Utilizzo di un sistema di tracciamento 3D automatizzato per registrare singoli e banchi di pesci zebra adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i modelli di movimento tridimensionali del pesce zebra o di altri animali acquatici e analizzare le loro caratteristiche cinematiche, spaziali e sociali. Ciò consente di rilevare comportamenti alterati dovuti a mutazioni genetiche o fattori chimici e ambientali. Ciò si ottiene calibrando prima il sistema, che corregge anche la notevole distorsione dell'immagine generata dalla rifrazione.

Il secondo passo consiste nel registrare fotogrammi video con una risoluzione temporale relativamente alta da almeno due diverse angolazioni contemporaneamente. Successivamente, il software ricostruisce le traiettorie dei pesci. Algoritmi avanzati vengono applicati per ridurre l'effetto del rumore e per dedurre la posizione di un pesce quando si verifica l'occlusione o il clustering.

Il passo finale consiste nell'analizzare i dati ed eseguire analisi statistiche per l'accelerazione della velocità, l'angolo di virata, la distribuzione orizzontale e verticale nel contenitore di osservazione, le distanze inter individuali e altri parametri di interesse. In definitiva, il tracciamento 3D calibrato ad alta velocità è utile per studiare i deficit comportamentali nel pesce zebra mutante e gli effetti dei farmaci su una varietà di sistemi comportamentali. Ai fini della scoperta di farmaci, un vantaggio del sistema è che consente di studiare il comportamento dei pesci in 3D.

Questo è importante perché i pesci si muovono naturalmente in tutte e tre le dimensioni e quando si registrano più pesci contemporaneamente, la registrazione 2D può essere molto fuorviante quando si indagano le configurazioni spaziali del gruppo. Un altro vantaggio del sistema è che corregge la rifrazione della luce, che se non corretta, può comportare errori di misurazione significativi nella sua configurazione attuale. Il contenitore di osservazione che contiene il pesce zebra è posizionato nella camera di osservazione.

La camera contiene anche una telecamera, uno specchio, che è sospeso a circa 45 gradi sopra il contenitore e barre luminose a LED. Prima della registrazione, calibrare il sistema per determinare le posizioni della parete del contenitore e della superficie dell'acqua e il fattore di scala dei fotogrammi registrati si regola anche per l'errore generato dalla rifrazione della luce durante il passaggio dall'acqua all'aria. Una volta completata la calibrazione, è necessario eseguire un test con un pesce fittizio.

La ricalibrazione deve essere eseguita se le posizioni dello specchio o della fotocamera sono disattivate o se ci sono problemi con l'inseguimento. Per iniziare una sessione di registrazione, posizionare il contenitore di osservazione riempito d'acqua fino ai segni nella camera di osservazione. I piedini del contenitore devono essere inseriti nei fori di allineamento.

Orientare i contenitori in modo che le pareti semitrasparenti o opache siano rivolte verso il lato opposto e a destra come visto dalla fotocamera. Quindi, accendi le luci nello scomparto, quindi metti il pesce nel contenitore e chiudi le tende. Apri il modulo di registrazione e sullo schermo apparirà l'immagine della vista frontale e superiore del contenitore.

Inizialmente, l'immagine acquisita potrebbe non essere l'ideale e quindi potrebbe essere necessaria una certa regolazione per ottenere un contrasto sufficiente tra il pesce e lo sfondo. Per regolare l'immagine, selezionare Controllo fotocamera, quindi nella finestra delle impostazioni generali visualizzata, deselezionare le caselle mostrate qui, quindi regolare l'otturatore e il guadagno in modo tale che l'immagine non sia sovraesposta. Successivamente, sul lato sinistro della finestra di controllo della fotocamera, seleziona il colore del bilanciamento del bianco e, nella nuova finestra, deseleziona la casella automatica e regola i valori di rosso e blu per ottenere il miglior contrasto cromatico sia nella vista frontale che in quella superiore.

Potrebbero essere necessarie più regolazioni dopo che le regolazioni sono state completate. Dal menu principale del modulo di registrazione, selezionare la posizione dei dati per creare o selezionare una cartella. Ogni registrazione dovrebbe avere la propria cartella, che dovrebbe essere una sottocartella della cartella dell'esperimento.

Ora premi avvia registrazione e inserisci un numero intero per la durata della registrazione in minuti, quindi premi ok e inizierà la sessione di registrazione sperimentale. Una volta completate le registrazioni, copiare e incollare le sottocartelle dei dati del contenitore degli animali e dei dati di corrispondenza dalla cartella di calibrazione alle cartelle create in precedenza Durante la registrazione per iniziare la ricostruzione del percorso, aprire il modulo di traiettoria del software. Quindi premere posizione dati per selezionare la cartella creata con il modulo di registrazione.

Quindi, premere il pulsante di configurazione del sistema per aprire prima la finestra dei parametri, regolare le soglie di colore della vista inferiore dell'estremità superiore. Un buon valore iniziale è 1000. Quindi, seleziona le soglie delle dimensioni della vista superiore e inferiore.

Una buona dimensione iniziale per un pesce zebra di medie dimensioni è 10 o usa 20 per un pesce grande e cinque per un pesce piccolo. Più alte sono queste soglie, meno è probabile che il software rilevi il rumore. Tuttavia, con un valore troppo alto, potrebbe non essere in grado di rilevare il pesce.

Potrebbe essere necessario riaggiustare queste soglie più avanti nell'esperimento. Per la soglia di dimensione superiore, un valore di 3000 è in genere sufficiente. E per una lunghezza specifica, mantenere il valore preimpostato di 220.

Il numero di pesci si riferisce al numero di pesci nella vasca di osservazione. Il numero massimo di punti si riferisce al numero totale di fotogrammi, registrare o ricordare questo numero e premere. Ok. Quindi seleziona acquisisci sfondo.

La finestra successiva chiederà di compilare i campi da e due. Dopo aver caricato lo sfondo, regola le tre caselle rosse usando il mouse, le caselle segnano le aree in cui il software sta cercando il pesce. Riduci a icona la casella a sinistra.

Poiché la vista laterale viene utilizzata solo per la calibrazione, ora premi il pulsante di avvio della generazione delle traiettorie e inizierà la ricostruzione del percorso. Idealmente, il tag dovrebbe essere posizionato sull'immagine del pesce se è spesso posizionato in modo errato, apri la finestra informativa. Qui vediamo un caso ideale in cui si vedono solo i contorni del pesce.

In caso di rumore eccessivo, premere stop nel menu principale e scegliere nuove soglie di colore e dimensione. Inoltre, controlla se le caselle rosse possono essere leggermente ridotte. Ad esempio, in alto, per escludere il rumore generato dai movimenti dell'acqua, osserva la traiettoria sullo schermo 3D.

Facendo clic con il pulsante destro del mouse, il ricercatore può selezionare tra la rotazione e le traslazioni della configurazione 3D. Per iniziare l'elaborazione dei dati, aprire il modulo di elaborazione dati, selezionare progetto sulla barra degli strumenti, quindi dal menu a discesa, selezionare nuovo e immettere un nome per l'esperimento. Quindi, seleziona modifica progetto.

Quindi aggiungi al progetto seguito da un nuovo gruppo e inserisci un nome per il gruppo sperimentale. Ora seleziona il gruppo sperimentale nella finestra di destra. Si noti che la barra degli strumenti cambierà.

Selezionare Modifica gruppo, quindi Aggiungi al gruppo e quindi nuove misurazioni. Si aprirà una finestra del browser. Successivamente, apri la cartella creata durante la registrazione e seleziona le traiettorie delle sottocartelle e quindi il file levigato del punto.

Nell'esempio qui presentato per il gruppo A, sono stati caricati sei file e per il gruppo B quattro file. Per iniziare l'analisi, selezionate il file levigato del punto nella finestra di destra. Selezionare quindi Elaborazione dati ed Endpoint a valore singolo dal menu a discesa.

A titolo illustrativo, selezionare il congelamento della durata. Si aprirà una finestra per specificare il congelamento in termini di soglia di velocità e soglia di durata per familiarizzare con il programma. Prova altri esempi come la distribuzione della profondità della distanza di viaggio, che consente di determinare il numero di livelli di profondità e la frequenza di burst.

Quando si seleziona l'opzione, l'elaborazione batch utilizzando la soglia predefinita verrà calcolata circa 200 endpoint in questo contesto. Default significa che i delimitatori sono stati impostati. Ad esempio, attualmente la distribuzione della profondità viene calcolata per tre livelli di profondità e la distribuzione angolare viene calcolata per quattro sezioni.

Dopo aver generato i parametri, si aprirà una nuova finestra che chiederà la posizione e il nome del file da creare. Questi verranno salvati in formato CSV e potranno essere importati in altri software. Qui, la figura A mostra un tipico frame di esempio per il controllo.

Pesce zebra, mentre la figura B mostra un tipico fotogramma di esempio per il pesce zebra trattato con MK 801, entrambi registrati durante una sessione mattutina. Si noti che i pesci zebra controllati erano vicini al fondo e vicini tra loro. Al contrario, i pesci zebra MK 801 erano vicini alla cima e nuotavano a notevole distanza l'uno dall'altro.

Qui, due traiettorie rappresentative per il pesce zebra controllato e il pesce zebra trattato con 10 micromolare. Gli MK 801 vengono presentati per una sessione mattutina e per una sessione pomeridiana. In questa figura, vengono presentate le distanze sociali medie per i controlli e i pesci trattati con 10 micromolari MK otto uno per entrambe le sessioni, e qui vengono presentate le timeline delle distanze medie interindividuali per entrambi i gruppi.

Qui nella figura A, vediamo la distribuzione del pesce zebra su 10 livelli di profondità uguali per la sessione mattutina, e in B, la distribuzione per la sessione pomeridiana. Qui si vede la distribuzione temporale sulle quattro zone radiali dei gruppi sperimentali. Il riquadro mostra le posizioni di queste zone dal centro alla periferia, e qui vediamo la distribuzione temporale sui quattro quadranti dei gruppi sperimentali.

Il riquadro mostra la posizione dei quadranti. Le linee doppie rappresentano le pareti bianche, le linee singole rappresentano le pareti trasparenti. La fotocamera si trova a sinistra dell'inserto IE, più vicino ai quadranti uno e quattro.

Gli asterischi neri indicano i confronti tra i gruppi della sessione mattutina e gli asterischi grigi per quelli delle sessioni pomeridiane. Infine, qui sono mostrate le componenti X, Y, Z della distanza percorsa dal pesce zebra durante le sessioni mattutine e pomeridiane. Vengono presentate la media e la media dell'errore standard.

Quando lavori con il sistema, ricorda che i dati sono buoni solo quanto la registrazione, quindi assicurati che il sistema sia ben calibrato e che le impostazioni della fotocamera siano ottimali. Il resto è facile e si tratta solo di familiarizzare con i diversi passaggi.