Name: Quantitative In vitro Assay misurare Adesione neutrofili attivati per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara a misurare l'adesione dei neutrofili attivati alle cellule endoteliali microvascolari umane primarie in condizioni statiche con questo saggio quantitativo in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento UCSF di Cura Anestesia e perioperatoria.

1. Placcatura e manutenzione di microvascolari cellule endoteliali <ol><li> Scongelare e far crescere le cellule endoteliali microvascolari secondo i produttori fornite istruzioni. In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in EGM-2 MV multimediale (Lonza), e si raccomanda che tutti gli esperimenti vengono eseguiti entro due settimane lo scongelamento per ridurre al minimo qualsiasi variazione dovuta al numero di passaggio. I nostri esperimenti con HMVEC-Lung vengono eseguiti tra passaggi 4-9. </li><li> Giorno 1: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize e sospendere nuovamente a 120.000 cellule per ml. Piastra 36.000 cellule (0,3 ml) per pozzetto in 48 pozzetti, piastra di coltura tissutale polistirene (s). Includere pozzi di HMVEC che non saranno incubate con neutrofili in modo da ottenere una lettura della fluorescenza di fondo. A meno che utilizzando piastre 48 pozzetti appositamente progettati per le analisi di fluorescenza, alternando righe o colonne ridurrà al minimo la contaminazione leggera da pozzi vicini. NOTA: Wells può essere pre-rivestito con poli-LYSIne, collagene o fibronectina. </li><li> 2 ° giorno: Aggiungi mezzi freschi. </li><li> Giorno 3: In contrasto di fase, confermano le cellule sono sane (cioè l&#39;aspetto &quot;acciottolato&quot; e poco detriti cellulari), e sono al 100% confluenti (Figura 1). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media ogni giorno fino a quando non sono pronti. </li><li> Una volta che i monostrati HMVEC sono pronti per il trattamento, lavare le cellule una volta con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e aggiungere 0,3 ml di fresca EGM-2 supporti MV o supporti contenenti agonisti infiammatoria nei rispettivi pozzetti. In questo protocollo il HMVEC-Lung state trattate con TNFa [100 ng / ml] (Peprotech, New Jersey) per 3 ore poiché questo è un attivatore ben descritto di EC 21. NOTA: Si raccomanda di tempo l&#39;esperimento in modo che le vostre cellule HMVEC attivati ​​(Passo 4.1) e calceina AM neutrofili etichettati (Passo 3.5) sono pronti per l&#39;uso, allo stesso tempo. Ci vogliono circa 2,5 ore per isolare ed etichettare neutrophils. </li></ol> 2. Isolamento dei neutrofili utilizzando Polymorphprep <ol><li> Isolare i neutrofili come descritto in precedenza 22, o con una soluzione pronta gradiente di densità di isolare granulociti polimorfonucleati dal sangue intero. Impiegando Polymorphprep seguendo il protocollo di Nuzzi et.al. risultati 2007 dei rendimenti di circa 2-3 x 10 6 neutrofili per ml di sangue intero 23. NOTA: per evitare un eccessivo lisi degli eritrociti, una sedimentazione destrano per rimuovere i globuli rossi possono essere svolte prima di centrifugazione in gradiente di densità 24. </li><li> Portare la soluzione gradiente di densità Polymorphprep a RT. </li><li> Raccogliere 30 ml di sangue intero da un volontario umano sano in presenza di un anticoagulante come l&#39;eparina, citrato o EDTA. Il sangue deve essere utilizzato entro 2 ore, e mantenuta tra 18-22 ° C. </li><li> Strato 5 ml di sangue intero in 5 ml della soluzione di gradiente di densità in un tubo da 15 ml (Figura 2A). Evitare di alterare i volumi di sangue e la soluzione gradiente di densità in quanto ciò potrebbe cambiare le successive condizioni di centrifugazione. </li><li> Centrifugare a 450 xg per 30 minuti a 18-22 ° C. Assicurati di accelerare lentamente su e giù per la centrifuga (cioè spegnere il freno centrifuga), e bilanciare i tubi bene per evitare che le vibrazioni per contribuire a ridurre l&#39;attivazione dei neutrofili e prevenire la miscelazione di strati. Tempi più lunghi di centrifugazione o di forza centrifuga maggiore si tradurrà nello strato leucocitaria inferiore, che contiene i neutrofili, a migrare più in basso verso i globuli rossi pellet. </li><li> Aspirare il plasma e leucociti banda superiore contenente PBMC di impedire la contaminazione dello strato contenente neutrofili (Figura 2B). </li><li> Utilizzare un 1-2 ml pipetta sierologica per rimuovere lo strato inferiore contenente leucociti neutrofili. Unire i livelli di neutrofili in 30 ml di PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) in 50 mltubo conico. </li><li> Portare il volume a 50 ml con PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugare a 450 xg per 10 minuti a 18-22 ° C. </li></ol> Nota: I punti 2.9 e 2.10 sono opzionali, ma altamente raccomandato. <ol start="9"><li> Aspirare il surnatante. Risospendere i neutrofili in 8 ml di acqua sterile per 30 sec per la lisi dei globuli rossi, aggiungere immediatamente la sospensione di cellule per 2 ml di PBS 5x (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e mescolare delicatamente con le mani. Non incubare le cellule in acqua per più di 30 secondi dal momento significativo morte neutrofili può verificarsi. </li><li> Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C. </li><li> Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugare nuovamente a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C. </li><li> Risospendere i neutrofili in 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo) e contare le cellule vive usando il blu tripanotingere metodo di esclusione. Evitare periodi prolungati di densità cellulari maggiori di 5 x 10 6 per ml poiché questo può causare l&#39;attivazione dei neutrofili. </li></ol> 3. Neutrofili Etichettatura con Calcein AM <ol><li> 6 x 10 5 neutrofili sono utilizzati per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. </li><li> Dopo il conteggio, trasferire le cellule risospese ad una provetta da 50 ml e diluire i neutrofili a 2-4 x 10 6 cellule per ml con fenolo aneritro RPMI-1640. </li><li> Aggiungi calceina AM soluzione madre di 3 micron (cioè 2,98 ml di calceina AM madre (1 mg / ml) per ml di media) e mescolare bene muovendo delicatamente il tubo. Superiore a 5 micron calceina AM si tradurrà in perdite dai neutrofili. Nota: non fluorescente calceina AM viene scissa nelle cellule dalle esterasi endogene per produrre la molecola altamente fluorescente calceina (vale a dire le cellule morte non fluorescenza). </li><li> Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare for 30 min a 37 ° C al buio. Nota: i tempi di incubazione più lunghi possono tradursi in maggiore calceina essere liberata dai neutrofili nel corso del saggio di adesione. </li><li> Centrifugare a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C, e lavare i neutrofili 2x con 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C). Dopo risospendere le cellule per il secondo lavaggio, prima passare i neutrofili con un filtro sterile 40 pM per eliminare grumi e quindi si centrifuga di nuovo a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C. </li><li> Risospendere i neutrofili in RPMI 1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C) a 2 x 10 6 neutrofili per ml. </li></ol> 4. Neutrofili Binding Assay <ol><li> Lavare i monostrati HMVEC 3x con 0,5 ml di sterilizzata per filtrazione (0,22 micron) RPMI 1640 (senza rosso fenolo) contenente il 3% di BSA per pozzetto. </li><li> Aspirare i media e aggiungere 6 x 10 5 neutrofili calceina-etichettati (0,3 ml di sospensione cellulare), Oppure 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) senza neutrofili, nei rispettivi pozzetti della 48 pozzetti. Nota: Questo è l&#39;equivalente di 8 x 10 5 neutrofili per cm 2. </li><li> Incubare per 20 min a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Totale dei neutrofili Fluorescenza (PRE lavaggio): Misurare l&#39;intensità di fluorescenza di ciascun bene con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d&#39;onda di 520 nm (fluoresceina filtro impostato) in una FLUOstar, o equivalente, spettrofotometro di emissione. Eseguire questo passaggio appena prima del punto finale incubazione Nota: In questo protocollo, calceina eccitazione e rilevamento della luce emessa state eseguite dalla sommità dei pozzi scoperti, tuttavia, entrambi possono essere eseguite anche dal fondo dei pozzetti.. </li><li> Lavare i pozzetti contenenti monostrati HMVEC e neutrofili 5x con 0,5 ml per pozzetto di PBS (w / Ca 2 + e Mg 2 +). Rimuovere il supporto e lavaggiinvertendo la piastra, e picchiettando delicatamente su carta assorbente per eliminare il liquido rimasto. </li><li> Aggiungi posteriore 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) per pozzetto. </li><li> Aderente neutrofili Fluorescenza POST (lavaggio): Misurare l&#39;intensità di fluorescenza di ogni nonché al punto 4.4. </li><li> Determinare l&#39;aderenza per cento e l&#39;adesione relativa per bene: </li></ol> Nota: In questa fase, le immagini dei neutrofili calceina-etichettati possono essere ottenuti utilizzando un microscopio capace fluorescenza dotato di filtri fluoresceina standard. Le immagini in figura 4 sono stati ottenuti su una Olympus IX51 microscopio invertito dotato di una fotocamera 2000R Retiga (Q Imaging) con Q-Capture Software Pro7 (Q Imaging).

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<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
<li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Wegener%26%2339%3Bs+granulomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+de+Medecine+Interne%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Wegener&#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li>
<li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche per una neutrofili di successo / endoteliale microvascolare saggio di adesione cellulare sono: 1) Uso di basso numero di passaggio (&lt;9), cellule endoteliali sane; 2) Il mantenimento dei neutrofili isolati a bassa densità (cioè &lt;5 x 10 6 cellule / ml) e il loro utilizzo in due ore di isolamento, e 3) il lavaggio Fastidious dei neutrofili calceina AM-etichettati e l&#39;uso dei neutrofili calceina AM-etichettati in modo tempestivo per ridurre al minimo la contaminazione CE e ...

Poiché l&#39;endotelio vascolare è in contatto diretto con il sangue circolante, esso è sitato ad iniziare una risposta infiammatoria rapido durante infezioni o lesioni. Le cellule endoteliali (EC) recettori di pattern recognition espresso che riconoscono una varietà di componenti batteriche conservati e molecole pericolo, e recettori per Host mediatori infiammatori, come TNFa. Attivazione di questi recettori induce EC per secernere citochine (es IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e per upregulate molecole di adesione (ad esempio E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) alla loro superficie cellulare 1 , 2. Queste molecole tutto facilitano la localizzazione dei leucociti ai siti di infezione e lesioni per chiarire l&#39;host di agenti infettivi e avviare la riparazione tissutale 3,4. La risposta dei neutrofili all&#39;infezione comporta un&#39;interazione ben coordinato tra l&#39;endotelio vascolare e la risposta neutrofili. All&#39;attivazione EC, IL-8 è secreto e forma un gradiente intravascolare sull&#39;endotelio che permette di neutrofili casa al sito di infezione o lesioni 5,6. E / P-selectine mediata neutrofili cattura e rotolare attraverso le associazioni relativamente deboli con glycomolecules sulla superficie cellulare dei neutrofili. Queste interazioni, insieme con IL-8 legame ai suoi recettori cognate, facilitano il robusto, attaccamento integrina-mediata ed eventuale arresto dei neutrofili sulla superficie delle cellule endoteliali 7-10. Dopo l&#39;arresto, i neutrofili possono migrare fuori della vascolarizzazione ai siti specifici di infezione di eliminare direttamente i patogeni, generare neutrofili trappole extracellulari per prevenire la diffusione di agenti patogeni, promuovere la guarigione delle ferite e rilasciare fattori aggiuntivi che reclutano leucociti altri come monociti, macrofagi e dendritiche cellule 11-17. Descritte nella presente relazione è un metodo in vitro per quantificare l&#39;adesione dei neutrofili alle microVascular I CE dopo l&#39;attivazione da parte del mediatore infiammatorio ospite TNFa. Questo test è stato progettato per valutare l&#39;attivazione delle cellule endoteliali, e non neutrofili. Neutrofili umani primari sono stato isolato utilizzando separazione gradiente di densità, e sono quindi etichettati con calceina acetossimetil (AM). Esterasi all&#39;interno delle cellule in diretta idrolizzano calceina AM alla molecola calceina altamente fluorescente con una eccitazione di 492-495 nm ed emissione di 513-516 nm 18. I neutrofili fluorescenza marcata vengono poi incubate con monostrati CE, e neutrofili non aderenti sono successivamente rimossi. La fluorescenza dei rimanenti, neutrofili legato viene quindi misurata mediante uno spettrofotometro a fluorescenza, e calcolata come percentuale del totale dei neutrofili ingresso fluorescenza per pozzetto. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che i neutrofili calceina-etichettati vincolati utilizzati in spettrofotometria possono essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per dare una lettura più qualitativa di ac CEtivazione. Dal momento che questo test viene eseguito in condizioni statiche, saranno valutati solo gli eventi molto iniziali che si verificano nella adesione cascata neutrofili. Ciò è confermato in questo rapporto utilizzando anticorpi bloccanti E-selectina per dimostrare che l&#39;adesione dei neutrofili alle TNFa-trattato polmone umano microvascolare CE (HMVEC-Lung) monostrati si riduce drasticamente quando l&#39;interazione con la E-selectina è perturbato. Oltre a TNFa, abbiamo utilizzato con successo questo test per determinare l&#39;entità della vena ombelicale CE attivazione umana (HUVEC) dal recettore Toll-like mezzo agonisti lipoproteine ​​peptidoglicano-associato (PAL), murein lipoproteina (MLP) e Pam3Cys e attivazione HMVEC-Lung da Pam3Cys 19,20. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo test con inibitori delle chinasi e dopo knockdown RNAi-mediata di superficie e proteine ​​citoplasmatiche in HMVEC-Lung, suggerendo che questa metodologia è compatibile con una varietà di biochimica e screening saggi 20. In sintesi, questo saggio fornisce un facile da usare, modo riproducibile, più funzionale per accedere alla misura dell&#39;attivazione CE da mediatori infiammatori in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali a 48 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (senza rosso fenolo)</td><td>Impianto di coltura cellulare UCSF</td><td>CCFAL001</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>D-PBS (senza Ca2+ e Mg2+ e rosso fenolo)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (senza rosso fenolo)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td><td>(0,995 mM) stock soln</td></tr><tr><td>Trypan Soluzione Blu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtri M</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Spettrofotometro FLUOstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative<em&gt; in vitro</em&gt; assay misurare adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

L&#39;endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria. Durante la fase acuta dell&#39;infiammazione, cellule endoteliali (EC) sono attivati ​​da mediatori ospitanti o direttamente da componenti microbici conservati o molecole pericolo ospite-derivati. Attivati ​​ecs esprimere citochine, chemochine e molecole di adesione che mobilitano, attivano e mantengono leucociti nel sito di infezione o lesioni. Neutrofili sono i primi ad arrivare leucociti, e aderire alla endotelio attraverso una varietà di molecole di adesione presenti sulle superfici di entrambe le celle. Le principali funzioni di neutrofili sono eliminare direttamente minacce microbiche, promuovere l&#39;assunzione di altri leucociti attraverso il rilascio di fattori aggiuntivi, e avviare riparazione della ferita. Pertanto, il loro reclutamento e attaccamento alla endotelio è un passaggio fondamentale nell&#39;iniziazione della risposta infiammatoria. In questo rapporto, descriviamo un test di adesione in vitro usando neutrofilicalceina AM-etichettato neutrofili umani primari per quantificare il grado di attivazione delle cellule endoteliali microvascolari in condizioni statiche. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che gli stessi campioni quantizzati mediante spettrofotometria a fluorescenza possono anche essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per una valutazione più qualitativa di legame neutrofili.

Per ottenere risultati affidabili e riproducibili usando un saggio di legame neutrofili, è essenziale che la salute e la confluenza delle cellule endoteliali microvascolari sono ottimali nel giorno del saggio, come illustrato con HMVEC-Lung in Figura 1. Inoltre, è indispensabile che passaggio basso numero microvascolare EC vengono utilizzati (cioè meno di 9 brani), e di conseguenza, si consiglia di eseguire tutti gli esperimenti entro due settimane di scongelamento. La salute dei neutrofili è i...

L&#39;adesione dei neutrofili all&#39;endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell&#39;ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette la<em&gt; In vitro</em&gt; Quantificazione di neutrofilo umana primaria legame alle cellule endoteliali attivate da mediatori infiammatori in condizioni statiche.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il grado di attivazione infiammatoria delle cellule endoteliali microvascolari quantificando il numero relativo di neutrofili che aderiscono alle cellule endoteliali in vitro in condizioni statiche. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto monociti confluenti sani di cellule endoteliali microvascolari con lo stimolo sperimentale desiderato durante il secondo passaggio. I neutrofili provenienti da volontari umani sani vengono isolati e quindi marcati con calcio am.Successivamente, i neutrofili marcati vengono aggiunti alle cellule endoteliali e lasciati aderire per 20 minuti, durante i quali viene effettuata una misurazione preliminare mediante spettrofotometria a fluorescenza. Nell'ultima fase, i neutrofili non aderenti vengono rimossi con un lavaggio, dopo il quale si ottiene una misurazione post-lavaggio. Infine, si può determinare la percentuale e l'adesione relativa dei neutrofili marcati al calcio ai monociti cellulari endoteliali in ciascuna condizione di trattamento.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia infiammatoria umana, poiché consente di determinare il grado r

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Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

In questo video, dimostriamo un test che utilizza la microscopia a fluorescenza per rilevare l'adesione delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili (NET). Nei pozzetti di prova, c'è un notevole aumento del numero di cellule tumorali marcate in fluorescenza che aderiscono ai NET, mentre i pozzetti trattati con DNasi mostrano una ridotta adesione delle cellule tumorali ai NET.

Saggio di adesione in vitro per rilevare l'aderenza delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili

La migrazione transeteliale neutrofila in risposta all'infezione batterica della mucosa contribuisce alla lesione epiteliale e alla malattia clinica. È stato sviluppato un modello in vitro che combina agenti patogeni, neutrofili umani e strati cellulari epiteliali umani polarizzati coltivati su filtri transwell per facilitare le indagini verso lo svelamento dei meccanismi molecolari che orchestrano questo fenomeno.

In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Riportiamo un metodo in vitro che permette la quantificazione del numero effettivo di cellule adesive all'interno di un monostrato di cellule endoteliali.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Impara a misurare l'adesione dei neutrofili attivati alle cellule endoteliali microvascolari umane primarie in condizioni statiche con questo saggio quantitativo in vitro.

Quantitative In vitro Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche (Video) | JoVE Journal

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