Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire in modo non invasivo reagenti acquosi alla ghiandola mammaria del topo. Introduttivo. Ciò si ottiene anestetizzando prima il topo e rimuovendo i peli che circondano i capezzoli. Il secondo passo consiste nel rimuovere la pelle morta che copre la punta dei capezzoli utilizzando micro pinzette.

Successivamente, una soluzione acquosa viene iniettata nel capezzolo utilizzando un ago calibro 33. Il passo finale è quello di assicurarsi che l'iniezione abbia avuto successo osservando il sito di iniezione per un potenziale gonfiore, il che suggerirebbe un'iniezione di cuscinetto adiposo mammario invece di un'iniezione nella ghiandola mammaria. In definitiva, il successo della procedura può essere determinato dalla visualizzazione dell'albero duttile dopo l'iniezione di blu di Evans.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro al seno, come il contributo di geni specifici durante le varie fasi della tumorgenesi della memoria. Per iniziare, preparare 160 microlitri di colorante blu Evans allo 0,2% in soluzione salina sterile tamponata con fosfato per ogni topo da iniettare prima dell'iniezione. Pesa ogni topo e registra il suo peso corporeo.

Quindi anestetizzare il topo uno alla volta, utilizzando una camera di fluoro isof e applicare un lubrificante per gli occhi. Una volta sedato, posizionare un naso isof al fluoro e iniettare meloxicam a una velocità compresa tra cinque e 10 milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea prima della procedura Come analgesico durante la procedura, monitorare continuamente il topo per i cambiamenti nella frequenza respiratoria e regolare di conseguenza il livello di isof fluoro, soprattutto se la frequenza respiratoria del topo indica che il livello di anestesia deve essere ridotto. Successivamente, preparare l'area del capezzolo per l'iniezione applicando una crema depilatoria da banco.

Attendere cinque minuti e poi rimuovere delicatamente i peli sciolti con l'applicatore a punta di cotone. Con un movimento circolare, rimuovere eventuali residui di crema utilizzando carta assorbente umida e condita con acqua tiepida. Quindi fissare il mouse sotto lo stereoscopio fissando delicatamente le estremità e pulire i siti di iniezione con tamponi imbevuti di alcol.

Per iniziare, individuare i capezzoli da iniettare sotto lo stereoscopio. Quindi utilizzare una pinzetta da micro dissezione fine per rimuovere la pelle morta che copre l'apertura del capezzolo. Non è necessario tagliare il capezzolo per l'iniezione.

Successivamente, caricare 11 microlitri di soluzione iniettabile in una siringa da 50 microlitri dotata di un ago con mozzo metallico calibro 33 fissato su di essa. Un microlitro di liquido per l'iniezione spesso fuoriesce dopo l'iniezione, con conseguente obiettivo finale di 10 microlitri di soluzioni iniettate con successo. Tenere delicatamente il capezzolo con le pinzette sottili e sollevarlo leggermente per posizionarlo per l'iniezione.

Quindi iniettare 11 microlitri in ciascuna ghiandola nella prima e nell'ultima coppia di ghiandole mammarie poiché richiedono un volume inferiore rispetto alle coppie centrali per riempire completamente l'albero duttile della ghiandola. Quindi, iniettare 21 microlitri in ciascuna ghiandola dal secondo al quarto paio di ghiandole mammarie. La velocità di iniezione deve essere mantenuta a circa 40 microlitri al minuto al fine di ridurre al minimo eventuali danni potenziali causati dal rapido movimento del fluido all'interno dei lumi duttali.

Dopo l'iniezione. Osservare il sito di iniezione. Non dovrebbero esserci segni di trauma nella regione del capezzolo o nel tessuto circostante.

Gonfiore nell'area circostante il capezzolo. Probabilmente indica un'iniezione di cuscinetto adiposo mammario piuttosto che un'iniezione duttale di successo. Quindi rimuovere l'animale dal cono del naso e spostarlo in una gabbia separata per il recupero.

Posiziona la gabbia sotto una lampada termica per prevenire l'ipotermia e favorire il recupero. Alloggia l'animale da solo e monitoralo attentamente fino a quando non riprende conoscenza e mobilità. Al termine dello studio, sopprimere i topi mediante lussazione cervicale a seguito di gas compresso CO2 in una camera isolata.

Quindi asportare le ghiandole mammarie e continuare con la corretta manipolazione del campione per l'analisi di interesse. Qui è mostrata la ghiandola mammaria di un topo prima e dopo essere stata iniettata attraverso il capezzolo con il colorante blu di Evan. La regione del capezzolo non mostra gonfiore o danni ai tessuti, che sarebbero causati dall'iniezione del colorante nel cuscinetto adiposo che circonda i condotti.

Il colorante blu diffuso visto nell'immagine a destra è un buon indicatore di una corretta iniezione. Questo può essere convalidato osservando l'intera ghiandola o una sezione trasversale dopo l'escissione della ghiandola. Nell'analisi dell'intera montatura mostrata qui, la ghiandola iniettata in blu di Evans mostra l'intera ghiandola piena di colorante senza danneggiare le strutture native dell'anatra.

Ciò è confermato da Carmen Dye, che mette in risalto anche le strutture duttili. È anche possibile utilizzare questo metodo per la somministrazione di molecole terapeutiche come l'irna alle cellule duttali. Nell'immagine mostrata qui, è stato iniettato un irna marcato in fluorescenza che ha come bersaglio la fillina falciforme, un gene non essenziale e poi il tessuto è stato ripreso 48 ore dopo per mostrare la localizzazione delle molecole.

Seguendo questa procedura. Altri metodi, come il knockdown di SRNA, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative al ruolo di un particolare gene nello sviluppo della memoria o nella tumorgenesi.