Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare micro modelli di oro nanoporoso e dimostrare la loro compatibilità con la coltura cellulare. Ciò si ottiene creando prima maschere stencil o fotolitografiche. Il secondo passo consiste nel co-sputter oro e argento attraverso le maschere per modellare la lega precursore dell'oro nano poroso.

Successivamente, i modelli di lega oro-argento vengono delegati in acido nitrico per produrre rivestimenti d'oro nano porosi. Il passaggio finale consiste nel coltivare le cellule sui micro modelli di oro nanoporoso e nell'immunocolorarle, infine, la microscopia elettronica a fluorescenza e a scansione abbinata all'analisi delle immagini viene utilizzata per quantificare le interazioni tra i materiali cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi per la creazione di rivestimenti nanostrutturati, come i nanotubi di carbonio, è che l'oro nanoporoso beneficia della compatibilità con la microfabbricazione, dell'elevata superficie effettiva, della facilità di funzionalizzazione con la chimica basata sulle piastrelle, della conduttività elettrica e della biocompatibilità.

Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi della scienza dei materiali e della bioingegneria, come l'effetto della nanostruttura dei materiali sulle proprietà elettriche, meccaniche, biologiche e chimiche. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sull'effetto della nanostruttura sulla morfologia cellulare. Può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo sviluppo di biosensori, sistemi di somministrazione di farmaci e piattaforme di accumulo di energia.

Iniziare questa procedura pulendo i vetrini da microscopio da un pollice per tre pollici e i piccoli vetrini coprioggetti con una soluzione piranha, caricare i piccoli vetrini in una barchetta di porcellana per la colorazione immunologica e immergere la barca e il vetrino da microscopio nella soluzione piranha. Vedere il protocollo di testo per i dettagli sulla procedura di pulizia. Dopo la pulizia, trasferire i campioni in piastre di cristallizzazione e sciacquarli con acqua per tre minuti.

Posizionare i campioni su asciugamani privi di lanugine e asciugarli con una pistola ad azoto per creare motivi in scala millimetrica. Perforare fogli di elastomero siliconico spessi 250 micron con un punzone per biopsia. Pulire i fogli di elastomero lavorati immergendoli in isopropanolo al 70% e poi asciugarli con una pistola ad azoto.

Quindi posizionare il foglio perforato su un asciugamano privo di lanugine e allineare i vetrini coprioggetto puliti sullo stencil con la superficie del campione rivolta verso lo stencil. Trasferisci lo stencil con i vetrini coprioggetto su un wafer di supporto per creare motivi in scala submillimetrica. Posizionare un microscopio pulito, far scorrere un mandrino rotante e soffiare via eventuali particelle con una pistola ad azoto.

Erogare 1,5 millilitri di esametildilano sul vetrino. Utilizzando una pipetta di plastica, stendere l'esametildilano facendo girare il vetrino successivamente a 500 giri/min per cinque secondi e a 1500 giri/min per 30 secondi. Al termine, cuocete lo scivolo su una piastra calda a 115 gradi Celsius per sette minuti, quindi lasciatelo raffreddare per cinque minuti.

Quindi, erogare quattro millilitri di una foto positiva. Resistere sul vetrino. Stendere il fotoresist facendo girare la diapositiva utilizzando le condizioni descritte in precedenza.

Cuocere lo scivolo su una piastra calda a 115 gradi Celsius per 1,5 minuti e rimuoverlo dopo l'esposizione ai raggi UV e la cottura. Sciogliere la foto esposta. Resisti immergendo la diapositiva in una foto positiva.

Resistere allo sviluppatore per almeno 3,5 minuti. Al termine, sciacquare accuratamente il vetrino con acqua deionizzata e ispezionare i modelli sviluppati al microscopio ottico. Successivamente, carica i campioni in una macchina sputtering in grado di depositare autonomamente oro, argento e cromo sputtering.

Pulire i campioni per 90 secondi a 50 watt in un'atmosfera di lavorazione Argonne da 25 millitorr prima di iniziare la deposizione di metallo sotto 10 millitorr di cromo Argonne sputter per 10 minuti a 300 watt. Quindi spruzzare l'oro per 90 secondi a 400 watt, seguito dal co-sputtering dell'oro e dell'argento per 10 minuti con l'argento a 200 watt e l'oro a 100 watt. Spegni la fonte di spruzzatura d'oro circa 10 secondi prima di spegnere la sorgente di sputtering d'argento.

Rimuovere i campioni dalla macchina per lo sputtering dopo aver rimosso i samples dalla macchina per lo sputtering. Sonicali in circa 180 millilitri di una foto positiva. Resist stripper per 10 cicli di 22a sonicazione con due minuti di pausa tra i cicli.

Al termine, sciacquare i campioni con acqua e asciugarli con una pistola ad azoto. Ispezionare i modelli metallici al microscopio. Quindi staccare lo stencil in elastomero dai campioni rivestiti senza fotoresist utilizzando due pinzette per rivelare il metallo depositato.

Trattare i piccoli vetrini coprioggetti con plasma d'aria a 10 watt per 30 secondi prima di immergerli in acido nitrico. Lega i vetrini del microscopio immergendoli in un becher di acido nitrico al 70% a 55 gradi Celsius per 15 minuti. Una volta completata la delega, sciacquare i campioni immergendoli successivamente in becher d'acqua per tre volte ciascuno.

Posizionare i campioni su asciugamani privi di lanugine e asciugarli con una pistola ad azoto. Regolare la temperatura di una piastra riscaldante tra 150 e 300 gradi Celsius. Quindi abbassare lentamente i campioni sulla superficie calda per ridurre al minimo gli sbalzi di temperatura.

Dopo cinque minuti, rimuovere i campioni dalla piastra calda per farli raffreddare. Posizionare i campioni di oro nanoporoso in piastre di polistirene e trattarli con plasma d'aria a 10 watt per 30 secondi. Quindi trasferire i campioni in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti.

Aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura completo a ciascuno. Conservare bene le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 fino alla semina delle cellule. Mantenere le cellule di astrociti murini in fiasche T 75 con terreni di coltura.

Una volta che le cellule sono confluenti al 70%, farle passare rimuovendo prima il vecchio terreno e lavando le cellule con PBS. Consulta il protocollo testuale per i dettagli sulle condizioni dei passeggeri. Dopo aver rimosso le piastre di coltura dall'incubatore, aspirare il terreno esaurito dai pozzetti e seminare le cellule sul vetro.

Vetrini coprioggetti con una densità di 25.000 celle per centimetro quadrato con un volume finale di un millilitro. Agitare la piastra di coltura per garantire un rivestimento uniforme delle cellule sui campioni e posizionare la piastra di coltura nell'incubatore quando le cellule sono pronte per essere analizzate. Rimuovere il materiale esaurito dai pozzetti e lavarli due volte con PBS.

Una volta che le cellule sono state fissate in 4% di para formaldeide in PBS e lavate due volte, permeatele in 500 microlitri di Tritone X 0,1% in PBS per cinque minuti. Ripetere il lavaggio PBS due volte e trasferire le cellule nei pozzetti puliti. Tamponare 80 microlitri di soluzione colorante sui campioni e conservarli coperti con un foglio di alluminio per 20 minuti.

Dopo un altro lavaggio con PBS, controcolorare le cellule con tre nanomolari di DPI in PBS per cinque minuti. Lavare nuovamente le celle con PBS e immergerle in di quindi montare le celle su vetro. Coprire i vetrini con il supporto di montaggio e sigillarli con un'immagine trasparente dello smalto per unghie.

L'oro nanoporoso emerge con un microscopio elettronico a scansione con ingrandimento di 50.000 x a 10 kilovolt di energia elettronica utilizzando un rivelatore di elettroni secondario. Successivamente, acquisisci immagini di cellule composite in diversi punti dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito con ingrandimento 10x con i cubi filtranti appropriati. Aprire le immagini nell'immagine J.Dividi le immagini su singoli canali.

Convertili in otto dichiarazioni. Sottrai lo sfondo e smussali con il filtro mediano. Quindi regola manualmente la soglia per evidenziare i pori, i corpi cellulari e i nuclei.

Utilizzare il comando spartiacque per separare i pori o le celle unite. Imposta i parametri di analisi delle particelle ed esegui il comando per estrarre il numero di particelle, l'area media e la percentuale di copertura da parte delle particelle. Infine, modificare i file macro inclusi per eseguire l'analisi batch di più immagini.

Qui viene visualizzato il cambiamento di colore dei modelli metallici depositati prima e dopo la lega d. La finitura argentea è dovuta al contenuto di lega ricca d'argento sulla lega. Il film acquisisce una tinta visibilmente marrone arancio.

Qui sono mostrate le caratteristiche più fini prodotte dalla fotolitografia. Modellazione del metallo. Diverse morfologie povere possono essere ottenute dal trattamento termico dei film d'oro nano porosi.

L'immagine in sezione trasversale rivela se i film sono delegati in modo uniforme attraverso lo spessore del film. Le immagini del microscopio elettronico a scansione possono essere segmentate in immagini binarie per determinare la dimensione e la percentuale di copertura dei vuoti. Il codice per generare questo output può essere scaricato dalla pagina web di JoVE.

Un'immagine rappresentativa a fluorescenza di cellule di astrociti murini aderenti coltivate su una superficie d'oro nanoporosa è raffigurata qui. I singoli canali dell'immagine possono essere divisi e segmentati per produrre immagini binarie per l'analisi dell'interazione tra i materiali cellulari. Le immagini segmentate del citoscheletro possono essere utilizzate per quantificare l'area cellulare e la copertura superficiale.

Mentre le immagini segmentate del nucleo cellulare sono utili per il conteggio delle cellule. I codici per generare questi output possono essere scaricati dalla pagina web di JoVE. Di seguito è mostrato un riepilogo visivo dei fallimenti nella fabbricazione di strutture in oro nanoporoso, tra cui l'adesione del film di PO, l'assenza di porosità e l'eccessivo trattamento termico.

Seguendo questa procedura, altri metodi suggeriscono che la caratterizzazione elettrochimica al microscopio forestale, la lisi cellulare e la PCR possono essere eseguite per rispondere ulteriormente a ulteriori domande come l'effetto dell'adesione cellulare della nanostruttura e l'espressione genica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre modelli d'oro a nanopori e quantificare le loro interazioni con le cellule mediante l'analisi digitale delle immagini al microscopio. Risultati. Non dimenticare che lavorare con acido nitrico, acido solforico e perossido di idrogeno può essere estremamente pericoloso e durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, tra cui la coltivazione di dispositivi di protezione individuale.