Utilizzo di un sistema di tracciamento 3D automatizzato per registrare singoli e banchi di pesci zebra adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i modelli di movimento tridimensionali del pesce zebra o di altri animali acquatici e analizzarne le caratteristiche cinematiche, spaziali e sociali. Questo consente di rilevare comportamenti alterati dovuti a mutazioni genetiche o a fattori chimici e ambientali. Ciò viene ottenuto innanzitutto calibrando il sistema, operazione che corregge anche la notevole distorsione dell'immagine generata dalla rifrazione.

Il secondo passaggio consiste nel registrare fotogrammi video con una risoluzione temporale relativamente elevata da almeno due angolazioni diverse simultaneamente. Successivamente, il software ricostruisce le traiettorie dei pesci. Vengono applicati algoritmi avanzati per ridurre l'effetto del rumore e per inferire la posizione di un pesce in caso di occlusione o raggruppamento.

L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati ed eseguire l'analisi statistica di velocità, accelerazione, angolo di virata, distribuzione orizzontale e verticale nel contenitore di osservazione, distanze inter-individuali e altri parametri di interesse. In definitiva, il tracciamento 3D calibrato ad alta velocità è utile per studiare i deficit comportamentali nei zebrafish mutanti e gli effetti di farmaci su una varietà di sistemi comportamentali. Ai fini della scoperta di farmaci, un vantaggio del sistema è che consente lo studio del comportamento dei pesci in 3D.

Questo è importante perché i pesci si muovono naturalmente in tutte e tre le dimensioni e, quando si registrano più pesci contemporaneamente, una registrazione in 2D può risultare molto fuorviante nell'analisi delle configurazioni spaziali del gruppo. Un altro vantaggio del sistema è che corregge la rifrazione della luce, che, se non corretta, può portare a errori di misurazione significativi nella configurazione attuale. Il contenitore di osservazione che contiene i pesci zebra è posizionato all'interno della camera di osservazione.

La camera contiene inoltre una telecamera, uno specchio sospeso a circa 45 gradi sopra il contenitore e barre luminose a LED. Prima della registrazione, calibrare il sistema per determinare la posizione delle pareti del contenitore e della superficie dell'acqua, nonché il fattore di scala dei fotogrammi registrati, correggendo anche l'errore generato dalla rifrazione della luce nel passaggio dall'acqua all'aria. Al termine della calibrazione, è necessario effettuare una prova con un pesce fittizio.

La ricalibrazione deve essere eseguita se le posizioni dello specchio o della telecamera non sono corrette o se si verificano problemi nel tracciamento. Per iniziare una sessione di registrazione, posizionare il contenitore di osservazione riempito fino ai segni con acqua all'interno della camera di osservazione. I piedini del contenitore devono essere inseriti nei fori di allineamento.

Orientare i contenitori in modo che le pareti semitrasparenti o opache siano rivolte verso il lato lontano e verso destra, visto dalla telecamera. Successivamente, accendere le luci nel compartimento, quindi inserire il pesce nel contenitore e chiudere le tende. Aprire il modulo di registrazione e sullo schermo apparirà l'immagine della vista frontale e superiore del contenitore.

Inizialmente, l'immagine acquisita potrebbe non essere ideale e potrebbe quindi richiedere alcune regolazioni per ottenere un contrasto sufficiente tra il pesce e lo sfondo. Per regolare l'immagine, selezionare il controllo della fotocamera, quindi nella finestra delle impostazioni generali che si apre, deselezionare le caselle mostrate qui, e regolare quindi l'otturatore e il guadagno in modo che l'immagine non risulti sovraesposta. Successivamente, sul lato sinistro della finestra di controllo della fotocamera, selezionare il bilanciamento del bianco a colori e, nella nuova finestra, deselezionare la casella auto e regolare i valori rosso e blu per ottenere il migliore contrasto cromatico sia nella vista frontale che in quella superiore.

Potrebbero essere necessari diversi aggiustamenti anche dopo il completamento degli aggiustamenti. Dal menu principale del modulo di registrazione, selezionare la posizione dei dati per creare o selezionare una cartella. Ogni registrazione dovrebbe avere la propria cartella, che deve essere una sottocartella della cartella dell'esperimento.

Ora premere "start recording" e inserire un numero intero per la durata della registrazione in minuti, quindi premere "ok" e la sessione di registrazione sperimentale avrà inizio. Al termine delle registrazioni, copiare e incollare i dati del contenitore animale e le sottocartelle dei dati di corrispondenza dalla cartella di calibrazione nelle cartelle precedentemente create. Per iniziare la ricostruzione del percorso, aprire il modulo di traiettoria del software. Quindi premere "data location" per selezionare la cartella creata con il modulo di registrazione.

Successivamente, premere il pulsante di configurazione del sistema per aprire prima la finestra dei parametri, quindi regolare le soglie del colore per la vista superiore e inferiore. Un valore iniziale consigliato è 1000. Successivamente, selezionare le soglie dimensionali per la vista superiore e quella inferiore.

Una dimensione iniziale adeguata per un pesce zebra di taglia media è 10, usare 20 per un pesce grande e 5 per un pesce piccolo. Più elevati sono questi valori soglia, minore sarà la probabilità che il software rilevi rumore. Tuttavia, con un valore troppo alto, potrebbe non essere in grado di rilevare il pesce.

Potrebbe essere necessario ricalibrare queste soglie in una fase successiva dell'esperimento. Per la soglia superiore di dimensione, un valore di 3000 è generalmente sufficiente. Per la lunghezza specifica, mantenere il valore preimpostato di 220.

Il numero di pesci indica il numero di pesci nel serbatoio di osservazione. Il numero massimo di punti si riferisce al numero totale di fotogrammi; registrare o ricordare questo numero e premere Ok. Quindi selezionare acquisizione dello sfondo.

Nella finestra successiva verrà richiesto di compilare i campi "da" e "a". Dopo aver caricato lo sfondo, regolare le tre caselle rosse utilizzando il mouse; queste caselle indicano le aree in cui il software ricerca il pesce. Ridurre al minimo la casella a sinistra.

Poiché la vista laterale viene utilizzata solo per la calibrazione, premere ora il pulsante per iniziare a generare le traiettorie e avrà inizio la ricostruzione del percorso. Idealmente, il tag dovrebbe essere posizionato sull'immagine del pesce; se viene spesso posizionato in modo errato, aprire la finestra delle informazioni. Qui vediamo un caso ideale in cui sono visibili soltanto i contorni del pesce.

In caso di rumore eccessivo, premere interrompi nel menu principale e scegliere nuove soglie di colore e dimensione. Verificare inoltre se le caselle rosse possono essere leggermente ridotte. Ad esempio, nella parte superiore, per escludere il rumore generato dai movimenti dell'acqua, osservare la traiettoria sullo schermo 3D.

Facendo clic con il tasto destro del mouse, il ricercatore può scegliere tra rotazione e traslazione della configurazione 3D. Per iniziare l'elaborazione dei dati, aprire il modulo di elaborazione dati, selezionare il progetto sulla barra degli strumenti, quindi dal menu a discesa scegliere nuovo e inserire un nome per l'esperimento. Successivamente, selezionare modifica progetto.

Quindi aggiungere al progetto seguito da un nuovo gruppo e inserire un nome per il gruppo sperimentale. Selezionare ora il gruppo sperimentale nella finestra di destra. Si noti che la barra degli strumenti verrà modificata.

Selezionare modifica gruppo, quindi aggiungi al gruppo e poi nuove misurazioni. Verrà aperta una finestra del browser. Successivamente, aprire la cartella creata durante la registrazione e selezionare la sottocartella traiettorie e quindi il file dei punti smussati.

Nell'esempio presentato qui per il gruppo A, sono stati caricati sei file e per il gruppo B quattro file. Per iniziare l'analisi, selezionare il file smussato nel punto nella finestra di destra. Quindi selezionare l'elaborazione dei dati e i parametri ad un singolo valore dal menu a tendina.

A titolo illustrativo, selezionare il congelamento della durata. Si aprirà una finestra per specificare il congelamento in termini di soglia di velocità e soglia di durata, al fine di prendere familiarità con il programma. Provare altri esempi come la distribuzione della profondità della distanza percorsa, che consente di determinare il numero di livelli di profondità e la frequenza degli scatti.

Quando si seleziona l'opzione, nell'ambiente specificato verrà eseguito un trattamento batch utilizzando una soglia predefinita di circa 200 punti finali. Per impostazione predefinita, ciò significa che sono stati impostati dei delimitatori. Ad esempio, attualmente la distribuzione in profondità viene calcolata per tre livelli di profondità e la distribuzione angolare viene calcolata per quattro sezioni.

Dopo aver generato i parametri, verrà aperta una nuova finestra che richiederà il percorso e il nome del file da creare. Questi verranno salvati in formato CSV e potranno essere importati in altri software. Qui, la figura A mostra un esempio tipico di fotogramma di controllo.

Il pesce zebra, mentre la figura B mostra un esempio tipico di fotogramma relativo a pesci zebra trattati con MK 801, entrambi registrati durante una sessione mattutina. Si noti che i pesci zebra di controllo si trovavano vicini al fondo e ravvicinati tra loro. Al contrario, i pesci zebra trattati con MK 801 si trovavano vicini alla superficie e nuotavano a notevole distanza l'uno dall'altro.

Qui vengono presentate due traiettorie rappresentative per pesci zebra controlli e pesci zebra trattati con 10 micromolari di MK 801, rispettivamente per una sessione mattutina e per una sessione pomeridiana. In questa figura sono mostrate le distanze sociali medie per i controlli e per i pesci trattati con 10 micromolari di MK 801 per entrambe le sessioni, mentre qui vengono presentate le cronologie delle distanze inter-individuali medie per entrambi i gruppi.

Qui, nella figura A, osserviamo la distribuzione dei pesci zebra su 10 livelli di profondità uguali durante la sessione mattutina e, in B, la distribuzione per la sessione pomeridiana. Qui si vede la distribuzione temporale nei quattro settori radiali dei gruppi sperimentali. L'inserto mostra la posizione di questi settori dal centro verso la periferia e qui osserviamo la distribuzione temporale nei quattro quadranti dei gruppi sperimentali.

L'insetto mostra la posizione dei quadranti. Le linee doppie rappresentano pareti bianche, le linee singole rappresentano pareti trasparenti. La telecamera si trova a sinistra dell'insetto IE, più vicina ai quadranti uno e quattro.

Gli asterischi neri indicano i confronti tra i gruppi della sessione mattutina e gli asterischi grigi quelli della sessione pomeridiana. Infine, qui sono mostrate le componenti X, Y, Z della distanza percorsa dai pesci zebra durante le sessioni mattutina e pomeridiana. Sono riportati la media e l'errore standard della media.

Quando si lavora con il sistema, ricordare che i dati sono accurati solo quanto la registrazione; assicurarsi quindi che il sistema sia ben calibrato e che le impostazioni della telecamera siano ottimali. Il resto è semplice e richiede soltanto familiarità con i diversi passaggi.