Name: Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Scopri la dissezione e il montaggio laterale di embrioni di Danio rerio per visualizzare lo sviluppo del midollo spinale. Questa tecnica microscopica facilita lo studio dei processi di neurobiologia e differenziazione cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Skidmore Faculty Development Grant ha finanziato la preparazione e la pubblicazione di questo manoscritto.

1. Embrioni di montaggio (al completamento della tecnica di visualizzazione selezionato, quali immunocitochimica, ibridazione in situ, ecc) <ol><li> Posizionare embrioni in un piatto 35 millimetri Petri riempita con tampone di scelta (Figura 1A). La scelta del buffer è basata sulla procedura di etichettatura. Tipicamente buffer basati PBS sono adatti. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, e usando pinze, proteggere la testa con un paio di pinze mentre si tira il tuorlo via con l&#39;altra coppia (Figura 1B). In alternativa, utilizzare un perno insetto in un supporto del perno insetto per tirare delicatamente il tuorlo. </li><li> Utilizzando il poker embrione (lenza (diametro 0,41 millimetri) incollato, o un tubo capillare o una pipetta Pasteur) spostare gli embrioni ad una parte della piastra di Petri che non ha un sacco di tuorlo detriti (Figure 1C-D). </li><li> Usando una pipetta Pasteur di vetro, aspirare gli embrioni in meno liquido possibile, e gdipendentemente loro pipetta su un vetrino (Figura 1E). </li><li> Favorire la delicatezza di distanza il liquido in eccesso con un laboratorio wipe. Evitare il contatto con gli embrioni. </li><li> Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio agli embrioni. Per le etichette fluorescenti, usare un reagente antifade di scelta. Per segnali colorimetrici, 70% glicerolo può essere utilizzato come mezzo di montaggio. </li><li> Utilizzando il poker embrione, orientare gli embrioni sui loro lati a righe (Figura 1F). </li><li> Aggiungere un &quot;tocco&quot; di vaselina o grasso alto vuoto ad ogni angolo di un coprioggetto (Figura 1G). Questo previene i danni di embrione da eccessiva compressione. </li><li> Posizionare coprioggetto (lato vaselina basso) sulla parte superiore di embrioni (Figura 1H). </li><li> Battere delicatamente il vetrino in ogni angolo fino a quando il mezzo di montaggio (70% glicerolo o reagente di montaggio anti-fade) tocca il vetrino (Figura 1H). </li><li> Se necessario, aggiungere ulteriori supporti di montaggio pipettando proprio accanto alla coverslip, usando una pipetta nell&#39;intervallo 20-200 ml. Sarà dello stoppino sotto. </li><li> Utilizzando un laboratorio pulire, pulire completamente intorno al vetrino. Essere certi di non applicare pressione sul vetrino, in quanto questo potrebbe danneggiare gli embrioni. Questa area deve essere asciutta e non hanno alcun vaselina o supporti di montaggio su di esso. </li><li> Utilizzare smalto per sigillare intorno al bordo del vetrino (Figura 1I). </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

Non esistono interessi finanziari in competizione sia per autore.

Montaggio laterale di zebrafish embrioni aiuti visualizzazione fisso di sviluppo del midollo spinale. Attraverso la rimozione del pallone tuorlo, la distanza di lavoro richiesto per eccezionali immagini microscopiche è ridotta. I nostri risultati rappresentativi sono stati limitati alla fase 24 HPF, tuttavia, questa tecnica può essere usato già 18 HPF, sebbene embrioni anteriori sono più difficili da sezionare a causa delle dimensioni dell&#39;embrione e la fragilità del tessuto. Questa tecnica è applicabile agli embrioni di età superiore a 24 HPF anche. Aiutato dalla chiarezza ottica della zebrafish embrionale, la capacità di eseguire esami genetici avanti, genetica inversa, e gli approcci transgenici, diversi processi di sviluppo possano essere istruite. Questo include gli indici mitotici di progenitori neuronali con marcatori come BrdU e anti-fosfo-istone marzo 4-6 e patterning attraverso l&#39;espressione di marcatori progenitrici neuronali e gliali nella pax, NKX, dbx, e olig families 1,4-6. Reattivi che riportano la determinazione gliali e neuroni (come proteina gliale fibrillare acida (GFAP) e Huc / D) 1,4,5,10 può essere utilizzato. Differenziazione sottotipo neuronale può essere analizzata attraverso l&#39;espressione di isolotto, VSX, engrailed, ei geni gata 1,4-6. E, infine, l&#39;analisi di guida degli assoni è possibile attraverso anticorpi come tubulina anti-acetilata, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Anche se altri sistemi modello vertebrato (mouse e pulcino) vengono utilizzati per studiare lo sviluppo del midollo spinale, solo il permesso di zebrafish visualizzazione simultanea di tutti gli assi di sviluppo nell&#39;embrione intatto. La limitazione evidente di questo approccio è che gli embrioni sono fissi, che esclude l&#39;imaging dal vivo. Infatti, la rimozione di (o danni) i risultati tuorlo in rapida morte embrionale, quindi non è possibile ridurre la distanza di lavoro in embrioni vivi con questa tecnica. Tuttavia, alto ingrandimento co spinalerd immagini in embrioni vivi è possibile. Per conservare il tuorlo durante l&#39;imaging in tempo reale, gli embrioni possono essere posizionati in diapositive depressione, che forniscono uno spazio più grande tra il campione e il coprioggetto. In alternativa, più 22 mm x 22 millimetri coprioggetto possono essere incollati su entrambi diapositiva di un 3 x 1 in preparati al microscopio. I coprioggetti servono come &quot;ponte&quot; per il coprioggetto sovrastante. Se gli embrioni sono più vecchi di 18 HPF, tricaine viene utilizzato per anestetizzare gli embrioni per impedire il movimento. Mentre è necessaria una distanza di lavoro di 0,288 millimetri per embrioni deyolked a 24 HPF, quando si lavora con embrioni vivi incorporati in agarosio, con tuorli intatti, una lente microscopica con una distanza di lavoro di 3,3 mm sono sufficienti. In alternativa, le culture espianto derivate da embrioni deyolked possono essere visualizzati con un coagulo di plasma tecnica di immobilizzazione 13. Varie popolazioni di cellule possono essere osservati attraverso l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate come GFP, mCherry, o il photoconcolorante convertibili Kaede (per citarne alcuni). Inoltre, le cellule fluorescente all&#39;interno embrioni chimerici possono essere visualizzati anche con questo approccio 14. Una tecnica di montaggio coerente e stabile per mesi, è uno strumento fondamentale per i biologi dello sviluppo e cellulari. Questa tecnica semplice è riproducibile, che permette un facile confronto tra le diverse prove sperimentali. Inoltre, l&#39;allineamento di embrioni in righe permette facilmente l&#39;identificazione di embrioni specifici per una successiva analisi.

Visualizzazione del midollo spinale in zebrafish è inibita da una serie di fattori. Grazie allo spessore dei somiti sovrastanti e la posizione interna del midollo spinale, una distanza considerevolmente lungo lavoro è necessaria per alta risoluzione cellulare. La palla tuorlo (che è ancora presente durante le prime fasi di neurogenesi) aumenta ulteriormente la distanza di lavoro richiesto, ed è facilmente danneggiata da pressione da un vetrino. Inoltre, i detriti dal tuorlo danneggiato vieta chiara visualizzazione dei tessuti. Sebbene sezioni trasversali nelle (DV) asse dorso-ventrale sono possibili, non facilmente consentono la visualizzazione simultanea in antero-posteriore (AP) asse 1. Per superare questi ostacoli, embrioni vengono sezionati e montate su vetrini. Questa procedura offre diversi vantaggi. In primo luogo, embrioni di zebrafish facilmente si trovano con la parte laterale rivolta verso l&#39;alto, che facilita la visualizzazione asse AP. In secondo luogo, la rimozione del BAL tuorlol diminuisce la distanza di lavoro desiderata, e limita detriti. In terzo luogo, la procedura di montaggio consente sia a fluorescenza e microscopia in campo chiaro. Quarto, embrioni montati sono stabili per mesi a 4 ° C, consentendo la visualizzazione campione prolungato. Infine, la progressione di sviluppo si verifica in quanto segmenti anteriori sono più maturo di segmenti posteriori. Al fine di garantire che allestite hemisegments spinali abbinati sono confrontati tra embrioni, sovrastante tessuto somite viene utilizzato come guida. Ad esempio, il decimo somite più posteriore sovrappone il hemisegment midollo decimo, che è evolutivamente equivalente in embrioni fase corrispondenza. Questa procedura di montaggio degli embrioni intatti permette una facile identificazione dei somiti. Usiamo la genetica e le tecnologie gene knock-basso per studiare i meccanismi di orientamento degli assoni in via di sviluppo midollo spinale. In particolare, abbiamo determinato che robo2, ROBO3 e DCC sono necessari per commissurale primaria Asceending (COPA) assone pathfinding. Utilizzando la procedura di montaggio descritta qui, siamo stati in grado di esaminare la crescita ventrale, attraversamento linea mediana, larghezza commissure, dorsale ed anteriore 2,3 crescita. Questa procedura di montaggio può essere applicata anche a DV o AP patterning del midollo spinale. Abbiamo utilizzato questa procedura per determinare ruoli disparati valle effettori Wnt in DV patterning del midollo spinale. Usando questo montaggio, siamo riusciti a ottenere la risoluzione di marcatori DV a livello di singola cellula, e determinare spostamenti patterning minute a seguito della ricezione del segnale alterato Wnt 4,5. Questa procedura di montaggio consente anche di calcolo dell&#39;indice mitotico attraverso anti-phosphohistone 3 o etichettatura BrdU (progenitore proliferazione) differenziamento 5.

<table><tbody><tr><td>Piastre Petri 35 mm x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Dumont Forceps #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> Vetro di copertura </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B22X22-1.5</td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Vaseum Jelly </td><td>qualsiasi negozio di alimentari</td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Loop Holders </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> Spille per insetti </td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> Portaspilli nichelati </td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Olympus</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione e laterale montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Il midollo spinale zebrafish è un modello di indagine efficace per la ricerca del sistema nervoso per diverse ragioni. In primo luogo, gli approcci atterramento genetica, transgenici e geni possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. In secondo luogo, i grandi innesti di embrioni evolutivamente sincronizzati prevedono grandi misure sperimentali del campione. In terzo luogo, la chiarezza ottica dell&#39;embrione zebrafish permette ai ricercatori di visualizzare progenitore, gliali e popolazioni neuronali. Anche se embrioni di zebrafish sono trasparenti, spessore del provino può impedire efficace visualizzazione microscopica. Una ragione di ciò è lo sviluppo tandem del midollo spinale e tessuto somite sovrastante. Un altro motivo è la grande palla tuorlo, che è ancora presente durante i periodi di precoce neurogenesi. In questo articolo, dimostriamo microdissezione e la rimozione del tuorlo di embrioni fisse, che permette la visualizzazione microscopica preservando il tessuto circostante somite. Noi also dimostrare montaggio semipermanente di embrioni di zebrafish. Questo permette l&#39;osservazione dei neurodevelopment negli assi dorso-ventrale e antero-posteriore, in quanto conserva la tridimensionalità del tessuto.

Quando chiarire i meccanismi che sottendono vari eventi sviluppo come patterning cellulare, la differenziazione, e guida degli assoni, è importante essere in grado di visualizzare le cellule nel contesto della loro tessuto. Difetti patterning dorsoventral tipicamente presenti come uno spostamento ventrale o dorsale nel dominio espressione dei fattori di trascrizione nella pax, NKX, o famiglie dbx 4. A volte, i cambiamenti possono essere sottili, comprendente solo pochi diametri cellulari 4. Analisi della sezione trasversale consente questo tipo di analisi. Tuttavia, i reagenti con segnali più deboli, o sezioni trasversali che non sono perpendicolari all&#39;asse AP possono limitare interpretazione. Inoltre, l&#39;analisi in sezione trasversale non facilmente prendere in considerazione se le modifiche persistono nell&#39;asse AP, e si basa sulla disponibilità di un criostato. Questa limitazione viene aggirata da una vista laterale del midollo spinale. Come si vede nella Figura 2B, nkx6.1 mRNA è distributed in circa la metà ventrale del midollo spinale a 24 ore post-fecondazione (HPF), all&#39;interno del dominio progenitore. Cellule progenitrici sono distinguibili da cellule post mitotiche dovuti alla presenza della piastra, che si trova nella parte mediale del midollo spinale. Visto con ottica DIC, le singole celle sono chiaramente distinguibili, e un confine definito tra esprimere e nonexpressing cellule è evidente. Uscita dal ciclo delle cellule progenitrici è accompagnata da cambiamenti nell&#39;espressione genica. Ad esempio, tutti i neuroni post-mitotici esprimono Huc / D che è rilevabile con immunocitochimica 1,5. sonde mRNA per isolotto, gata, e le famiglie VSX etichettare specifici neuroni post-mitotici di posizione coerente e il numero all&#39;interno di ogni hemisegment del midollo spinale 6. Inoltre, recettori orientamento assone come quelli della famiglia robo sono espressi in popolazioni ristrette di neuroni post-mitotici (Figura 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montaggio laterale di embrioni permette conteggi accurati di neuroni post-mitotici. Allo stesso modo, progenitori che continuano a dividere possono essere quantificati con anti-fosfo-istone 3 immunocitochimica così come l&#39;etichettatura BrdU. Inoltre, la morte cellulare può essere valutata con etichettatura TUNEL 4-6. Al 24 hpf, gli assoni dei neuroni seguenti postmitotici possono essere visualizzati con vari metodi, e sono distinguibili a livello di singola cellula: dorsale laterale Crescente (dola), commissurali primaria Crescente (COPA), commissurali secondaria Crescente (COSA), ventrale longitudinale Descending (Veld), Kolmer-Agdur (KA), commissurali biforcano / longitudinali (COB / L), circonferenza Ascendente (CIA), circonferenziale Discendente (CID), e unipolare commissurali Discendente (UCoD), ROHON-Barba (RB), motoneuroni ( M) 9. Gli assoni si estendono da questi neuroni nella dorsale, ventrale, anteriore, posteriore e le indicazioni. Essi ramo, attraversano la linea mediana, e uscire sia la dorsalee ventrale del midollo spinale. Quando accoppiato con microscopio confocale a scansione laser, questi comportamenti cellulari vari sono evidenti in embrioni montati lateralmente, mediante immunocitochimica e proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate come GFP 2. Nella Figura 2D, ZNP-1 immunocitochimica è stato usato per etichettare motoneuroni in via di sviluppo. Motoneuroni escono dal midollo spinale ventrale per innervare la muscolatura circostante in via di sviluppo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissezione e laterale montare di embrioni di zebrafish. (A) previa trasformazione per immunofluorescenza, ibridazione in situ, ecc, gli embrioni sono posti in un piatto 35 millimetri Petri riempite con PBT (PBS con 0,5% Triton X-100) o PTW (PBS con 0.1% Tween-20). Il tuorlosfera (YB) è evidente. (B) Il tuorlo viene rimosso dal fissaggio della testa dell&#39;embrione successiva accurata dissezione. (C) Un poker embrione (lenza incollato ad una pipetta Pasteur) è usato per embrioni distinti e detriti tuorlo (D). Puliti gli embrioni sono pipettati su un vetrino da microscopio (E) e allineate (F). (G) Vaselina viene applicata agli angoli del coprioggetto. (H) Il vetrino viene posizionato delicatamente sulla sommità degli embrioni mezzo di montaggio. (I) Smalto viene utilizzato per sigillare i bordi del coprioggetto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figura 2. Analisi del pattern di espressione genica e assone pathfinding in laterale montato embrioni di zebrafish. (A) Disegno di un embrione di pesce zebra a 24 HPF. In BD, circa quattro hemisegments sopra l&#39;estensione del sacco vitellino vengono visualizzate (zona in scatola). (B) nkx6.1 è espressa nel midollo spinale ventrale, compresa la piastra (FP). (C) ROBO3 è espresso nei neuroni post-mitotici (PMN). La zona pavimento piatto e progenitore non è evidente in questo piano focale più laterale. In B, C, il midollo spinale è delimitata da una staffa sul lato sinistro dell&#39;immagine. (D) microscopio confocale è stato utilizzato per l&#39;immagine ZNP-1 immunofluorescenza, che le etichette assoni motori che escono dal midollo spinale ventrale. In tutte le immagini, anteriore è a sinistra e dorsale è alto. Una lunga distanza di lavoro 40X, immersione in acqua (NA 0,8) lente è stata usata (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare e montare embrioni di pesce zebra per una visualizzazione microscopica ottimale del midollo spinale. Questo risultato si ottiene innanzitutto mediante dissezione al microscopio e rimozione della pallina di quercia. Il secondo passaggio consiste nell'eliminare i detriti di quercia e trasferire con pipetta gli embrioni su un vetrino.Successivamente, il liquido in eccesso viene rimosso con cura utilizzando un fazzoletto Kim, seguito dall'aggiunta del mezzo di montaggio. L'ultimo passaggio consiste nell'orientare gli embrioni sul vetrino con un ago per embrioni e quindi applicare il coprioggetto. Infine, si utilizza la microscopia a fluorescenza o in campo chiaro per mostrare la distribuzione dei corpi cellulari post-mitotici e la traiettoria degli assoni in via di sviluppo.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia, ad esempio quali sono i meccanismi responsabili del patterning, della differenziazione e della guida degli assoni. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su molti aspetti dello sviluppo del sistema nervoso, può essere applicato anche ad altri tessuti, come il muscolo in via di sviluppo. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché è richiesta una dissezione al microscopio prima di iniziare l'esperimento.Preparare un ago per embrioni incollando una punta di pipetta a una pipetta usata e quindi incollando un filo da pesca alla punta della pipetta. Per iniziare la dissezione dell'embrione, posizionare fino a 30 embrioni di pesce zebra, di età pari a 24 ore dopo la fecondazione, in una piastra di Petri da 35 millimetri riempita con PBS.Sotto un microscopio stereoscopico, fissare la testa di un embrione con una pinzetta mentre si allontana la quercia con un ago da insetti. Successivamente, utilizzare lo stuzzicatore per embrioni per spostare gli embrioni in una zona della piastra di Petri che non contenga molti detriti di tuorlo. Quindi, aspirare gli embrioni in una pipetta di Pasteur di vetro, aspirando la minor quantità possibile di liquido.Quindi, pipettare delicatamente fino a 21 embrioni su un vetrino. Asportare con attenzione il liquido in eccesso utilizzando un fazzoletto da laboratorio, evitando di toccare gli embrioni, quindi aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sugli embrioni. Successivamente, utilizzare lo strumento per embrioni per disporre gli embrioni lateralmente in due o tre file.Ora, aggiungere una piccola quantità di vaselina a ciascun angolo di un coprioggetto. Ruotare il coprioggetto in modo che il lato con la vaselina sia rivolto verso il basso e posizionare il coprioggetto sopra gli embrioni. La vaselina agisce prevenendo danni agli embrioni causati da compressione eccessiva.Battere delicatamente l'apposito coprioggetto su ciascun angolo finché il mezzo di montaggio non tocca il coprioggetto, se necessario, utilizzando una pipetta con un intervallo da 20 a cento microlitri. Aggiungere altro mezzo di montaggio accanto al coprioggetto e permettere al mezzo aggiunto di diffondersi sotto il coprioggetto. A questo punto, utilizzare un fazzoletto da laboratorio per pulire completamente l'area intorno al coprioggetto.Non applicare pressione al vetrino coprioggetto, poiché ciò può danneggiare gli embrioni; una volta pulita correttamente, la zona deve essere asciutta e priva di vaselina o mezzo di montaggio. Completare sigillando i bordi del vetrino coprioggetto con lo smalto per unghie. Dopo il montaggio degli embrioni di pesce zebra, sono stati visualizzati diversi segmenti HEMI al di sopra dell'estensione della sacca all'acqua. Questa figura mostra l'espressione di NK X 6.1 nel midollo spinale ventrale dell'embrione di pesce zebra. L'mRNA di NK X 6.1 è distribuito approssimativamente nella metà ventrale del midollo spinale a 24 ore dalla fecondazione. All'interno del dominio progenitore, le cellule progenitrici sono distinguibili dalle cellule post-mitotiche a causa della presenza della lamina terminale, localizzata nella parte mediale del midollo spinale.Visualizzato con ottica DIC. Le singole cellule sono chiaramente distinguibili e si osserva un confine definito tra cellule esprimenti e non esprimenti. L'uscita del ciclo cellulare dei progenitori è accompagnata da cambiamenti nell'espressione genica.Questa immagine mostra l'espressione di robo tre nei neuroni post-mitotici. La famiglia di recettori robo comprende recettori per la guida dell'assone, la cui espressione consente conteggi accurati di neuroni post-mitotici. Si noti che la piastra ventrale e la zona progenitrice non sono evidenti in questo piano focale più laterale.La microscopia confocale è stata utilizzata per acquisire immagini dell'immunofluorescenza di znp uno, che etichetta gli assoni motori come mostrato in questo embrione montato lateralmente. I neuroni motori escono dal midollo spinale in senso ventrale a 24 ore dalla fecondazione per innervare la muscolatura in via di sviluppo circostante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di preservare l'integrità dei tessuti mediante una microdissezione accurata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche di microdissezione per rimuovere il tuorlo degli embrioni di pesce zebra al fine di montarli e visualizzarli al microscopio.

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.

Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Qui descriviamo un metodo per ridurre le dimensioni degli embrioni di pesce zebra senza interrompere i normali processi di sviluppo. Questa tecnica consente lo studio del ridimensionamento del modello e della robustezza dello sviluppo contro il cambiamento delle dimensioni.

Riduzione delle dimensioni chirurgiche di zebrafish per lo studio della scala del modello embrionale

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Qui presentiamo il protocollo per la coltura tissutale 3D dell'asse del corpo posteriore zebrafish, consentendo lo studio vivo della segmentazione dei vertebrati. Questo modello di espianto fornisce il controllo sull'allungamento dell'asse, l'alterazione delle sorgenti di morfogeno e l'imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare.

Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra

Qui, presentiamo un metodo per allineare e criosezionare più campioni di larve di Zebrafish (Danio rerio) e raccoglierli su un singolo vetrino per l'analisi trascrittomica spaziale.

Disposizione spazialmente compatta delle sezioni larvali di zebrafish per l'analisi trascrittomica spaziale

Scopri la dissezione e il montaggio laterale di embrioni di Danio rerio per visualizzare lo sviluppo del midollo spinale. Questa tecnica microscopica facilita lo studio dei processi di neurobiologia e differenziazione cellulare.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Esplora altri video