Name: Su larga scala Knockdown Gene in C. elegans Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: Impara a eseguire screening RNAi su larga scala in C. elegans utilizzando librerie di alimentazione batterica con dsRNA. Questo metodo migliora l'efficienza del knockdown genico e la riproducibilità dei risultati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dal National Institutes of Health MH097163. Alcuni ceppi sono stati forniti dalla CGC, che è finanziato dall&#39;Ufficio NIH di programmi di infrastrutture di ricerca (P40-OD010440).

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo descritto un protocollo che utilizza una libreria alimentazione dsRNA disponibile in commercio per eseguire schermi di grandi dimensioni in C. elegans. Forniamo tutte le istruzioni per duplicare la biblioteca e per usarlo in modo efficace. Abbiamo dimostrato che questo approccio è in grado di identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici in differenti tessuti dell&#39;animale. Mentre i fenotipi che descriviamo qui sono facilmente osservabili (Unc, Egl, e Dpy), questo protocollo può essere ...

Storicamente, gli schermi genetiche in C. elegans sono state effettuate considerando gli animali con un mutageno chimico come metansolfonato etilico per creare mutazioni casuali entro DNA. Progenie o grandprogeny di animali mutagenizzate vengono poi isolate che mostrano un fenotipo anormale se lo desideri. La mutazione responsabile per provocare il fenotipo viene quindi identificato mediante una procedura di mappatura laborioso o mediante sequenziamento dell&#39;intero genoma del verme mutante. Ci sono molti vantaggi per l&#39;esecuzione di tali schermi di mutagenesi chimica creano lesioni permanenti all&#39;interno del genoma worm che possono provocare entrambi i fenotipi guadagno-di-funzione e perdita di funzione, ma la procedura di mappatura è lento e costoso. Double-stranded RNA interference (dsRNAi) fornisce un mezzo alternativo per identificare i geni coinvolti in importanti processi biologici. In questo metodo, dsRNA corrispondente alla sequenza codificante di un gene endogeno viene introdotto nel verme.Il dsRNA viene elaborato in vivo di generare piccole (21-22 nucleotidi) RNA che fungono da guida per trovare e fermare il mRNA endogeni corrispondenti, rivolgersi a loro per la distruzione 1. Questa procedura è relativamente breve, ma perché dsRNA obiettivi mRNA anziché DNA, solo fenotipi riduzione di funzione sono osservati utilizzando questo approccio. Introduzione di dsRNA in un animale può essere ottenuto mediante iniezione diretta di dsRNA 2, immergendo animali in dsRNA 3, o somministrate animali batteri che esprimono dsRNA 4. Ciascuno di questi metodi di consegna causare effetti atterramento sistemici come la maggior parte delle cellule dell&#39;animale esprimono SID-1, un canale transmembrana in grado di importare dsRNA 5. Originariamente utilizzato come un approccio di genetica inversa per knockdown l&#39;espressione di diversi geni uno alla volta, lo sviluppo di due librerie di alimentazione permette ora schermi genetici su larga scala. Le librerie dsRNA disponibili in commercio contengono bacloni cterial che rappresentano sia il 55% o il 87% di tutti i C. elegans geni 6, 7. Purtroppo, su larga scala schermi di alimentazione dsRNAi spesso sfociano in efficienza atterramento variabili 8-10. Mentre il livello assoluto di atterramento da RNAi non è facilmente misurabile, l&#39;efficienza atterramento riduzione osservata in schermi di grandi dimensioni deve essere causata da mRNA specifico gene residue che sfuggono alla degradazione da RNAi. Questo, a sua volta, potrebbe essere un risultato diretto di dsRNA perdita plasmidico da batteri somministrati ad animali in queste schermate. A supporto di questa idea, animali alimentati con miscele di batteri, in cui solo il 50% dei batteri esprimono dsRNAs contro un gene targeting, mostrano drasticamente ridotto (eventuali) effetti knockdown rispetto agli animali di controllo alimentati 11. L&#39;entità del gene knockdown diventa un problema critico durante l&#39;esecuzione di schermi dsRNAi come la maggior parte dei geni di C. elegans sono haplosufficient e quindi l&#39;espressione genica devono essere ridotte almeno del 50% to causare la perdita-di-funzione fenotipi 12. Abbiamo usato protocolli di alimentazione precedentemente pubblicati effettuare schermi di grandi dimensioni e trovato gli stessi effetti smontabili variabili riportati da altri 8-10. In una ricerca di possibili cause, abbiamo riscontrato che quasi il 60% dei batteri alimentati agli animali nella schermata aveva perso il plasmide dsRNA. Abbiamo sviluppato una duplicazione e di screening protocollo biblioteca che riduce drasticamente o elimina la perdita di plasmide e migliora notevolmente l&#39;efficienza knockdown. Questo protocollo è adatto per l&#39;esecuzione di schermi di grandi dimensioni in C. elegans e può essere usata per selezionare uno dei due librerie dsRNA disponibili in commercio. Usando questo protocollo, troviamo che sostanzialmente il 100% dei batteri somministrati ad animali durante la schermata mantenere il plasmide dsRNA-codifica e causare la perdita robusto e altamente penetrante dei fenotipi funzione in tutti i tessuti esaminati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>96-well Falcon flat bottom </td> plate <td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>foglio adesivo</td> sterile <td>USA Scientific</td><td>2923-0100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc omniplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml profondo 96-well polipropilene Masterblock</td><td>USA Scientific</td><td>5678-0285</td><td>coperchi autoclavabili</td></tr><tr><td>per piastre a pozzetti profondi</td><td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml combitips</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>confezionati singolarmente</td></tr><tr><td>Reservoir</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>autoclavabili</td></tr><tr><td>piastre a 12 pozzetti</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td> libreria <td></td></tr><tr><td>di alimentazione dsRNA</td> confezionata singolarmente <td>OpenBiosystems</td><td>RCE1181</td><td>negozio -80 C</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td></td><td></td><td>consentire 2-4 settimane per la consegna <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td></tr><tr><td>Batteriolgico Agar Ultrapuro grado A </td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>per piastre</td></tr><tr> a vite senza fine<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Rullo Brayer</td><td>USA Scientific</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&#8211; replicatore kel a 96 pin</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>microshaker autoclavabile</td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>1231A93</td> pipetta multicanale <td>a 12 canali con orbita da 3 mm</td></tr><tr><td>(0,5-10 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>pipetta multicanale a 12 canali (30-300 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>Repeater Plus pipettatore manuale</td><td>USA Scientific</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

su larga scala knockdown gene in<em&gt; c. elegans</em&gt; utilizzo di librerie di alimentazione dsrna per generare fenotipi robusti perdita di funzione

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference alimentando worm batteri che esprimono dsRNAs è stato uno strumento utile per valutare la funzione del gene in C. elegans. Mentre questa strategia funziona bene quando un piccolo numero di geni sono mirati per atterramento, schermi alimentazione larga scala mostrano efficienze abbattibili variabili, che limita la loro utilità. Abbiamo decostruito protocolli smontabili RNAi precedentemente pubblicati e trovato che la fonte primaria del knockdown ridotta può essere attribuita alla perdita di plasmidi codificanti dsRNA dai batteri somministrati agli animali. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo sviluppato un protocollo di alimentazione dsRNA che riduce notevolmente o elimina la perdita di plasmide per ottenere efficienza, alta knockdown produttività. Abbiamo dimostrato che questo protocollo produrrà robusto, colpo riproducibile giù di C. elegans geni in diversi tipi di tessuto, tra cui i neuroni, e consentiranno atterramento efficiente in schermi di grandi dimensioni. Questo protocollo utilizza un&#39;alimentazione dsRNA disponibile in commerciobiblioteca e descrive tutti i passi necessari per duplicare la libreria ed eseguire schermi dsRNA. Il protocollo non richiede l&#39;uso di attrezzature sofisticate, e può pertanto essere eseguita con qualsiasi C. elegans laboratorio.

P0 fenotipo knockdown inizieranno ad apparire dopo 2-3 giorni di alimentazione degli animali dsRNA esprimere batteri. Alcuni primi fenotipi includono arresto larvale e mortalità e devono essere osservate nel 2-3% di tutti i pozzetti di alimentazione. Questi stessi fenotipi saranno osservati negli animali generazione F1. La presenza di uova di F1 che non riescono a schiudersi è un altro fenotipo F1 comune, e, insieme, sarà osservato questi tre fenotipi in quasi il 10% di tutti i pozzetti, le schermate di F1. <p class...

Mentre dsRNA alimentazione in C. elegans è un potente strumento per valutare la funzione del gene, i protocolli attuali schermi di alimentazione su larga scala producono efficienze atterramento variabili. Descriviamo un protocollo migliorato per eseguire larga scala RNAi schermi alimentazione che si traduce in knockdown altamente efficace e riproducibile di espressione genica.

Su larga scala Knockdown Gene in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire schermate su larga scala di interferenza dell'RNA in C. elegans, utilizzando una libreria batterica di alimentazione con RNA a doppio filamento (DS RNA) per ridurre l'espressione genica. Questo viene realizzato innanzitutto coltivando cloni batterici da una libreria di RNA a doppio filamento. In condizioni di crescita che prevengono la perdita del plasmide, si inizia duplicando ciascuna piastra primaria della libreria, quindi si utilizza la piastra duplicata a 96 pozzetti per generare colture temporanee di batteri su piastre di agar omni.I batteri provenienti da queste piastre omni vengono coltivati per tutta la notte in coltura liquida e successivamente trasferiti sulla superficie delle piastre di alimentazione per i vermi. Ogni clone batterico della libreria contiene un plasmide di codifica D-S-R-N-A unico che mira a un singolo gene di C. elegans per l'abbattimento dell'espressione genica. Il secondo passaggio consiste nel posizionare vermi sincronizzati sulle piastre di alimentazione.Successivamente, i vermi vengono allevati per diversi giorni in una camera umidificata a 20 gradi Celsius. Mentre i vermi si nutrono dei batteri,

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