Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale
28 febbraio 2014
Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.
L'obiettivo generale di questa procedura è sezionare e montare embrioni di zebrafish per una visualizzazione microscopica ottimale del midollo spinale. Ciò si ottiene sezionando e rimuovendo prima la sfera di quercia. Il secondo passo consiste nel rimuovere i detriti di quercia e pipettare gli embrioni su un vetrino.
Successivamente, il liquido in eccesso viene accuratamente rimosso con una salvietta Kim, seguita dall'aggiunta di un mezzo di montaggio. Il passaggio finale consiste nell'orientare gli embrioni sul vetrino con un attizzatoio per embrioni, seguito dall'applicazione del vetrino coprioggetti. In definitiva, la microscopia a fluorescenza o a campo chiaro viene utilizzata per mostrare la distribuzione dei corpi cellulari post-mitotici e la traiettoria degli assoni in via di sviluppo.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come ad esempio quali sono i meccanismi responsabili del patterning, della differenziazione e della guida degli assoni. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su molti aspetti dello sviluppo del sistema nervoso, può essere applicato anche ad altri tessuti come lo sviluppo muscolare. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessaria la dissezione al microscopio prima di iniziare l'esperimento.
Crea un attizzatoio embrionale incollando la punta di una pipetta a una pipetta passata e poi incollando una lenza alla punta della pipetta. Per iniziare la dissezione dell'embrione, posizionare fino a 30 embrioni di zebrafish. Età 24 ore dopo la fecondazione in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con PBS.
Sotto un microscopio da dissezione, fissa la testa di un embrione con un paio di pinze mentre tiri via la quercia con uno spillo per insetti. Quindi usa l'attizzatoio per embrioni per spostare gli embrioni in una parte della capsula di Petri che non ha molti detriti di tuorlo. Quindi, aspirare gli embrioni in una pipetta da pascolo di vetro prelevando quanto meno liquido possibile.
Quindi pipettare delicatamente fino a 21 embrioni su un vetrino. Eliminare con cura il liquido in eccesso utilizzando una salvietta da laboratorio evitando di toccare gli embrioni, quindi aggiungere una goccia di terreno di coltura agli embrioni. Quindi, usa l'attizzatoio per embrioni per orientare gli embrioni sui loro lati in due o tre file.
Ora, aggiungi una piccola quantità di vaselina su ogni angolo di un vetrino coprioggetti. Capovolgere il vetrino coprioggetto in modo che il lato con la vaselina sia rivolto verso il basso e posizionare il vetrino coprioggetti sopra gli embrioni. La vaselina agisce per prevenire danni agli embrioni dovuti a un'eccessiva compressione.
Se necessario, picchiettare delicatamente il vetrino coprioggetti su ciascun angolo fino a quando il supporto di montaggio tocca il vetrino coprioggetti, utilizzando un pipettatore nell'intervallo da 20 a cento microlitri. Aggiungere altri supporti di montaggio accanto al vetrino coprioggetto e lasciare che il supporto aggiunto si assorba sotto il vetrino coprioggetto. Ora, usa una salvietta da laboratorio per pulire completamente intorno al vetrino coprioggetto.
Non esercitare pressione sul vetrino coprioggetti in quanto ciò può danneggiare gli embrioni se adeguatamente pulito, l'area è asciutta e non ha vaselina o mezzi di montaggio. Termina usando lo smalto per unghie per sigillare i bordi del vetrino coprioggetti. Dopo aver montato gli embrioni di zebrafish, sono stati visualizzati diversi segmenti HEMI sopra l'estensione del sacco di quercia.
Questa figura mostra l'espressione di NK X 6.1 nel midollo spinale ventrale dell'embrione di zebrafish. L'mRNA NK X 6.1 è distribuito all'incirca nella metà ventrale del midollo spinale 24 ore dopo la fecondazione. All'interno del dominio progenitore, le cellule progenitrici sono distinguibili dalle cellule post-mitotiche a causa della presenza della placca del pavimento, che si trova nella parte mediale del midollo spinale.
Visto con ottica DIC. Le singole cellule sono chiaramente distinguibili ed è evidente un confine definito tra cellule esprimenti e non esprimenti. L'uscita dal ciclo cellulare progenitore è accompagnata da cambiamenti nell'espressione genica.
Questa immagine mostra l'espressione del robo tre nei neuroni post mitotici. La famiglia dei recettori robotici è costituita da recettori di guida degli assoni la cui espressione consente conteggi accurati dei neuroni post mitotici. Si noti che la piastra del pavimento e la zona progenitrice non sono evidenti in questo piano focale più laterale.
La microscopia confocale è stata utilizzata per visualizzare l'immunofluorescenza di znp one, che etichetta gli assoni motori come mostrato in questo embrione montato lateralmente. I motoneuroni escono ventralmente dal midollo spinale 24 ore dopo la fecondazione per innervare la muscolatura circostante in via di sviluppo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preservare l'integrità dei tessuti attraverso un'attenta microdissezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche di microdissezione per rimuovere il tuorlo degli embrioni di pesce zebra per il montaggio e la visualizzazione microscopica.
Panoramica
In questo articolo viene presentata una procedura dettagliata per la dissezione e il montaggio di embrioni di pesce zebra al fine di ottimizzare la visualizzazione dello sviluppo del midollo spinale. Il metodo migliora lo studio di processi neurobiologici fondamentali come l'orientamento degli assoni e la differenziazione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neurobiologia
- Biologia dello sviluppo
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- Gli embrioni di pesce zebra sono preziosi per modellare i processi dello sviluppo.
- Comprendere lo sviluppo del midollo spinale è fondamentale per la ricerca neurobiologica.
- Le tecniche di visualizzazione microscopica sono essenziali per lo studio della dinamica cellulare.
- Le tecniche di dissezione e di montaggio richiedono precisione per preservare l'integrità del tessuto.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per il montaggio di embrioni di pesce zebra.
- Facilitare la visualizzazione dei corpi cellulari post-mitotici e delle traiettorie assonali.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso.
Metodi Utilizzati
- Dissezione microscopica di embrioni di pesce zebra per rimuovere il tuorlo.
- Montaggio degli embrioni su vetrini con un mezzo appropriato.
- Utilizzo di un puntello per embrioni per l'orientamento durante il montaggio.
- Impiego di microscopia a fluorescenza e in campo chiaro per la visualizzazione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dell'espressione di NKX6.1 nel midollo spinale.
- Chiara distinzione tra cellule progenitrici e cellule post-mitotiche.
- Dimostrazione del guidaggio assonale mediante analisi dell'espressione di robo3.
- Acquisizione efficace di immagini degli assoni motori mediante microscopia confocale.
Conclusioni
- Il metodo descritto consente un montaggio efficiente ed efficace degli embrioni.
- Fornisce informazioni sullo sviluppo del midollo spinale e sulla neurobiologia.
- La padronanza di questa tecnica può migliorare significativamente i risultati della ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una visualizzazione ad alta fedeltà dello sviluppo del midollo spinale nel pesce zebra, supportando studi meccanicistici sulla guida degli assoni e sulla differenziazione neuronale. Rimuovendo barriere ottiche come il tuorlo e il tessuto dei somiti, migliora la riproducibilità nelle procedure di validazione degli obiettivi neurobiologici. L'approccio fornisce una piattaforma scalabile e standardizzata per lo screening fenotipico nelle fasi iniziali della scoperta, riducendo il rumore biologico negli sforzi di riduzione del rischio meccanicistico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative al patterning del midollo spinale e ai meccanismi di guida degli assoni.
- Valore operativo: Preserva l'architettura tissutale tridimensionale per un'analisi coerente delle polarità dorso-ventrale e antero-posteriore.
- Valore predittivo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli mediante la visualizzazione dei corpi cellulari post-mitotici e delle traiettorie assonali in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative e risolte spazialmente dell'espressione proteica (ad esempio, NKX6.1, ROBO3) per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Facilita la preparazione di un elevato numero di embrioni sincronizzati per applicazioni di screening ad alto contenuto.
- Prontezza del saggio: Permette una valutazione affidabile dei composti grazie al tessuto dei somiti preservato e a una chiara visualizzazione microscopica dei processi neurosviluppali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico fornendo un sistema rilevante per la malattia per l'analisi dei meccanismi neurosviluppali.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità nell'elucidazione dei percorsi mediante la visualizzazione diretta di popolazioni progenitrici e post-mitotiche.
- Conferma predittiva: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio consentendo un'immagine costante e riproducibile dei marcatori di guida degli assoni e di differenziazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la verifica delle ipotesi e la riduzione dei rischi biologici prima delle fasi di identificazione del capostazione e della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione funzionale di bersagli nello sviluppo neurologico attraverso la visualizzazione diretta dei tessuti.
- Screening: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mediante protocolli standardizzati per il montaggio e l'orientamento degli embrioni.
- Analisi: Genera letture quantitative in fluorescenza e in campo chiaro che consentono l'analisi comparativa di diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla fase di scoperta al lavoro preclinico preservando l'integrità del tessuto per il monitoraggio longitudinale dello sviluppo neurologico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening neurobiologico su multipli bersagli e paradigmi sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sullo sviluppo del midollo spinale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi neurobiologici basati sul pesce zebra.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento/cessazione e riduce il rischio biologico in fasi avanzate grazie a una riduzione precoce del rischio meccanicistico.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi nello sviluppo neurologico sulla base di dati fenotipici riproducibili e ad alta risoluzione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microdissezione e microscopia per preservare l'integrità del tessuto durante la rimozione del tuorlo.
- Dipende da strumentazione di precisione, inclusi microscopi stereoscopici, pokers per embrioni e strumenti di pipettaggio controllati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi riguardo al mezzo di montaggio, ai protocolli di orientamento e ai parametri di acquisizione delle immagini.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la variabilità del sistema modello per quanto riguarda le dimensioni del tuorlo e lo spessore del tessuto nei diversi stadi di sviluppo.
- I limiti pratici comprendono la curva di apprendimento associata alla microdissezione sotto microscopio, in particolare per gli utenti alle prime esperienze.
