Name: Quantitative In vitro Assay misurare Adesione neutrofili attivati per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara a misurare l'adesione dei neutrofili attivati alle cellule endoteliali microvascolari umane primarie in condizioni statiche con questo saggio quantitativo in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento UCSF di Cura Anestesia e perioperatoria.

1. Placcatura e manutenzione di microvascolari cellule endoteliali <ol><li> Scongelare e far crescere le cellule endoteliali microvascolari secondo i produttori fornite istruzioni. In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in EGM-2 MV multimediale (Lonza), e si raccomanda che tutti gli esperimenti vengono eseguiti entro due settimane lo scongelamento per ridurre al minimo qualsiasi variazione dovuta al numero di passaggio. I nostri esperimenti con HMVEC-Lung vengono eseguiti tra passaggi 4-9. </li><li> Giorno 1: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize e sospendere nuovamente a 120.000 cellule per ml. Piastra 36.000 cellule (0,3 ml) per pozzetto in 48 pozzetti, piastra di coltura tissutale polistirene (s). Includere pozzi di HMVEC che non saranno incubate con neutrofili in modo da ottenere una lettura della fluorescenza di fondo. A meno che utilizzando piastre 48 pozzetti appositamente progettati per le analisi di fluorescenza, alternando righe o colonne ridurrà al minimo la contaminazione leggera da pozzi vicini. NOTA: Wells può essere pre-rivestito con poli-LYSIne, collagene o fibronectina. </li><li> 2 ° giorno: Aggiungi mezzi freschi. </li><li> Giorno 3: In contrasto di fase, confermano le cellule sono sane (cioè l&#39;aspetto &quot;acciottolato&quot; e poco detriti cellulari), e sono al 100% confluenti (Figura 1). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media ogni giorno fino a quando non sono pronti. </li><li> Una volta che i monostrati HMVEC sono pronti per il trattamento, lavare le cellule una volta con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e aggiungere 0,3 ml di fresca EGM-2 supporti MV o supporti contenenti agonisti infiammatoria nei rispettivi pozzetti. In questo protocollo il HMVEC-Lung state trattate con TNFa [100 ng / ml] (Peprotech, New Jersey) per 3 ore poiché questo è un attivatore ben descritto di EC 21. NOTA: Si raccomanda di tempo l&#39;esperimento in modo che le vostre cellule HMVEC attivati ​​(Passo 4.1) e calceina AM neutrofili etichettati (Passo 3.5) sono pronti per l&#39;uso, allo stesso tempo. Ci vogliono circa 2,5 ore per isolare ed etichettare neutrophils. </li></ol> 2. Isolamento dei neutrofili utilizzando Polymorphprep <ol><li> Isolare i neutrofili come descritto in precedenza 22, o con una soluzione pronta gradiente di densità di isolare granulociti polimorfonucleati dal sangue intero. Impiegando Polymorphprep seguendo il protocollo di Nuzzi et.al. risultati 2007 dei rendimenti di circa 2-3 x 10 6 neutrofili per ml di sangue intero 23. NOTA: per evitare un eccessivo lisi degli eritrociti, una sedimentazione destrano per rimuovere i globuli rossi possono essere svolte prima di centrifugazione in gradiente di densità 24. </li><li> Portare la soluzione gradiente di densità Polymorphprep a RT. </li><li> Raccogliere 30 ml di sangue intero da un volontario umano sano in presenza di un anticoagulante come l&#39;eparina, citrato o EDTA. Il sangue deve essere utilizzato entro 2 ore, e mantenuta tra 18-22 ° C. </li><li> Strato 5 ml di sangue intero in 5 ml della soluzione di gradiente di densità in un tubo da 15 ml (Figura 2A). Evitare di alterare i volumi di sangue e la soluzione gradiente di densità in quanto ciò potrebbe cambiare le successive condizioni di centrifugazione. </li><li> Centrifugare a 450 xg per 30 minuti a 18-22 ° C. Assicurati di accelerare lentamente su e giù per la centrifuga (cioè spegnere il freno centrifuga), e bilanciare i tubi bene per evitare che le vibrazioni per contribuire a ridurre l&#39;attivazione dei neutrofili e prevenire la miscelazione di strati. Tempi più lunghi di centrifugazione o di forza centrifuga maggiore si tradurrà nello strato leucocitaria inferiore, che contiene i neutrofili, a migrare più in basso verso i globuli rossi pellet. </li><li> Aspirare il plasma e leucociti banda superiore contenente PBMC di impedire la contaminazione dello strato contenente neutrofili (Figura 2B). </li><li> Utilizzare un 1-2 ml pipetta sierologica per rimuovere lo strato inferiore contenente leucociti neutrofili. Unire i livelli di neutrofili in 30 ml di PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) in 50 mltubo conico. </li><li> Portare il volume a 50 ml con PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugare a 450 xg per 10 minuti a 18-22 ° C. </li></ol> Nota: I punti 2.9 e 2.10 sono opzionali, ma altamente raccomandato. <ol start="9"><li> Aspirare il surnatante. Risospendere i neutrofili in 8 ml di acqua sterile per 30 sec per la lisi dei globuli rossi, aggiungere immediatamente la sospensione di cellule per 2 ml di PBS 5x (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e mescolare delicatamente con le mani. Non incubare le cellule in acqua per più di 30 secondi dal momento significativo morte neutrofili può verificarsi. </li><li> Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C. </li><li> Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugare nuovamente a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C. </li><li> Risospendere i neutrofili in 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo) e contare le cellule vive usando il blu tripanotingere metodo di esclusione. Evitare periodi prolungati di densità cellulari maggiori di 5 x 10 6 per ml poiché questo può causare l&#39;attivazione dei neutrofili. </li></ol> 3. Neutrofili Etichettatura con Calcein AM <ol><li> 6 x 10 5 neutrofili sono utilizzati per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. </li><li> Dopo il conteggio, trasferire le cellule risospese ad una provetta da 50 ml e diluire i neutrofili a 2-4 x 10 6 cellule per ml con fenolo aneritro RPMI-1640. </li><li> Aggiungi calceina AM soluzione madre di 3 micron (cioè 2,98 ml di calceina AM madre (1 mg / ml) per ml di media) e mescolare bene muovendo delicatamente il tubo. Superiore a 5 micron calceina AM si tradurrà in perdite dai neutrofili. Nota: non fluorescente calceina AM viene scissa nelle cellule dalle esterasi endogene per produrre la molecola altamente fluorescente calceina (vale a dire le cellule morte non fluorescenza). </li><li> Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare for 30 min a 37 ° C al buio. Nota: i tempi di incubazione più lunghi possono tradursi in maggiore calceina essere liberata dai neutrofili nel corso del saggio di adesione. </li><li> Centrifugare a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C, e lavare i neutrofili 2x con 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C). Dopo risospendere le cellule per il secondo lavaggio, prima passare i neutrofili con un filtro sterile 40 pM per eliminare grumi e quindi si centrifuga di nuovo a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C. </li><li> Risospendere i neutrofili in RPMI 1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C) a 2 x 10 6 neutrofili per ml. </li></ol> 4. Neutrofili Binding Assay <ol><li> Lavare i monostrati HMVEC 3x con 0,5 ml di sterilizzata per filtrazione (0,22 micron) RPMI 1640 (senza rosso fenolo) contenente il 3% di BSA per pozzetto. </li><li> Aspirare i media e aggiungere 6 x 10 5 neutrofili calceina-etichettati (0,3 ml di sospensione cellulare), Oppure 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) senza neutrofili, nei rispettivi pozzetti della 48 pozzetti. Nota: Questo è l&#39;equivalente di 8 x 10 5 neutrofili per cm 2. </li><li> Incubare per 20 min a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Totale dei neutrofili Fluorescenza (PRE lavaggio): Misurare l&#39;intensità di fluorescenza di ciascun bene con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d&#39;onda di 520 nm (fluoresceina filtro impostato) in una FLUOstar, o equivalente, spettrofotometro di emissione. Eseguire questo passaggio appena prima del punto finale incubazione Nota: In questo protocollo, calceina eccitazione e rilevamento della luce emessa state eseguite dalla sommità dei pozzi scoperti, tuttavia, entrambi possono essere eseguite anche dal fondo dei pozzetti.. </li><li> Lavare i pozzetti contenenti monostrati HMVEC e neutrofili 5x con 0,5 ml per pozzetto di PBS (w / Ca 2 + e Mg 2 +). Rimuovere il supporto e lavaggiinvertendo la piastra, e picchiettando delicatamente su carta assorbente per eliminare il liquido rimasto. </li><li> Aggiungi posteriore 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) per pozzetto. </li><li> Aderente neutrofili Fluorescenza POST (lavaggio): Misurare l&#39;intensità di fluorescenza di ogni nonché al punto 4.4. </li><li> Determinare l&#39;aderenza per cento e l&#39;adesione relativa per bene: </li></ol> Nota: In questa fase, le immagini dei neutrofili calceina-etichettati possono essere ottenuti utilizzando un microscopio capace fluorescenza dotato di filtri fluoresceina standard. Le immagini in figura 4 sono stati ottenuti su una Olympus IX51 microscopio invertito dotato di una fotocamera 2000R Retiga (Q Imaging) con Q-Capture Software Pro7 (Q Imaging).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche per una neutrofili di successo / endoteliale microvascolare saggio di adesione cellulare sono: 1) Uso di basso numero di passaggio (&lt;9), cellule endoteliali sane; 2) Il mantenimento dei neutrofili isolati a bassa densità (cioè &lt;5 x 10 6 cellule / ml) e il loro utilizzo in due ore di isolamento, e 3) il lavaggio Fastidious dei neutrofili calceina AM-etichettati e l&#39;uso dei neutrofili calceina AM-etichettati in modo tempestivo per ridurre al minimo la contaminazione CE e ...

Poiché l&#39;endotelio vascolare è in contatto diretto con il sangue circolante, esso è sitato ad iniziare una risposta infiammatoria rapido durante infezioni o lesioni. Le cellule endoteliali (EC) recettori di pattern recognition espresso che riconoscono una varietà di componenti batteriche conservati e molecole pericolo, e recettori per Host mediatori infiammatori, come TNFa. Attivazione di questi recettori induce EC per secernere citochine (es IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e per upregulate molecole di adesione (ad esempio E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) alla loro superficie cellulare 1 , 2. Queste molecole tutto facilitano la localizzazione dei leucociti ai siti di infezione e lesioni per chiarire l&#39;host di agenti infettivi e avviare la riparazione tissutale 3,4. La risposta dei neutrofili all&#39;infezione comporta un&#39;interazione ben coordinato tra l&#39;endotelio vascolare e la risposta neutrofili. All&#39;attivazione EC, IL-8 è secreto e forma un gradiente intravascolare sull&#39;endotelio che permette di neutrofili casa al sito di infezione o lesioni 5,6. E / P-selectine mediata neutrofili cattura e rotolare attraverso le associazioni relativamente deboli con glycomolecules sulla superficie cellulare dei neutrofili. Queste interazioni, insieme con IL-8 legame ai suoi recettori cognate, facilitano il robusto, attaccamento integrina-mediata ed eventuale arresto dei neutrofili sulla superficie delle cellule endoteliali 7-10. Dopo l&#39;arresto, i neutrofili possono migrare fuori della vascolarizzazione ai siti specifici di infezione di eliminare direttamente i patogeni, generare neutrofili trappole extracellulari per prevenire la diffusione di agenti patogeni, promuovere la guarigione delle ferite e rilasciare fattori aggiuntivi che reclutano leucociti altri come monociti, macrofagi e dendritiche cellule 11-17. Descritte nella presente relazione è un metodo in vitro per quantificare l&#39;adesione dei neutrofili alle microVascular I CE dopo l&#39;attivazione da parte del mediatore infiammatorio ospite TNFa. Questo test è stato progettato per valutare l&#39;attivazione delle cellule endoteliali, e non neutrofili. Neutrofili umani primari sono stato isolato utilizzando separazione gradiente di densità, e sono quindi etichettati con calceina acetossimetil (AM). Esterasi all&#39;interno delle cellule in diretta idrolizzano calceina AM alla molecola calceina altamente fluorescente con una eccitazione di 492-495 nm ed emissione di 513-516 nm 18. I neutrofili fluorescenza marcata vengono poi incubate con monostrati CE, e neutrofili non aderenti sono successivamente rimossi. La fluorescenza dei rimanenti, neutrofili legato viene quindi misurata mediante uno spettrofotometro a fluorescenza, e calcolata come percentuale del totale dei neutrofili ingresso fluorescenza per pozzetto. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che i neutrofili calceina-etichettati vincolati utilizzati in spettrofotometria possono essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per dare una lettura più qualitativa di ac CEtivazione. Dal momento che questo test viene eseguito in condizioni statiche, saranno valutati solo gli eventi molto iniziali che si verificano nella adesione cascata neutrofili. Ciò è confermato in questo rapporto utilizzando anticorpi bloccanti E-selectina per dimostrare che l&#39;adesione dei neutrofili alle TNFa-trattato polmone umano microvascolare CE (HMVEC-Lung) monostrati si riduce drasticamente quando l&#39;interazione con la E-selectina è perturbato. Oltre a TNFa, abbiamo utilizzato con successo questo test per determinare l&#39;entità della vena ombelicale CE attivazione umana (HUVEC) dal recettore Toll-like mezzo agonisti lipoproteine ​​peptidoglicano-associato (PAL), murein lipoproteina (MLP) e Pam3Cys e attivazione HMVEC-Lung da Pam3Cys 19,20. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo test con inibitori delle chinasi e dopo knockdown RNAi-mediata di superficie e proteine ​​citoplasmatiche in HMVEC-Lung, suggerendo che questa metodologia è compatibile con una varietà di biochimica e screening saggi 20. In sintesi, questo saggio fornisce un facile da usare, modo riproducibile, più funzionale per accedere alla misura dell&#39;attivazione CE da mediatori infiammatori in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali a 48 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (senza rosso fenolo)</td><td>Impianto di coltura cellulare UCSF</td><td>CCFAL001</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>D-PBS (senza Ca2+ e Mg2+ e rosso fenolo)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (senza rosso fenolo)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td><td>(0,995 mM) stock soln</td></tr><tr><td>Trypan Soluzione Blu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtri M</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Spettrofotometro FLUOstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative<em&gt; in vitro</em&gt; assay misurare adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

L&#39;endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria. Durante la fase acuta dell&#39;infiammazione, cellule endoteliali (EC) sono attivati ​​da mediatori ospitanti o direttamente da componenti microbici conservati o molecole pericolo ospite-derivati. Attivati ​​ecs esprimere citochine, chemochine e molecole di adesione che mobilitano, attivano e mantengono leucociti nel sito di infezione o lesioni. Neutrofili sono i primi ad arrivare leucociti, e aderire alla endotelio attraverso una varietà di molecole di adesione presenti sulle superfici di entrambe le celle. Le principali funzioni di neutrofili sono eliminare direttamente minacce microbiche, promuovere l&#39;assunzione di altri leucociti attraverso il rilascio di fattori aggiuntivi, e avviare riparazione della ferita. Pertanto, il loro reclutamento e attaccamento alla endotelio è un passaggio fondamentale nell&#39;iniziazione della risposta infiammatoria. In questo rapporto, descriviamo un test di adesione in vitro usando neutrofilicalceina AM-etichettato neutrofili umani primari per quantificare il grado di attivazione delle cellule endoteliali microvascolari in condizioni statiche. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che gli stessi campioni quantizzati mediante spettrofotometria a fluorescenza possono anche essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per una valutazione più qualitativa di legame neutrofili.

Per ottenere risultati affidabili e riproducibili usando un saggio di legame neutrofili, è essenziale che la salute e la confluenza delle cellule endoteliali microvascolari sono ottimali nel giorno del saggio, come illustrato con HMVEC-Lung in Figura 1. Inoltre, è indispensabile che passaggio basso numero microvascolare EC vengono utilizzati (cioè meno di 9 brani), e di conseguenza, si consiglia di eseguire tutti gli esperimenti entro due settimane di scongelamento. La salute dei neutrofili è i...

L&#39;adesione dei neutrofili all&#39;endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell&#39;ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette la<em&gt; In vitro</em&gt; Quantificazione di neutrofilo umana primaria legame alle cellule endoteliali attivate da mediatori infiammatori in condizioni statiche.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il grado di attivazione infiammatoria delle cellule endoteliali microvascolari quantificando il numero relativo di neutrofili che aderiscono alle cellule endoteliali in vitro in condizioni statiche. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto monociti confluenti sani di cellule endoteliali microvascolari con lo stimolo sperimentale desiderato durante il secondo passaggio. I neutrofili provenienti da volontari umani sani vengono isolati e quindi marcati con calcio am.Successivamente, i neutrofili marcati vengono aggiunti alle cellule endoteliali e lasciati aderire per 20 minuti, durante i quali viene effettuata una misurazione preliminare mediante spettrofotometria a fluorescenza. Nell'ultima fase, i neutrofili non aderenti vengono rimossi con un lavaggio, dopo il quale si ottiene una misurazione post-lavaggio. Infine, si può determinare la percentuale e l'adesione relativa dei neutrofili marcati al calcio ai monociti cellulari endoteliali in ciascuna condizione di trattamento.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia infiammatoria umana, poiché consente di determinare il grado relativo di attivazione infiammatoria dell'endotelio microvascolare in diverse condizioni. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato come strumento per lo studio di processi patologici umani a livello endoteliale che coinvolgono il legame dei leucociti all'endotelio microvascolare. Nel giorno del saggio, utilizzare la microscopia a contrasto di fase per verificare che le cellule presentino un aspetto a selciato sano, con scarsa presenza di detriti cellulari e che siano confluenti al 100%.Una volta che i monociti di HM VEC sono pronti per il trattamento, lavare le cellule una volta con HBSS e quindi aggiungere 0,3 millilitri di mezzo di crescita fresco per cellule endoteliali microvascolari, con o senza un agonista infiammatorio, nei pozzetti appropriati. Qui, i HM VEC polmonari vengono trattati con TNF alpha per tre ore per isolare i neutrofili. Utilizzando prima Polymorph prep, portare la soluzione del gradiente di densità a temperatura ambiente. Successivamente, dopo aver prelevato 30 millilitri di sangue intero da un volontario umano sano in presenza di un anticoagulante, stratificare 5 millilitri di sangue su 5 millilitri di Polymorph prep in un tubo conico da 15 millilitri.Separare il sangue intero per 30 minuti a 450 ×g e a una temperatura di 18-22 °C con la centrifuga in funzione, assicurandosi che i tubi siano ben bilanciati. Quindi aspirare gli strati gialli contenenti il plasma e le PBMC per evitare contaminazione dello strato neutrofilo rosa opaco. Per rimuovere i neutrofili, aspirare lo strato neutrofilo con una pipetta sierologica da uno a due millilitri, ruotando lentamente sia la pipetta che il tubo.Prelevare i neutrofili da più provette e trasferirli in una provetta conica da 50 millilitri contenente 30 millilitri di PBS privo di calcio e magnesio. Portare il volume a 50 millilitri aggiungendo ulteriore PBS privo di calcio e magnesio. Dopo aver centrifugato le cellule, aspirare il sopranatante e quindi risospendere.Sospendere i neutrofili in otto millilitri di acqua sterile per lisare i globuli rossi dopo 30 secondi. Aggiungere rapidamente gli otto millilitri di sospensione cellulare a due millilitri di PBS privo di calcio e magnesio 5x, seguito da un'accurata miscelazione. Dopo aver centrifugato le cellule, lavarle nuovamente una volta in PBS privo di calcio e magnesio, quindi risospendere il pellet in 10 millilitri di RPMI 1640 senza fenolo rosso e contare le cellule vitali mediante esclusione del blu di trian.Dopo il conteggio, trasferire le cellule ri-sospese in un tubo conico da 50 millilitri e diluire i neutrofili con due-quattro milioni di cellule per millilitro in RPMI 1640 senza rosso fenolo. Quindi aggiungere la soluzione lavorativa di calcio appena preparata fino a una concentrazione di tre micromolari alle cellule. Mescolare la sospensione cellulare capovolgendo delicatamente il tubo diverse volte, quindi incubare il tubo coperto con stagnola a 37 gradi Celsius.Dopo 30 minuti, centrifugare i neutrofili marcati e quindi lavare il pellet due volte in 10 millilitri di RPMI 1640 senza rosso fenolo a 37 gradi Celsius, facendo passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile da 40 micron per rimuovere eventuali aggregati prima della seconda centrifugazione. Risospendere i neutrofili in 10 millilitri di RPMI 1640 senza rosso fenolo a 37 gradi Celsius.RP MI 1640 senza rosso fenolo. Dopo aver contato nuovamente le cellule, diluirle a 2 milioni di cellule per millilitro. Lavare ora i monociti HM vec tre volte con 0,5 millilitri di RP MI 1640 privo di rosso fenolo, filtrato con filtro da 0,22 micron e sterilizzato, contenente il 3% di BSA per pozzetto; dopo il terzo lavaggio, aspirare il mezzo e aggiungere 600.000 neutrofili marcati al calcio in 0,3 millilitri di sospensione cellulare, oppure 0,3 millilitri di RP MI 1640 senza rosso fenolo senza neutrofili, nei pozzetti appropriati della piastra a 48 pozzetti. Incubare successivamente le colture in co-coltura per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica; quindi, subito prima della fine del periodo di incubazione, misurare l'intensità di fluorescenza di ogni pozzetto mediante spettrofotometro, con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nanometri.Quindi capovolgere la piastra per rimuovere il mezzo e tamponare delicatamente su carta assorbente per eliminare qualsiasi liquido residuo. Lavare i pozzetti contenenti i monociti hm ve e i neutrofili cinque volte con 0,5 millimetri per pozzetto di PBS con calcio e magnesio. Rimuovere il PBS nello stesso modo ogni volta.Ricambiare il mezzo nei pozzetti aggiungendo 0,3 millilitri di RPMI 1640 privo di rosso fenolo per pozzetto, quindi misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun pozzetto come appena illustrato. Infine, utilizzando queste formule, determinare la percentuale di adesione e l'adesione relativa per pozzetto. Per ottenere risultati affidabili e riproducibili mediante un saggio di legame dei neutrofili, è essenziale che lo stato di salute e la confluenza dei monociti di cellule endoteliali microvascolari siano ottimali nel giorno del saggio. Notare l'aspetto a selciato e la confluenza totale dei monociti su uno spettrofotometro Fluor star Optima.Ad esempio, osservare che l'OD di fluorescenza a 520 nanometri rientra nell'intervallo lineare quando vengono analizzati da 10.000 a 1 milione di neutrofili marcati. In modo interessante, all'aumentare del numero di neutrofili aggiunti a monociti polmonari di HM VEC trattati con un agonista infiammatorio, la percentuale di adesione aumenta. È stato precedentemente dimostrato che la MAP chinasi p38 è necessaria per l'espressione di E-selettina.In cellule endoteliali umane trattate con TNF-alfa e la sua inibizione riduce il numero di neutrofili aderenti per dimostrare che il numero di neutrofili aggiunti ai pozzetti è arbitrario, purché il numero di cellule utilizzate rientri nel range lineare dello spettrofotometro. Qui viene mostrato un saggio di adesione dei neutrofili con cellule polmonari HMVEC trattate con TNF-alfa in assenza o presenza dell'inibitore della chinasi p38 MAPK BIRB 796. Questi risultati mostrano che la riduzione relativa del legame dei neutrofili dopo l'inibizione della p38 MAPK è simile.Indipendentemente dal numero di neutrofili per pozzetto, la lectina è espressa sulla superficie delle cellule endoteliali dopo il trattamento con TNF-alfa e cattura i neutrofili dalla vascolatura attraverso interazioni elettrostatiche con le molecole glicidiche presenti sulla superficie dei neutrofili. Come mostrato in questo grafico, la preincubazione delle cellule endoteliali attivate con TNF-alfa con un anticorpo contro l'E-selettina determina una riduzione del circa 75% della loro capacità di legare i neutrofili. A dimostrazione che questo saggio valuta principalmente i primi eventi della cascata di adesione dei neutrofili, in queste immagini sono mostrati neutrofili marcati con calcio legati a monocapillari di cellule endoteliali polmonari HMVEC non trattate e trattate con TNF-alfa, preincubate con IgG di controllo o con E-selettina.Gli anticorpi policlonali sono mostrati in immagini di microscopia ottica traslucida in questa colonna, mentre le immagini a fluorescenza dello stesso campo di riferimento, ottenute utilizzando un set di filtri per fluoresceina, sono mostrate in queste pozzette. Immagini rappresentative della fluorescenza totale dei neutrofili prima del lavaggio con PBS, come appena illustrato, sono mostrate in queste pozzette. Immagini rappresentative della fluorescenza dei neutrofili aderenti dopo il lavaggio con PBS, come appena illustrato, sono mostrate.Notare l'aumento dell'adesione dopo il trattamento con TN FFA che viene ridotto in presenza di un anticorpo policlonale contro la s-selectina. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale utilizzare cellule endoteliali sane con un basso numero di passaggi e impiegare il sangue intero e i neutrofili isolati entro due ore dalla raccolta.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

In questo video, dimostriamo un test che utilizza la microscopia a fluorescenza per rilevare l'adesione delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili (NET). Nei pozzetti di prova, c'è un notevole aumento del numero di cellule tumorali marcate in fluorescenza che aderiscono ai NET, mentre i pozzetti trattati con DNasi mostrano una ridotta adesione delle cellule tumorali ai NET.

Saggio di adesione in vitro per rilevare l'aderenza delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili

La migrazione transeteliale neutrofila in risposta all'infezione batterica della mucosa contribuisce alla lesione epiteliale e alla malattia clinica. È stato sviluppato un modello in vitro che combina agenti patogeni, neutrofili umani e strati cellulari epiteliali umani polarizzati coltivati su filtri transwell per facilitare le indagini verso lo svelamento dei meccanismi molecolari che orchestrano questo fenomeno.

In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Riportiamo un metodo in vitro che permette la quantificazione del numero effettivo di cellule adesive all'interno di un monostrato di cellule endoteliali.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Impara a misurare l'adesione dei neutrofili attivati alle cellule endoteliali microvascolari umane primarie in condizioni statiche con questo saggio quantitativo in vitro.

Quantitative In vitro Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche (Video) | JoVE Journal

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