Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare la tecnica di colorazione con Gold G Cox per visualizzare i cambiamenti morfologici nei neuroni che seguono la stimolazione tattile nei primi stadi della vita. Ciò viene ottenuto innanzitutto somministrando la stimolazione tattile tre volte al giorno dal terzo giorno postnatale fino al giorno postnatale 21. Il secondo passaggio consiste nel perfondere gli animali una volta raggiunta l'età di interesse e conservare i loro cervelli in soluzione di Goldy cos.

Successivamente, i cervelli vengono tagliati con Aome. L'ultimo passaggio consiste nell'impregnare i cervelli con la tecnica di colorazione co-GOGI. In definitiva, la procedura co-GOGI viene utilizzata per visualizzare i singoli neuroni, consentendo l'analisi dei cambiamenti morfologici.

La bellezza della tecnica di Goy Cox è che ci permette di quantificare la struttura dei neuroni e di correlatarla con esiti comportamentali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono ai disturbi dello sviluppo, poiché è stato dimostrato che la stimolazione tattile è efficace sia nel recupero comportamentale che in quello anatomico da tali disturbi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione neuroanatomica dei ratti, può essere applicato anche ad altri organismi modello e al tessuto cerebrale umano.

Per approfondire la comprensione della plasticità dipendente dall'esperienza, gli animali vengono mantenuti in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, con libero accesso a cibo e acqua dopo la nascita. Ogni ratto femmina viene alloggiato singolarmente con la propria prole. Per evitare ulteriori stress legati al manipolamento, i piccoli ricevono stimolazione tattile a partire dal giorno P3.

Dopo aver pesato i piccoli prima della sessione mattutina di stimolazione tattile, trasportarli nelle loro gabbie di casa in una stanza separata per i test. Posizionare la gabbia di casa su un tappetino riscaldante impostato a 24 gradi Celsius. Quando si è pronti per la stimolazione tattile, rimuovere le madri dalla loro gabbia di casa e collocarle in una gabbia temporanea con cibo e acqua.

Mantenere la madre e la gabbia temporanea nella stanza di allevamento. Successivamente, utilizzare un cartone rigido per dividere la gabbia principale in due metà. Assegnare quindi casualmente metà dei cuccioli di ciascuna nidiata a subire una stimolazione tattile, mentre l'altra metà fungerà da controllo.

Contrassegnare le zampe posteriori e la coda con un pennarello indelebile per differenziare i gruppi e posizionare i cuccioli nel gruppo di stimolazione tattile da un lato della gabbia e i cuccioli di controllo dall'altro. Impostare un timer di 15 minuti utilizzando un pennello morbido simile a un piumino. Spazzolare tutti i cuccioli del gruppo di stimolazione tattile contemporaneamente per 15 minuti consecutivi.

I rattoletti giovani di solito si raggruppano e sembrano entrare in un ciclo di sonno profondo, rendendo molto facile stimolare tutti i piccoli contemporaneamente. Con l'avanzare dell'età, diventano più attivi, con alcuni rattoletti che iniziano a camminare e a esplorare. Durante la sessione, spostare i piccoli che si allontanano nuovamente nel gruppo per garantire che ciascun rattoletto riceva una stimolazione uniforme.

Dopo 15 minuti di stimolazione tattile, riportare la madre nella gabbia e trasportare la gabbia nuovamente nella stanza di allevamento. Questo processo viene ripetuto tre volte al giorno per 19 giorni. Dopo l'ultima sessione di stimolazione tattile, svezzare i piccoli dalle loro madri. I piccoli vengono alloggiati in gabbie con altri cinque o sei animali dello stesso sesso già svezzati, lasciando i ratti indisturbati in condizioni standard di allevamento fino al raggiungimento dell'età richiesta per lo studio.

I campioni vengono raccolti quando gli animali raggiungono l'età di 100 giorni. Dopo eutanasia e perfusione intracardiaca, si estrae il cervello, avendo cura di mantenere il cervelletto integro.

Posizionare i cervelli in un contenitore Nalgene opaco riempito con 20 millilitri di soluzione Goldy Cox, dove vengono mantenuti per 14 giorni. Dopo 14 giorni, sostituire la soluzione con una soluzione di saccarosio al 30%. Mantenere i cervelli nella soluzione di saccarosio da due a cinque giorni prima del taglio per sezionamento.

Asciugare delicatamente il cervello prima di fissarlo su un supporto per sezionamento con colla acrilica Sano, per evitare strappi o sezionamento irregolare; assicurarsi che l'intero cervello sia saldamente fissato al supporto. Successivamente, riempire il serbatoio del Vibram con soluzione di saccarosio al 6% fino a coprire la lama di sezionamento. Impostare la velocità e l'ampiezza del Vibram su cinque.

Tagliare il cervello in sezioni di 200 micron e posizionare le sezioni su un vetrino microscopico gelatinizzato al 2%. Assicurarsi di mantenere le sezioni umide durante tutta la procedura, una volta raccolte tutte le sezioni di interesse. Premere le sezioni sui vetrini esercitando una pressione con carta assorbente inumidita.

Posizionare i vetrini su un portavetrini e conservarli in una camera umida per almeno 12 ore, ma non più di quattro giorni. Per iniziare la procedura di colorazione, etichettare e preparare 12 recipienti di vetro per colorazione. Immergere innanzitutto i vetrini in acqua distillata per un minuto.

Successivamente, posizionare i vetrini in idrossido di ammonio e mantenerli al buio per 30 minuti. Dopo un ulteriore minuto in acqua distillata, immergere i vetrini nel fisso Kodak per 30 minuti proteggendoli dalla luce. Immergere nuovamente i vetrini in acqua distillata prima della disidratazione mediante una serie di soluzioni alcoliche a concentrazione crescente.

Dopo l'ultimo lavaggio con alcol, immergere i vetrini in una soluzione a un terzo per 15 minuti. Infine, immergere i vetrini in hemo D per 15 minuti. Quando pronti, utilizzare paramount per applicare i coprioggetti sui vetrini e lasciare asciugare all'aria prima di esaminarli al microscopio.

Di seguito è riportata una fotografia rappresentativa di un neurone parametale colorato con metodo di Golgi-Cox in un ratto che ha ricevuto stimolazione tattile durante lo sviluppo. Un'immagine ingrandita mostra le spine dendritiche sui dendriti terminali. L'immagine più chiara a sinistra proviene da un ratto del gruppo di controllo, mentre l'immagine più scura proviene da un ratto sottoposto a stimolazione tattile.

Questo grafico rappresenta la complessità dendritica apicale e basale media dei neuroni dell'area CG tre di ratti adulti che hanno ricevuto o meno stimolazione tattile durante lo sviluppo. Seguendo questa procedura, abbiamo il vantaggio che, qualora volessimo porre ulteriori domande, abbiamo già colorato l'intero cervello e quindi possiamo tornare indietro ed utilizzare lo stesso tessuto cerebrale per rispondere a tali domande. Sviluppando queste tecniche, abbiamo aperto la strada ai ricercatori per esplorare l'utilità della stimolazione tattile come terapia nel trattamento dei traumi cranici o di altre forme di lesioni neurologiche dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorarne il potenziale nel trattare traumi cerebrali e disturbi dello sviluppo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come fornire ai cuccioli un'esperienza arricchente di stimolazione tattile, nonché di un metodo per visualizzare singoli neuroni e sinapsi.