Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare le tecniche di colorazione dell'oro G Cox per visualizzare i cambiamenti morfologici nei neuroni che seguono la stimolazione tattile all'inizio della vita. Ciò si ottiene somministrando prima la stimolazione tattile tre volte al giorno dal terzo giorno postnatale al 21° giorno postnatale. Il secondo passo è quello di perfondere gli animali una volta raggiunta l'età dell'indagine e conservare i loro cervelli in una soluzione di Goldy cos.

Successivamente, i cervelli vengono affettati con Aome. Il passaggio finale consiste nell'impregnare il cervello con la tecnica di colorazione co GOGI. In definitiva, la procedura CO GOGI viene utilizzata per visualizzare i singoli neuroni, il che consente l'analisi dei cambiamenti morfologici.

La bellezza della tecnica di Goy Cox è che ci permette di quantificare la struttura dei neuroni e correlarla con i risultati comportamentali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono ai disturbi dello sviluppo poiché la stimolazione tattile ha dimostrato di essere efficace sia nel recupero comportamentale che anatomico da questi disturbi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla neuroanatomia dei ratti, può essere applicato anche ad altri organismi modello e al tessuto cerebrale umano.

Per aiutarci a comprendere meglio la plasticità dipendente sperimentata, gli animali vengono mantenuti in un ciclo di luce-buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua dopo la nascita. Ogni ratto femmina è alloggiato individualmente con la propria prole. Per evitare ulteriore stress legato alla manipolazione, i cuccioli ricevono una stimolazione tattile a partire dal terzo posto.

Dopo aver pesato i cuccioli prima della sessione di stimolazione tattile mattutina, trasporta i cuccioli nelle loro gabbie domestiche in una sala prove separata. Posiziona la gabbia domestica su un termoforo impostato a 24 gradi Celsius. Quando sono pronti per la stimolazione tattile, rimuovere le dighe dalla gabbia di casa e metterle in una gabbia temporanea con cibo e acqua.

Tenere la madre e la gabbia temporanea nella sala di riproduzione. Quindi, usa una tavola rigida per dividere la gabbia di casa in due metà. Quindi assegna in modo casuale metà dei cuccioli di ogni cucciolata per sottoporsi alla stimolazione tattile con l'altra metà che funge da controllo.

Contrassegna le zampe posteriori e la coda con un pennarello indelebile per differenziare i gruppi e posizionare i cuccioli nel gruppo di stimolazione tattile in un lato della gabbia e i cuccioli di controllo nell'altro. Imposta un timer su 15 minuti usando una piuma morbida come uno spolverino. Spazzolare contemporaneamente tutti i cuccioli del gruppo di stimolazione tattile per 15 minuti consecutivi.

I giovani cuccioli di ratto di solito si stringono insieme e sembrano entrare in un ciclo di sonno profondo, rendendo molto facile stimolare tutti i cuccioli contemporaneamente. Man mano che i cuccioli invecchiano, diventano più attivi con alcuni cuccioli che camminano e indagano. Durante la sessione, sposta tutti i cuccioli vaganti nel gruppo per assicurarti che ogni cucciolo riceva la stessa stimolazione.

Dopo 15 minuti di stimolazione tattile, riportare la madre nella gabbia e trasportare la gabbia nella sala di riproduzione. Questo processo viene ripetuto tre volte al giorno. Per 19 giorni Dopo l'ultima sessione di stimolazione tattile, svezzare i cuccioli dalle loro madri I cuccioli sono alloggiati in gabbie con altri cinque o sei animali svezzati dello stesso sesso e lasciano i ratti indisturbati in condizioni di stabulazione standard fino a quando non raggiungono l'età della ricerca.

I campioni vengono raccolti quando gli animali raggiungono i 100 giorni di età. Dopo l'eutanasia e la perfusione intracardiaca, il cervello viene estratto. Avendo cura di mantenere intatto il cervelletto.

Mettere il cervello in un flacone opaco di Nalgene riempito con 20 millilitri di soluzione di Goldy Cox, dove vengono conservati per 14 giorni. Dopo 14 giorni, sostituire la soluzione con una soluzione di saccarosio al 30%. Conservare il cervello in soluzione di saccarosio per due o cinque giorni prima di sezionare per sezionare.

Asciugare il cervello prima di fissarlo a una fase di sezionamento con la colla acrilica Sano per evitare strappi o sezioni irregolari, assicurarsi che l'intero cervello sia saldamente fissato al tavolino. Quindi, riempire il serbatoio Vibram con una soluzione di saccarosio al 6% fino a coprire la lama di sezionamento. Imposta la velocità e l'ampiezza del Vibram su cinque.

Tagliare il cervello in sezioni da 200 micron e posizionare le sezioni su un vetrino da microscopio gelatinizzato al 2%. Assicurarsi di mantenere le sezioni bagnate durante il corso del sezionamento, quando tutte le sezioni di interesse sono state raccolte. Premere le sezioni sui vetrini esercitando una pressione con carta inumidita.

Posizionare i vetrini in una rastrelliera per vetrini e conservarli in una camera di umidità per almeno 12 ore, ma non più di quattro giorni. Per iniziare la procedura di colorazione, etichettare e preparare 12 piatti per colorare il vetro. Per prima cosa, immergere i vetrini in acqua distillata per un minuto.

Quindi, posizionare i vetrini nell'idrossido di ammonio e tenerli al buio per 30 minuti. Dopo un ulteriore minuto in acqua distillata, posizionare i vetrini in Kodak Fix per 30 minuti con protezione dalla luce. Immergere nuovamente i vetrini in acqua distillata prima di disidratarli in una serie di soluzioni alcoliche graduate.

Dopo l'ultimo lavaggio con alcol, mettere i vetrini in un terzo di soluzione per 15 minuti. Infine, posizionare i vetrini nell'emo D per 15 minuti. Quando sei pronto, usa paramount per posizionare i vetrini coprioggetto sui vetrini e lasciare asciugare i vetrini all'aria prima di esaminarli con un microscopio.

Ecco una fotografia rappresentativa di un neurone parametallico colorato con Golgi Cox in un ratto che ha ricevuto stimolazione tattile durante lo sviluppo. Una fotografia ingrandita mostra spine dendritiche sui dendriti terminali. L'immagine più chiara a sinistra è di un ratto nel gruppo di controllo e l'immagine più scura è di un ratto che ha ricevuto la stimolazione tattile.

Questo grafico rappresenta la complessità dendritica apicale e bassale media per i neuroni nell'area CG 3 di ratti adulti che hanno ricevuto stimolazione tattile durante lo sviluppo o meno. Seguendo questa procedura, abbiamo il vantaggio che se vogliamo fare ulteriori domande, abbiamo colorato l'intero cervello e quindi possiamo tornare indietro e utilizzare lo stesso tessuto cerebrale per rispondere a quelle domande. Sviluppando queste tecniche, abbiamo spianato la strada ai ricercatori per esplorare l'utilità della stimolazione tattile come terapia per il trattamento del trauma cranico o di altre forme di lesioni neurologiche dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori di neuroscienze per esplorare il suo potenziale nel rimediare ai traumi cerebrali e ai disturbi dello sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fornire ai cuccioli avvolgenti l'esperienza arricchente della stimolazione tattile, nonché un mezzo con cui visualizzare i singoli neuroni e sinapsi.