Trapianti viso a

L'obiettivo generale di questa procedura è trapiantare il tessuto facciale del dominio anteriore estremo, o EAD, tra embrioni di Xenopus laevis. Questo viene realizzato rimuovendo innanzitutto il tessuto EAD dagli embrioni donatori e da quelli riceventi, aventi diversi background genetici. Successivamente, gli espianti di EAD provenienti dagli embrioni donatori vengono inseriti nei volti degli embrioni riceventi.

Nell'ultimo passaggio, gli embrioni trapiantati vengono mantenuti per 60-70 ore dopo la fecondazione per l'osservazione. Infine, la microscopia in campo chiaro e la microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per osservare i cambiamenti nello sviluppo craniofacciale degli animali trapiantati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo craniofacciale, migliorando la nostra comprensione delle malformazioni craniofacciali, come ad esempio nuovi segnali necessari per lo sviluppo orale che originano dal dominio anteriore estremo. Prima dell'operazione, caricare i tubi capillari nell'estrusore di aghi e quindi estrarre quattro-sei aghi, rompendo ciascun ago in modo che la porzione flessibile di vetro simile a un pelo lunga due-tre millimetri venga completamente rimossa.

La punta deve essere relativamente rigida, ma abbastanza stretta da poter essere utilizzata come strumento tagliente. Accendere quindi un becco Bunsen e inserire la punta di una pipetta di Pasteur in vetro nella parte blu della fiamma, ruotando la pipetta in modo che la punta si fonda e il foro si sigilli completamente, formando un'estremità chiusa e arrotondata. Per preparare i ponticelli di vetro, utilizzare pinze lunghe standard per staccare con attenzione frammenti di vetro coprioggetti di tre millimetri per tre millimetri.

Quindi afferrare il frammento di coprioggetto con una pinzetta e porre il vetro nella fiamma finché tutti e quattro i bordi si ammorbidiscono e si incurvano verso il basso, formando una piccola cupola di vetro. Successivamente, foderare una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri con argilla da modellare rossa, bianca o gialla. E riempire la piastra con 3%phi.

Preparare una soluzione XMBS 0,5. Quindi utilizzare la pastura infiammata, lo strumento tubo per pipetta, per creare da 40 a 60 depressioni superficiali di due-tre millimetri, profonde circa quanto il corpo di un embrione allo stadio 20, nell'argilla 48 ore prima dell'esperimento. Ottenere le uova dalle rane femmine e fecondarle in vitro.

Quindi, dopo aver iniettato gli embrioni con mRNA di membrana cappucciato, mRNA di GFP e qualsiasi altro trascritto, conservarli a 15 gradi Celsius per 48 ore fino a quando non raggiungono lo stadio 19-20. Nel giorno dell'esperimento di trapianto, utilizzare un microscopio a fluorescenza per selezionare gli embrioni iniettati che mostrano una fluorescenza brillante e uniforme. Dopo aver disinfettato la superficie operativa, il microscopio stereoscopico e gli strumenti con etanolo al 70%, utilizzare pinze Dumont n. 5/45 per rimuovere la membrana vitellina di ciascun embrione selezionato sotto un microscopio stereoscopico.

Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento graduata in plastica con la punta tagliata per spostare gli embrioni ospiti nella piastra operatoria. Fare attenzione a non far toccare gli embrioni all'interfaccia aria-acqua. Inserire gli embrioni con il lato posteriore rivolto verso il basso nelle depressioni di argilla e utilizzare la pinzetta per chiudere delicatamente l'argilla intorno alla base di ciascun embrione, lasciando sporgere la testa dalla depressione. Per rimuovere il donatore in posizione prona, inserire uno dei microago tirati nella testa dell'embrione a sinistra della ghiandola cementatrice abbastanza in profondità da farlo passare dall'esterno dell'embrione attraverso la testa e nel foregut anteriore.

Muovere rapidamente l'ago dal lato sinistro al lato destro della testa, attraverso tutta la larghezza della ghiandola cementatrice, per effettuare un taglio netto. Successivamente, posizionare l'ago all'inizio del taglio, al margine sinistro della ghiandola cementatrice, e muoverlo rapidamente verso l'alto fino a raggiungere la base dell'occhio sinistro, creando così un taglio verticale che va dal bordo sinistro della ghiandola cementatrice fino alla base dell'occhio sinistro. Poi, posizionare l'ago al margine destro della ghiandola cementatrice e muoverlo rapidamente verso l'alto fino a raggiungere la base dell'occhio destro, creando un taglio verticale che va dal bordo destro della ghiandola cementatrice fino alla base dell'occhio destro.

Quindi, per escindere completamente il tessuto, spostare l'ago dal basso dell'occhio sinistro al basso dell'occhio destro, creando un taglio orizzontale che liberi il tessuto. Ora spingere delicatamente il tessuto escisso sulla punta dell'ago e sollevarlo attraverso il buffer fino alla zona della piastra contenente gli embrioni ospiti. Escindere il tessuto dall'embrione ospite come appena dimostrato, scartando l'ospite, l'espianto di EAD e inserendo l'espianto del donatore nell'ospite completo risultante.

Una volta posizionato correttamente il tessuto donatore e inserito con attenzione, posizionare uno dei ponticelli di vetro precedentemente preparati sopra la faccia dell'embrione per mantenere il trapianto in sede, inserendo le estremità del ponticello nell'argilla per stabilizzarlo. Dopo l'intervento, lasciare gli embrioni a riposo, indisturbati, a temperatura ambiente per due o tre ore. Successivamente, una volta che i trapianti si sono rimarginati, rimuovere con cura i ponticelli di vetro dagli embrioni e l'argilla dalla base degli embrioni.

Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento graduata in plastica per aspirare delicatamente gli embrioni dalle loro depressioni. Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri opportunamente etichettata, riempita per metà con 0,1 XMBS fresco integrato con Gentamicina e coltivare gli embrioni a 15-18 gradi Celsius per diversi giorni, fino al raggiungimento dello stadio 40. Cambiare la soluzione MBS ogni giorno e osservare il tessuto trapiantato mediante fluorescenza per confermare che l'espianto rimanga saldamente in sede.

I tessuti trapiantati devono essere completamente inseriti nella testa dell'ospite dopo il trapianto, come appena dimostrato, e devono avere dimensioni corrette rispetto all'apertura dell'ospite affinché il trapianto abbia successo. Il tessuto EAD non deve sporgere in alcun modo dalla testa, come si può osservare in queste due immagini di espianti posizionati in modo errato. Inoltre, il trapianto del tessuto facciale non deve essere ruotato rispetto alla sua posizione originale nel corpo del donatore, come mostrato qui.

Dopo diverse ore, il tessuto trapiantato e la zona circostante del volto dovrebbero guarire, e già dal giorno successivo l'embrione dovrebbe apparire come mostrato nell'esempio riportato in queste immagini; come appena dimostrato, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per confermare che il trapianto è rimasto al suo posto durante il processo di guarigione. Allo stadio 42, il tessuto trapiantato di controllo contribuirà alla formazione della bocca e rimarrà fluorescente verde. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trapiantare il tessuto EAD da un embrione a un altro.

Facilitare l'uso di questo metodo per identificare quale foglietto germinale o regione dell'EAD sia più cruciale per lo sviluppo facciale.