Su larga scala Knockdown Gene in C. elegans Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire screening di interferenza dell'RNA su larga scala in C elegance utilizzando una libreria di alimentazione di RNA DS batterico per abbattere l'espressione genica. Ciò si ottiene coltivando prima cloni batterici da una libreria di RNA DS. In condizioni di crescita che prevengono la perdita di plasmidi, iniziare duplicando ciascuna piastra di libreria primaria e quindi utilizzando la piastra di libreria duplicata a 96 pozzetti per generare steli temporanei di batteri su piastre omni di agar.

I batteri di queste piastre omnidirezionali vengono coltivati durante la notte in coltura liquida e successivamente trasferiti sulla superficie delle piastre di alimentazione dei vermi. Ogni clone batterico della libreria porta un plasmide codificante D-S-R-N-A unico che ha come bersaglio un gene C elgan per il knockdown. Il secondo passo consiste nel posizionare i vermi sincronizzati sulle piastre di alimentazione.

Successivamente, i vermi vengono coltivati per diversi giorni in una camera umidificata a 20 gradi Celsius. Mentre i vermi si nutrono dei batteri, gli RNA DS indotti vengono rilasciati nell'intestino dell'animale dove poi si diffondono ai tessuti circostanti per causare effetti di knockdown sistemico. Il passo finale consiste nell'esaminare gli animali alimentati per gli effetti fenotipici causati dal knockdown specifico del gene.

Questi saggi fenotipici vengono utilizzati per identificare geni importanti per il processo biologico in studio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microiniezione di RNA a filamento doppietto nella gonade del verme è che è ad alto rendimento. Utilizzando le librerie di alimentazione, possiamo esaminare la funzione biologica di quasi tutti i geni dell'elgin marino nel giro di poche settimane.

Molti laboratori hanno lottato con questo approccio knockdown perché la maggior parte dei geni e l'eleganza C sono aplosufficienti. E quindi il knockdown dell'RNA deve diminuire l'espressione genica di oltre il 50% per produrre fenotipi con perdita di funzione. Per garantire un robusto knockdown genico, è fondamentale che tutti i batteri somministrati ai vermi esprimano il plasmide RNA a doppio filamento.

Per iniziare la procedura per determinare la perdita di plasmidi, rimuovere un piccolo campione di batteri come descritto in ogni passaggio pertinente e aggiungerlo a 450 microlitri di acqua sterile. Utilizzare 100 microlitri di questo campione diluito per creare ulteriori diluizioni seriali utilizzando acqua sterile. Mescolare accuratamente le soluzioni tra una diluizione e l'altra.

Distribuire 100 microlitri di ciascuna diluizione sulle piastre LB e LB AMP e incubare per una notte a 37 gradi Celsius del giorno successivo, identificare la piastra LB che contiene tra le 100 e le 500 colonie batteriche. Contare il numero di colonie su questa piastra e sulla corrispondente piastra amp lb contenente la stessa diluizione di batteri. Determinare la perdita di plasmidi utilizzando questa equazione.

La percentuale di batteri che non contengono il plasmide viene calcolata sottraendo il numero di colonie sulla piastra LB amp dal numero di colonie sulla piastra LB, dividendo per il numero di colonie sulla piastra LB e moltiplicando per 100 La perdita di plasmidi è prevenuta dalla crescita di batteri in alte concentrazioni di sellina carbonica per un abbattimento efficace. Verificare la perdita di plasmidi prima di somministrare gli animali e continuare solo se la perdita di plasmidi è inferiore al 15%Iniziare questa procedura rimuovendo le piastre di libreria duplicate dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi. Togliete il sigillo di alluminio mentre le colture sono ancora congelate.

Riposizionare il coperchio di plastica delle piastre e posizionare le piastre della libreria duplicate su una superficie piana per scongelarle a temperatura ambiente per non più di 30 minuti. Sterilizzare il replicatore buccale a 96 pin. Metterlo in un bagno di etanolo e poi bruciare l'etanolo.

Rivestire i perni con un panino e un bruciatore. Lasciare che la fiamma si spenga e poi ripetere. I perni di un replicatore pulito devono essere risciacquati con acqua distillata e poi sterilizzati prima di ogni utilizzo.

Posizionare il replicatore sterilizzato nei pozzetti della piastra duplicata scongelata e utilizzarlo per mescolare delicatamente le colture. Piccoli volumi di coltura aderiranno ai pin del replicatore. Rimuovere con cautela il replicatore dai pozzetti della piastra duplicata e posizionarlo delicatamente sulla superficie della piastra omnidirezionale.

Fare attenzione a non perforare la superficie dell'agar. Lasciare il replicatore sulla superficie della piastra omnidirezionale per tre o quattro secondi in modo che i batteri provenienti dai pin del replicatore vengano trasferiti sulla superficie dell'agar. Per prevenire la perdita di plasmidi su terreni solidi, l'ATE contiene due milligrammi per millilitro.

Vendita carbonica. Rimuovere il replicatore e lasciare che il piccolo volume di coltura batterica venga assorbito nell'agar. Dopo che entrambe le piastre sono state duplicate.

Incubare le piastre omni capovolte per 15-18 ore a 37 gradi Celsius la mattina seguente. Queste piastre omnidirezionali possono essere utilizzate per inoculare colture liquide a 96 pozzetti o conservate fino a sette giorni a quattro gradi Celsius. I batteri per l'alimentazione dei vermi vengono preparati come colture liquide utilizzando i batteri delle piastre omni utilizzando un pipettatore ripetuto e una punta combinata da 50 millilitri, erogando un millilitro di terreno di crescita batterica in ogni due millilitri.

Il pozzetto profondo di una piastra a 96 pozzetti sterilizza il replicatore e lo posiziona sulla superficie di una piastra omnidirezionale contenente colonie batteriche, assicurandosi che i perni siano a contatto con ciascuna delle 96 colonie batteriche. Spostare con cautela il replicatore dalla superficie della piastra omnidirezionale alla piastra a pozzetti profondi, assicurandosi che i perni non raschino i lati dei pozzetti profondi fino a quando non vengono immersi nel terreno di coltura. Per rimuovere i batteri nel terreno di coltura.

Muovere lentamente il replicatore con un movimento quadrato seguendo la parete interna della piastra a pozzetti profondi. Fare attenzione a non schizzare e contaminare i pozzi. Per ogni piastra di coltura a 96 pozzetti profondi devono essere inclusi due controlli.

Batteri che esprimono DS RNA come controllo positivo per il knockdown previsto, fenotipo e batteri contenenti un vettore di DS RNA vuoto come controllo negativo. Utilizzando un circuito di inoculazione sterile, rimuovere una singola colonia isolata dalla piastra di controllo positivo e inoculare un pozzetto vuoto nel pozzetto profondo chiamato piastra. Registrare la posizione del pozzetto che è stato inoculato.

Ripetere per il controllo negativo. Agitare le piastre a pozzetti profondi in posizione piana a 650 giri/min su un micro agitatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna delle colture, i batteri provenienti dalle 96 piastre a pozzetti profondi saranno trasferiti a 12.

Il trasferimento delle piastre di alimentazione dei pozzi può essere effettuato quattro pozzetti alla volta. Posizionare i puntali delle pipette su ogni terzo canale di una pipetta multicanale a 12 canali. Rimuovere 150 microlitri di coltura batterica dalla piastra a pozzetti profondi ed espellerli sulla superficie di quattro pozzetti della piastra di alimentazione a 12 pozzetti.

È importante non perforare la superficie dell'agar durante il trasferimento poiché i vermi si insinueranno e non si nutriranno dei batteri che esprimono l'RNA DS. Dopo il trasferimento di ogni serie di quattro pozzetti, sostituire i quattro puntali delle pipette con quattro nuovi puntali sterili e seminare i quattro pozzetti successivi della piastra di alimentazione: conservare le piastre seminate in posizione verticale al buio a temperatura ambiente per una notte in modo che i batteri possano essere assorbiti nell'agar. Prima di trasferire L, una larva di C elgan ha arrestato su piastre di alimentazione DS RNA per uno screening di alimentazione.

Deve essere determinata la concentrazione delle larve arrestate precedentemente preparate. Mescolare il pallone di erlenmeyer contenente le larve di L one arrestate per distribuire gli animali. Quindi rimuovere un'aliquota da 10 microlitri e posizionarla goccia a goccia su una piastra NGM di sei centimetri non posizionata.

In quattro o cinque gocce al centro del piatto. Assicurarsi che tutto il terreno sia espulso dalla pipetta. Utilizzando l'estremità del puntale della pipetta, stendere i punti di sospensione di vite senza fine per formare un'unica linea continua di liquido che si estende per il diametro della piastra.

Utilizzando un microscopio da dissezione, contare tutti gli animali iniziando da un'estremità della linea di liquido e continuando fino all'altra estremità prima che il liquido sia stato assorbito nella piastra e gli animali si disperdano. Ciò può richiedere una costante rifocalizzazione dell'oscilloscopio di dissezione per essere certi che non vengano persi animali. Ripetere questa procedura di conteggio per tre aliquote separate da 10 microlitri per determinare il numero medio di vermi per microlitro di sospensione di vermi e registrare questo numero direttamente sul pallone di erlenmeyer.

Per iniziare la schermata di alimentazione, utilizzare la sospensione di L one larve arrestate e acqua sterile per preparare una soluzione contenente 2000 vermi per millilitro. Ogni piastra di alimentazione a 12 pozzetti richiederà 120 microlitri di questa sospensione di vermi miscelata accuratamente per garantire una distribuzione uniforme degli animali e trasferire gli animali in un serbatoio sterile per il pipettaggio. Utilizzando la pipetta multicanale con puntali in ogni terza posizione, trasferire 10 microlitri di soluzione di verme direttamente sul prato batterico delle piastre di alimentazione.

Fare attenzione a non perforare la superficie dell'agar poiché i vermi si insinueranno nell'agar e non si nutriranno dei batteri che esprimono il D-S-R-N-A. Dopo aver trasferito la soluzione di verme ogni due file di piastre di alimentazione, rimescolare la soluzione di vermi nel serbatoio facendola scorrere delicatamente mentre i vermi si depositano rapidamente, esaminare alcuni pozzetti all'inizio sotto l'ambito di dissezione per assicurarsi che ogni pozzetto riceva da 20 a 30 vermi. Una volta che tutte le piastre di alimentazione hanno i vermi, conservare le piastre in posizione verticale in una scatola umidificata in un'incubatrice a 20 gradi Celsius il giorno successivo dopo che la sospensione del verme è stata assorbita nella piastra, capovolgere le piastre e tornare all'humidor a 20 gradi Celsius.

Gli animali su queste piastre possono essere osservati dopo tre giorni per i fenotipi P zero e poi di nuovo dopo sei giorni per i fenotipi F1. Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per testare quattro geni per l'uovo knockdown L 30 dumpy 17, PAT 10 e su quattro uova L 30 e su quattro sono espressi nel sistema nervoso. Pat 10 è espresso nel muscolo della parete corporea e Dumpy 17 è espresso nelle cellule epidermiche.

I mutanti Erie one Lin 15 B sono stati utilizzati negli schermi a causa della loro maggiore sensibilità all'RNAi come controllo negativo. I vermi sono stati alimentati con batteri contenenti il plasmide PL 44 40 vuoto che non esprimeva un RNA DS come previsto. Gli animali RIE 15 B alimentati con batteri contenenti nel plasmide vuoto non hanno mostrato alcun difetto morfologico o comportamentale.

Questa fotografia mostra animali che si muovono liberamente, come evidenziato dalla loro normale postura del corpo. La freccia nera indica la posizione di un giovane animale adulto. La freccia bianca indica la posizione di un gruppo di uova deposte.

Il comportamento normale dei vermi è mostrato in questo video clip l'uovo L 30 codifica l'orto marino della subunità della proteina G alfa Q.Quando L uno stadio Erie uno Lin 15 B larve sono state alimentate con batteri che esprimono l'uovo L 30 DS RNA. Le larve sono cresciute fino a diventare adulte che mostravano evidenti difetti nella locomozione e nel comportamento di deposizione delle uova. Dopo tre giorni, il 100% degli animali alimentati con DS RNA contro l'uovo L 30 erano paralizzati e incapaci di deporre le uova.

Questa fotografia mostra che tutti gli animali hanno adottato un aspetto rigido tipico degli animali paralizzati. Da notare anche la completa assenza di uova deposte nel piatto. Dumpy 17 codifica per una proteina di collagene necessaria per la formazione delle cuticole in mare.

I mutanti nulli Elgan e Dumpy 17 sono più corti e più grassi degli animali selvatici. In questo esperimento, non sono stati osservati difetti morfologici negli animali P zero alimentati con dumpy 17 D-S-R-N-A. Tuttavia, il 98% degli animali F1, come mostrato in questa figura, mostrava il fenotipo dumpy.

Si noti che gli animali adulti sul campo, uno dei quali è contrassegnato dalla freccia, sono più corti e più grassi dell'animale adulto contrassegnato dalla freccia nera. Nel pannello A.La mancanza di animali P zero bassi e grassi indica che la funzione del gene dumpy 17 è necessaria nei primi stadi larvali per una corretta morfologia corporea. Pat 10 codifica la proteina CA della troponina muscolare della parete corporea contenente quattro motivi EF per le mani che legano il calcio.

In questo studio è stato osservato che il 100% degli animali Erie one Lin 15 B alimentati con Pat 10 DS RNA si è paralizzato entro tre giorni e non ha deposto uova, portando a un fenotipo letale. Si noti che, sebbene gli animali siano paralizzati, possono ancora muovere i muscoli della testa per nutrirsi, come indicato dall'eliminazione dei batteri vicino alla testa contrassegnata dalla freccia su quattro codici, una proteina del dominio omeogenico espressa nei motoneuroni del cordone ventrale ed è necessaria per un corretto input sinaptico. La scelta su quattro è stata scelta come gene di prova in questo studio perché ha dimostrato di essere resistente alle precedenti strategie di alimentazione dell'RNA DS.

I risultati di questo studio hanno mostrato che il 62% degli animali alimentati con quattro batteri che esprimono RNA DS dalla preparazione della libreria hanno mostrato difetti nel comportamento di locomozione rispetto agli animali selvatici che indietreggiano liberamente in un movimento sinusoidale quando vengono pungolati sulla testa, UNC quattro mutanti nulli non indietreggiano, ma invece contraggono il loro strettamente causando un flessore dorsale, che spesso diventa così estremo che la testa e la coda dell'animale si toccano mettendo il corpo in una posizione arrotolata. Questa tabella mostra la percentuale di animali che mostrano fenotipi nulli simili quando alimentati con RNA DS contro ciascuno dei quattro geni testati 100 animali sono stati esaminati per ogni esperimento di knockdown. Questi risultati dimostrano l'importanza della ritenzione plasmidica per il successo dell'RNA DS.

Fenotipi di perdita di funzione robusti e altamente penetranti possono essere osservati in tutti i tessuti. Quando tutti i batteri somministrati ai vermi esprimono l'RNA DS Una volta padroneggiato, l'intera libreria alimentare può essere esaminata da una persona in circa due mesi. Per migliorare la produttività, testiamo ogni clone batterico solo una volta in uno screening di alimentazione.

Tutti i geni identificati nel primo passaggio attraverso la libreria vengono quindi ritestati. In triplicato, insistiamo sul fatto che il fenotipo desiderato viene osservato in tutti i retest affinché il gene sia quadrato come un risultato positivo. Il plasmide viene quindi purificato dai batteri e sequenziato per verificare l'identità del gene codificato.

Una volta identificato un gene, ordiniamo un mutante L se disponibile e lo testiamo per il fenotipo desiderato prima di eseguire qualsiasi ulteriore caratterizzazione del gene.