o, al contrario, come un immunotossico), TCS può anche essere un distruttore endocrino 40-49. Così, una procedura chiara su come preparare questa sostanza chimica in soluzione is di interesse per i tossicologi. Poiché TCS è una piccola molecola idrofobica, veicoli organici vengono spesso utilizzati per renderla più solubile in acqua. Nella maggior parte degli studi di tossicità in cui TCS è stato testato, preparato è coinvolto dissoluzione in acqua con l&#39;ausilio di un solvente organico quale etanolo, acetone, o olio 2,50,51. Tuttavia, spesso questi solventi sono biologicamente attivi stessi, complicando in tal modo l&#39;interpretazione della sostanza chimica di prova dei dati 51. In effetti, secondo Rufli et al. 52 e altri 53, si raccomanda che le soluzioni di prova per esperimenti di tossicità acquatica sono preparati utilizzando metodi fisici sopra metodi chimici, a causa del potenziale di solventi chimici per creare artefatti tossicità. Abbiamo precedentemente dimostrato che gli STC dissolto in 0,24% di etanolo / acqua (vol / vol) e sottoposto a sonicazione per 30 min smorza RBL degranulazione mastocitaria 2. Etanolo a concentrazioni superiori a 0,24% è stato indicato per smorzare degrado mastocitinulation 54,55-esempi degli effetti potenzialmente confondenti di solventi organici in studi di tossicità. Non solo è importante considerare l&#39;azione di solventi sull&#39;organismo o cellule utilizzate per lo studio, ma anche che è importante monitorare l&#39;effetto di un solvente la parte chimica prova stessa. Ad esempio, Skaare et al. 51 hanno trovato che la dissoluzione TCS in polietilene glicole (che si trovano comunemente nei dentifrici e colluttori) indebolito gli effetti anti-batteriche e anti-placca in donne sane durante dissoluzione in oli causato una perdita completa della funzione. Pertanto, la capacità di diversi solventi per modulare tossico e di droga, tra cui TCS, gli effetti devono essere considerati nella progettazione di test. Uso di oli o additivi aromatici può interferire con gli effetti di STC in vari prodotti 50,51. Nel tentativo di eliminare la necessità di utilizzare solventi organici, abbiamo migliorato il nostro metodo di dissoluzione TCS 2 eliminando l&#39;uso di un sol organicasfogare. Nel presente protocollo, ci sciogliamo TCS granuli direttamente in tampone acquoso con il calore (≤ 50 ° C), e quindi verificare la concentrazione di questo stock TCS con spettrofotometria UV-Vis. Questi miglioramenti sono possibili perché TCS è solubile in acqua fino a 40 pM ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) e ha dimostrato di resistere alla degradazione quando viene riscaldata a 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Abbiamo anche il vantaggio di spettrofotometria UV-Vis, come TCS inoltre è conosciuto per assorbire fortemente a 280 nm 58 con un coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm 12. Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma efficace per dissolvere TCS granuli in un buffer senza l&#39;ausilio di un solvente organico, tra cui basso costo e rapida verificadi concentrazione, e descrive un potente saggio di micropiastre a fluorescenza per monitorare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti.

<table><tbody><tr><td> Celle RBL-2H3 </td><td>ATCC</td><<td>p align="center">CRL-2256</td><td> Le celle che abbiamo usato sono state un regalo, ma sono disponibili anche da ATCC </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Dovrebbe essere conservato in un ambiente a bassa umidità </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> Gentamycin Sulfate </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albumina, siero bovino </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; soluzione al 10%) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Baker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio </td><td>VWR</td><td>BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucosio </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Cristallo di cloruro di potassio </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio diirdato </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glycine </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-&beta;-D-glucosaminide (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4 <</td><td>p align="center">Wrap in foil &ndash; è sensibile alla luce </td></tr><tr><td> Anti-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> Il reagente ha una concentrazione di 1 mg/ml. Aliquot 25 &micro; l&nbsp; del reagente in provette per microcentrifuga separate e Parafilm. Conservare le aliquote a -20 &deg; C che non vengono utilizzati e conservare l'aliquota utilizzata a 2-8 gradi C per non più di 1 mese. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Dono del Dr. David Holowka e della Dr. Barbara Baird, Cornell University</td><td></td><td> Suggerisci: life technologies DNP-BSA catalog# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Calcium Ionophore A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> Lo ionoforo è stato ricavato da una polvere aggiungendo 400 &micro; l&nbsp; di DMSO fresco al 100% nella fiala ionoforo e viene mantenuto a -20 &deg; C Nota: abbiamo utilizzato con successo lo ionoforo oltre la data di scadenza di 3 mesi </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7 <</td><td>p align="center"> </td></tr><tr><td> Carbonato di sodio anidro </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Acido cloridrico </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Tampone di riferimento, pH 7 </td><td>VWR</td><td>BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> Tampone di riferimento, pH 10 </td><td>VWR</td><td>BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Tampone di riferimento, pH 4 </td><td>VWR</td><td>BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> Elettrodo pH soluzione di stoccaggio </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment:</td></tr><tr><td> Spettrofotometro DU 7500 </td><td>Beckmann</td><td>Non più venduto</td><td> </td></tr><tr><td> Lettore di piastre Synergy 2 Utilizza il software di raccolta e analisi dei dati delle micropiastre Gen5 </td><td>BioTek</td><td>Modulo S</td><td> </td></tr><tr><td> Ematocitometro </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp; 7 CER CALDO/AGITAZIONE 120 V Piastra riscaldante combinata/piastra di agitazione magnetica </td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Bagno d'acqua per coltura tissutale </td><td>VWR</td><td>Modello# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Cabina di sicurezza biologica per colture tissutali SafeGARD (cappa TC) </td><td>The Baker Company</td><td>Modello# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Incubatore per colture tissutali </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><td></td><td> Intervallo: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Modello# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> Misuratore di pH </td><td>Symphony/VWR</td><td>Modello# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Dispenser Combitip </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Ricette:</td></tr><tr><td> Tampone in acetato, pH 4.4 </td><td>Produci acido acetico 0.12 M e titola a pH 4.4 con 10 N NaOH. Si tratta di 5,3 ml di acido acetico glaciale in 1 L di acqua MilliQ: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml perché la densità del glaciale è 1,37 g/ml</td><td>Sterile Filtra in bottiglia di vetro autoclavata</td><td></td></tr><tr><td> Substrato (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Conservare a -20&deg; C Stock: 0,12 M in DMSO (46 mg in 1 ml di DMSO), caldo a 37 gradi C, vortice, sonicare 10 minuti in bagnomaria con acqua calda, vorticare di nuovo</td><td>Per ogni esperimento, preparare una soluzione fresca di substrato in tampone di acetato (diluizione 100x), per una concentrazione finale di 1,2 mM in tampone di acetato</td><td></td></tr><tr><td> Tampone di carbonato di glicina, pH 10 </td><td>26,7 g di glicina 47,1 g di carbonato di sodio anidro Aggiungere acqua deionizzata per 1 L, e regolare il pH a 10</td><td>Filtro sterile in flacone di vetro sterilizzato in autoclave</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes (2 L), pH 7.4 </td><td>135 mM NaCl: 15.78 g (o 270 ml di 1 M) 5 mM KCl: 10 ml di 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7,20 ml di stock 0,5 M 1 mM MgCl2: 4,00 ml di stock 0,5 M 5,6 mM di glucosio: 2,02 g (11,2 ml di 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml di stock 1 M Utilizzando HCl pH concentrato da ~9,7-7,4</td><td>Filtro sterile in flacone di vetro autoclavato</td><td></td></tr><tr><td> RBL Cell Media </td><td>Scongelare il siero fetale bovino (FBS, conservato a -20 &deg; C) per circa 4 ore in 37 gradi C bagnomaria Seguire la tecnica sterile standard Estrarre 1 L di terreno essenziale minimo (MEM) con L-glutammina (con Earle' Versare un po' di MEM per ottenere 800 ml di MEM, aggiungere 200 ml di FBS caldo Aggiungere 1 ml di antibiotico gentamicina solfato a 1 litro di terreno con pipetta sterile Utilizzare solo flaconi di terreno sterilizzati in autoclave e contrassegnati solo per l'uso in coltura cellulare.</td><td>Filtro sterile (0.2 mm) in bottiglia di vetro autoclavata</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiale plastico utilizzato:</td></tr><tr><td> 200 &micro; l&nbsp; Puntali per pipette sterili monouso con graduazioni in 96 rack </td><td>VWR</td><td>53509-009</td><td> polipropilene </td></tr><tr><td> 1,000 &micro; l&nbsp; Puntali per pipette aerosol sterili con HighRecovery </td><td>VWR</td><td>89003-420 <</td><td>p align="center">polietilene </td></tr><tr><td> 10 &micro; l&nbsp; </td><td>VWR</td><td>14217-704</td><td> polipropilene </td></tr><tr><td> Provette per microcentrifuga coniche monouso per forza G </td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td> polipropilene </td></tr><tr><td> Monouso/graduato/conico/sterile 50 ml&nbsp; provette da centrifuga con tappo a vite </td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td> polipropilene </td></tr><tr><td> Monouso/graduato/conico/sterile 15 ml&nbsp; provette da centrifuga con tappo a vite </td><td>VWR</td><td>21008-103</td><td> polipropilene </td></tr><tr><td> CELLSTAR Flask T-25 trattato per colture tissutali con tappo filtro </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> Pallone T-75 trattato per colture tissutali CELLSTAR con tappo filtro </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; Pipetta sierologica avvolta in carta/plastica </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; Pipetta sierologica avvolta in carta/plastica </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; Pipetta sierologica avvolta in carta/plastica </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; Pipetta sierologica in carta/plastica avvolta </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> 1 cuvette da 1 cm </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> CELLSTAR, Micropiastra 96W, Trattata per Coltura Tissutale, Nera, con Coperchio Piastra a 96 pozzetti </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> polistirene </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> Polipropilene/ polietilene </td></tr></tbody></table>

un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su rbl-2h3 mast cellule degranulazione: effetti del triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

I mastociti svolgono un ruolo importante nella malattia allergica e la difesa immunitaria contro i parassiti. Una volta attivato (ad esempio da un allergene), essi degranulano, un processo che comporta la esocitosi di mediatori allergici. Modulazione di degranulazione dei mastociti da farmaci e sostanze tossiche può avere effetti positivi o negativi sulla salute umana. Funzione mastociti è stato sezionato in dettaglio con l&#39;uso di ratto basofile mastociti leucemiche (RBL-2H3), un modello largamente accettato di mastociti mucosali umane 3-5. Mast componente cellulare dei granuli e il mediatore allergica β-hexosaminidase, che viene rilasciato linearmente in tandem con istamina dai mastociti 6, possono essere facilmente ed attendibilmente misurati tramite reazione con un substrato fluorogenico, cedendo misurabile intensità di fluorescenza in un saggio di micropiastra che è suscettibile di studi di high-throughput 1. Originariamente pubblicato da Naal et al. 1, abbiamo adattato questo dosaggio degranulazione per lo screening of farmaci e sostanze tossiche e dimostrare il suo uso qui. Triclosan è un agente ad ampio spettro antibatterico che è presente in molti prodotti di consumo ed è stato trovato per essere un aiuto terapeutico in malattie allergiche della pelle umana 7-11, anche se il meccanismo di questo effetto è sconosciuta. Qui mostriamo un saggio per l&#39;effetto del triclosan sulla degranulazione mastocitaria. Abbiamo recentemente dimostrato che il triclosan influenza fortemente la funzione delle cellule mast 2. Nel tentativo di evitare l&#39;impiego di un solvente organico, triclosan è disciolto direttamente in tampone acquoso con il calore e agitazione, e la concentrazione risultante viene confermata mediante spettrofotometria UV-Vis (usando 280 ε = 4,200 L / M / cm) 12. Questo protocollo ha il potenziale per essere usato con una varietà di prodotti chimici per determinare i loro effetti sulla degranulazione dei mastociti, e più in generale, il loro potenziale allergico.

Quando riscaldato a 50 ° C per 90 min, lo spettro di assorbanza UV-Vis per TCS produce un forte curva regolare tra ~ 260 e 300 nm, con un picco a 280 nm, come mostrato in Figura 1. Spettrofotometria UV-Vis è, quindi, un importante strumento che può essere utilizzata per calcolare la concentrazione, poiché il coefficiente di assorbimento molare pubblicato a 280 nm è 4,200 L / mol / cm 12. Abbiamo scoperto che TCS non cada dalla soluzione durante l&#39;arco di tempo l&#39;intero esperimento degranulazione, seguendo...

Degranulazione dei mastociti, il rilascio di mediatori allergici, è importante per l&#39;allergia, l&#39;asma, e la difesa parassita. Qui mostriamo tecniche 1 per la valutazione degli effetti di farmaci e sostanze tossiche sulla degranulazione, metodologia recentemente utilizzato per esporre il potente effetto inibitorio di agente antibatterico triclosan 2.

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare un saggio su micropiastra a fluorescenza per valutare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti. In questo protocollo, gli effetti inibitori dell'agente antimicrobico triclosan sono dimostrati senza l'uso di un solvente organico. Ciò si ottiene placcando prima i mastociti in una piastra a 96 pozzetti per consentirne l'adesione durante la notte e preparando il triclosan in una soluzione acquosa senza l'uso di solventi organici tramite riscaldamento.La concentrazione della soluzione di Trian viene quindi determinata rapidamente utilizzando la spettroscopia ultravioletta visibile. In una seconda fase, le cellule vengono stimolate con l'antigene IgE slash o con uno ionoforo di calcio in presenza o assenza di triano, che causerà il rilascio del marcatore di degranulazione dei mastociti beta esosaminidasi nel surnatante. Il rilascio di beta esosaminidasi nel surnatante cellulare viene quantificato utilizzando un substrato di beta esosaminidasi il cui prodotto fluorescente viene quantificato in un lettore di micropiastre.Per misurare l'effetto del triclosan o di altre sostanze chimiche in esame sulla degranu

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Immunologia e Infezioni

In questo video, descriviamo un metodo in vitro per valutare il potenziale allergico di un antigene di indurre la degranulazione dei basofili. La β-esosaminidasi viene utilizzata come indice del rilascio di mediatore chimico e l'attività enzimatica della β-esosaminidasi viene misurata utilizzando un substrato fluorogenico.

Saggio di rilascio dell'enzima mediatore umanizzato: un metodo immunochimico per lo screening del potenziale allergico dell'antigene del test monitorando la risposta alla degranulazione dei basofili in vitro

Questo video mostra un test colorimetrico per determinare l'attività di degranulazione dei mastociti. L'enzima rilasciato dai mastociti idrolizza il substrato e produce un prodotto colorato. L'attività di degranulazione dei mastociti è stata misurata come la percentuale di rilascio di enzimi all'esterno della cellula normalizzata con il contenuto totale di enzimi nella cellula.

Saggio di degranulazione dei mastociti per studiare l'effetto di una sostanza chimica bersaglio

Questo video illustra un test cellulare che coinvolge cellule di glioblastoma che esprimono recettori chemochine CXCR4. Il test impiega un colorante sensibile al calcio per misurare le variazioni di fluorescenza in seguito all'interazione con l'agente, offrendo informazioni sulle dinamiche di segnalazione cellulare.

Un saggio cellulare per l'identificazione di agenti che interagiscono con CXCR4

Questo video mostra un test per monitorare l'attivazione dei neutrofili e l'esocitosi dei granuli attraverso un test di degranulazione. Dopo l'attivazione da parte di composti proinfiammatori, i granuli citoplasmatici all'interno dei neutrofili contenenti gelatinasi si fondono con la membrana cellulare, scaricando il loro carico. La presenza di gelatinasi nel surnatante viene valutata attraverso l'idrolisi di un substrato di gelatina coniugato con fluorofori, confermando l'attivazione e la...

Un test di degranulazione per monitorare l'attivazione dei neutrofili e il rilascio di gelatinasi

L'indagine sulla migrazione precoce delle cellule endoteliali (EEC) è importante per comprendere la fisiopatologia di alcune malattie e per identificare potenzialmente nuove strategie per l'intervento terapeutico. Il seguente protocollo descrive le tecniche per valutare la migrazione cellulare che sono state adattate per lo studio della CEE.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare mastociti peritoneali murini. Inoltre descriviamo due protocolli per la loro caratterizzazione funzionale: un imaging fluorescente della concentrazione intracellulare di gratuito Ca2 + e un test di degranulazione basata sulla quantificazione colorimetrica della β-esosaminidasi rilasciato.

Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca2 +-imaging e degranulazione saggi

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Qui presentiamo il test di rilascio del mediatore, utilizzando una linea cellulare di leucemia basofila di ratto trasfetta con il recettore IgE umano, per simulare la degranulazione delle cellule effezionali tipicamente osservata nelle reazioni allergiche di tipo 1. Questo metodo studia l'attività biologica degli allergeni in modo altamente sensibile, riproducibile e personalizzabile.

Test di rilascio del mediatore umanizzato come lettura per la potenza degli allergeni

Qui, presentiamo un protocollo di test di chemiotassi migliorato. L'obiettivo di questo protocollo è quello di ridurre i passaggi e i costi dei metodi tradizionali di chemiotassi batterica e di servire come risorsa preziosa per la comprensione delle interazioni pianta-microbo.

Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali

Scopri un saggio di micropiastre a fluorescenza per valutare gli effetti del triclosan sulla degranulazione delle mastociti RBL-2H3 senza solventi organici. Questo metodo rapido e sensibile permette di quantificare il rilascio di beta-esosaminidasi.

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza luso di un solvente organico (Video) | JoVE Journal

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l'uso di un solvente organico

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