Name: Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Impara a isolare le cellule immunitarie dal tessuto adiposo mediante digestione con collagenasi e citometria a flusso. Questo metodo consente di quantificare macrofagi e linfociti T per studiare le malattie immunometaboliche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

OCS è supportato da un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH è supportato da un American Heart Association Investigator Award Fondata (12EIA8270000). Esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nel VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa. Il VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa è supportata dalla Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

1. Reagenti e accessori per la Prima di iniziare questo protocollo sperimentale, preparare i seguenti reagenti: <ol><li> 70% di etanolo </li><li> PBS 1X </li><li> 1X DPBS (senza Ca e Mg) integrati con 0,5% BSA </li><li> FACS buffer: 1X DPBS (senza Ca e Mg), 2 mM EDTA, e l&#39;1% FCS </li><li> Tampone ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA in acqua </li></ol> 2. Raccolta e Preparazione del tessuto adiposo <ol><li> Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione. </li><li> Bagnare completamente il pelo con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un&#39;incisione a livello del processo xifoideo (parte inferiore dello sterno) e aprire la cavità toracica per esporre il cuore, facendo attenzione a non recidere le principali vasi sanguigni. </li></ol> Nota: A questo punto, è anche utile per lasciare il diaframma intatto il piùpossibile e tagliare una tacca dal lato destro della gabbia toracica per permettere al sangue di fluire e perfusato dalla cavità toracica. <ol start="4"><li> Agganciare l&#39;atrio destro per permettere al sangue e perfusato per sfuggire al sistema circolatorio. </li></ol> Nota: Quando si tratta di topi obesi, eccesso pericardico AT può avere bisogno di essere rimosso per consentire l&#39;accesso al cuore. <ol start="5"><li> Afferrare il cuore con una pinza e inserire delicatamente un ago nel ventricolo sinistro attraverso l&#39;apice. Perfusione lentamente il mouse con 15 ml di PBS sterile. </li></ol> Nota: ridurre il tasso di perfusione se i polmoni iniziano a riempirsi ed espandersi. <ol start="6"><li> Aprire la cavità peritoneale e rimuovere i cuscinetti di grasso perigonadal con attenzione per evitare eventuali tessuti gonadici. </li><li> Mettere cuscinetti di grasso in una pesata barca sul ghiaccio contenente 2 ml di 1X DPBS (senza Mg o Ca) integrata con 0,5% BSA, e tritare la AT in pezzi pregiati. </li></ol>Nota: Limitare la quantità di AT per pesare barca a 1,2 g. Se la quantità di AT supera 1,2 g, dividerlo equamente tra due barche a pesare. <ol start="8"><li> Conservare i campioni in ghiaccio e preparare 3 ml di soluzione di collagenasi digest per AT campione costituito da 1X DPBS integrato con 0,5% BSA, 10 mM CaCl 2, e 4 mg / ml di collagenasi di tipo II. </li></ol> 3. Collagenasi Digestione <ol><li> Transfer per provette coniche da 50 ml versando l&#39;omogeneizzato e risciacquo la barca pesare con 1 ml DPBS (0,5% BSA) e 3 ml di soluzione di collagenasi II digest. </li><li> Incubare a omogeneizzato in uno shaker di rotazione (200 rpm) a 37 ° C per 20 min. </li><li> Aggiungere 10 ml DPBS (0,5% BSA) per tubi conici e posto sul ghiaccio. </li><li> Triturare omogeneizzato numerose volte utilizzando una pipetta sierologica 10 ml, e passare sospensioni cellulari attraverso il filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 10 minuti a 4 &amp; dad esempio, C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet cellulare in 3 ml di tampone ACK per la lisi degli eritrociti contaminanti. </li><li> Aggiungere 12 ml di tampone FACS sospensione cellulare e centrifugare a 500 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet di cellule in tampone FACS. </li></ol> Nota: utilizzare la dimensione del pellet cellulare come guida per quanto tampone FACS per risospendere in Se il pellet cellulare copre il fondo della provetta 50 ml conica, utilizzare 0,5-1 ml tampone FACS, altrimenti, risospendere in 0.25-0.5 ml. <ol start="9"><li> I campioni su ghiaccio e preparare 1:10 aliquote di diluizione di ogni campione per il conteggio delle cellule di miscelazione 40 microlitri di buffer FACS, 50 soluzione blu tripano microlitri (0,2%), e 10 microlitri di sospensione cellulare. </li><li> Contare le cellule vitali sulla base di blu tripano esclusione e diluire sospensioni di cellule ad una concentrazione finale di 5-10 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> 4. La colorazione degli antigeni di superficie <ol&gt; <li> Aggiungere antitopo CD16/CD32 anticorpo (Fc block) ad una concentrazione finale di 0,5-1 μg/10 6 cellule, e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Campioni di trasferimento (≥ 10 6 cellule) a 12 x 75 mm provette a fondo tondo di polistirolo. Preparare tubi separati se analizzando bancomat e le cellule T, e unire le celle in più per preparare un adeguato numero di tubi per accogliere il risarcimento richiesto e uno (FMO) controlli fluorescenza modificati meno. </li></ol> Nota: Per fare un esempio, nel quantificare la percentuale di sportelli automatici in base a F4/80 e CD11b, i seguenti compensi e controlli FMO dovrà essere preparato: - Avviare l&#39;elaborazione (cellule) - DAPI o ioduro di propidio (PI) macchia singole (cellule, non aggiungono colorante vitalità fino al punto 5.1) - F4/80 APC (cellule o sfere di compensazione) singoli macchia - CD11b FITC cellule o singole macchia (sfere di compensazione) - FMO 1 (celle): Rat IgG2a κ isotipo di controllo APC + CD11b FITC + colorante vitalità (aggiunto a passo 5.1) - FMO 2 (celle): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotipo di controllo FITC + colorante vitalità (aggiunto a passo 5.1) <ol start="3"><li> Aggiungi anticorpi primari fluoroforo-coniugato e / o controlli isotipo alla concentrazione adeguata (vedi Tabella di reagenti e materiali). </li><li> Proteggere i campioni dalla luce e incubare a 4 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone FACS sospensione cellulare e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet di cellule in 2 ml di tampone FACS. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere SVF pellet cellulare in ≥ 400 microlitri di buffer FACS. </li><li> Trasferire campioni da 12 x 75 mm in polistirolo tubi fondo sferico dotato di un 35 top tube colino cellula micron.</li><li> Proteggere dalla luce e conservare i campioni a 4 ° C fino al momento dell&#39;analisi FACS. </li></ol> Nota: Per risultati ottimali cellule devono essere analizzati immeadiately, tuttavia, l&#39;analisi FACS con questo protocollo è stato condotto con successo su cellule marcate memorizzati nel tampone FACS per 1-2 ore a 4 ° C. Se le cellule devono essere fissati per aumentare il tempo di conservazione, cellule marcate possono essere fissate con paraformaldeide al 2% a 4 ° C per 24 ore prima dell&#39;analisi FACS. Aziende anticorpi suggeriscono che le cellule marcate possono essere conservati fino a una settimana, ma questo non è stato testato nel contesto di questa procedura. 5. FACS analisi <ol><li> Prima di analisi FACS, aggiungere colorante vitalità di campioni e controlli adeguati per consentire la discriminazione delle cellule vive / morte. </li></ol> Nota: Numerose coloranti vitalità sono commercialmente disponibili, ma DAPI e PI sono raccomandati seconda della eccitazione / emissione profiles degli anticorpi fluoroforo-coniugati utilizzati. DAPI e propidio ioduro vengono aggiunti a ciascun campione ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml. <ol start="2"><li> Utilizzare un campione di controllo negativo senza macchia, preferibilmente cellule isolate dal tessuto stesso, come i campioni sperimentali, per regolare side scatter (SSC) e forward scatter (FSC) in modo che la popolazione cellulare (s) di interesse sono in scala. </li></ol> Nota: Per l&#39;analisi delle cellule AT SVF, si consiglia di SSC viene visualizzato in una scala logaritmica contro FSC in una scala lineare. L&#39;uso di una scala logaritmica per SSC è particolarmente importante quando si analizzano ATM, che sono spesso molto grandi e granulare. <ol start="3"><li> Disegnare un cancello diffusione luminosa iniziale in base al tipo di cellula (s) da analizzare, e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all&#39;estrema sinistra di un istogramma solo parametro (approssimativamente centrato su 10 2) per i canali appropriati. &lt;/ Li&gt; </ol> Nota: Si raccomanda di linfociti e macrofagi (o altre cellule mieloidi) essere analizzati separatamente a causa di differenze di autofluorescenza. <ol start="4"><li> Utilizzare singoli controlli macchiati o anticorpo di cattura sfere di compensazione per eseguire la compensazione multi-colore. </li></ol> Nota: Si consiglia l&#39;uso di sfere di compensazione, tuttavia, la compatibilità di ogni anticorpo deve essere garantita. Ad esempio, sfere di compensazione potrebbero non cross-reagiscono con anticorpi di coniglio, nel qual caso le cellule isolate sono tenuti ad ottenere un adeguato controllo singolo macchia. <ol start="5"><li> Impostare cancelli sperimentali basati sui controlli modificati FMO. </li><li> Impostare il citometro di flusso per raccogliere il numero appropriato di eventi basati sulla prevalenza della popolazione di interesse e registrare i dati sperimentali. </li><li> Esportare i file FCS di dati per l&#39;analisi offline. Ci sono numerosi programmi disponibili per il flusso cytometrl&#39;analisi dei dati y. Si consiglia Cytobank, una piattaforma web-based che permette investigatores per memorizzare e analizzare i dati e generare dati da qualsiasi computer con accesso a internet 18. Inoltre, Cytobank offre la possibilità di rendere pubblici i dati accessibili o limitare l&#39;accesso a collaboratori. </li></ol>

<ol><li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Danse, L. H., Verschuren, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+oil-induced+yellow+fat+disease+in+rats.+III.+Lipolysis+in+affected+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue.</a> Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).</li>
<li>Weisberg, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+is+associated+with+macrophage+accumulation+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+in+fat+plays+a+crucial+role+in+the+development+of+obesity-related+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).</li>
<li>Mathis, D., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+an+emerging+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: an emerging frontier.</a> Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).</li>
<li>Stefanovic-Racic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+promote+macrophage+infiltration+and+comprise+a+substantial+proportion+of+obesity-associated+increases+in+CD11c%2B+cells+in+adipose+tissue+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver.</a> Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).</li>
<li>Feuerer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lean%2C+but+not+obese%2C+fat+is+enriched+for+a+unique+population+of+regulatory+T+cells+that+affect+metabolic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters.</a> Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).</li>
<li>Winer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+obesity-associated+insulin+resistance+through+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy.</a> Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).</li>
<li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+by+lipid+excess+promotes+tissue+inflammation%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America.+109%22%5BJournal%5D)">Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+sustain+adipose+alternatively+activated+macrophages+associated+with+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis.</a> Science. 332, 243-247 (2011).</li>
<li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).</li>
<li>Talukdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+insulin+resistance+in+mice+fed+a+high-fat+diet+through+secreted+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase.</a> Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).</li>
<li>Hagman, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+quantifying+leukocyte+populations+in+human+adipose+tissue%3A+impact+of+enzymatic+tissue+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing.</a> Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45, 194-205 (2001).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Crescente interesse per il ruolo del sistema immunitario nelle conseguenze metaboliche dell&#39;obesità ha portato all&#39;uso diffuso di citometria a flusso per caratterizzare cellule immunitarie del AT. Anche se il protocollo esatto varierà tra laboratori sulla base della loro esperienza e le attrezzature disponibili, i passaggi critici includono collagenasi digestione, centrifugazione differenziale, e la cellula antigene di superficie di etichettatura. Lo scopo del presente articolo è di fornire un protocollo dettagl...

Storicamente, il tessuto adiposo (AT) è stato visto come un organo inerte di stoccaggio dei lipidi, che si espande e si contrae in risposta al bilancio energetico. Ora capiamo che AT rappresenta un organo endocrino dinamica che secerne attivamente una serie di ormoni che influenzano direttamente il comportamento alimentare e l&#39;omeostasi del glucosio sistemico. Inoltre, negli ultimi dieci anni c&#39;è stato un crescente apprezzamento per le numerose popolazioni di cellule immunitarie che risiedono nella AT frazione stromale vascolare (SVF), così come il loro contributo alla AT omeostasi. La possibilità di separare la AT adipociti e SVF utilizzando un collagenasi digest seguita da centrifugazione differenziale è stato descritto da Rodbell nel 1964 1. Collagenasi II è più spesso utilizzato per la separazione degli adipociti e SVF a causa di manutenzione di adipociti recettori dell&#39;insulina 1. All&#39;inizio, frazionamento enzimatica di AT è stato principalmente impiegato per studiare adipocyte metabolismo e per isolare preadipocytes. Più recentemente, questa tecnica, combinata con l&#39;ampia disponibilità di citofluorimetri e il numero sempre crescente di anticorpi coniugati fluoroforo disponibili in commercio, ha facilitato la caratterizzazione di AT cellule immunitarie. Sebbene la presenza di cellule immunitarie nella infiammato AT era stato descritto in precedenza 2, gli articoli fondamentali per Weisberg et al. e Xu et al. pubblicato nel 2003, furono i primi a documentare l&#39;accumulo di AT macrofagi (ATM) in obesità, che secernono citochine infiammatorie e correlare con AT-specifica e sistemica insulino-resistenza 3,4. Queste osservazioni hanno fornito la base di un nuovo campo di indagine recentemente coniato, &quot;immunometabolism,&quot; 5 e sono state seguite da studi che implicano varie popolazioni di cellule immunitarie, comprese le cellule dendritiche 6, mastociti, cellule T 7 8 -10, cellule B, cellule NKT 11 12 13, eosinofili e neutrofili 14,15 nello sviluppo dell&#39;obesità associata resistenza all&#39;insulina. L&#39;obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata della tecnica digest collagenasi utilizzata per isolare le cellule del AT SVF e caratterizzare bancomat e AT cellule T mediante citometria a flusso. Questo protocollo è stato ottimizzato per mouse, tuttavia, gli spettatori possono trarre beneficio dalla lettura di un ottimo articolo che fornisce ampi dettagli sulla ottimizzazione di questa tecnica per l&#39;uomo a 16 anni. I destinatari di questo articolo include investigatori con limitata esperienza di lavoro con il mouse e l&#39;esecuzione di citometria a flusso. Diverse considerazioni pratiche per il bilanciamento resa cellulare e la vitalità con il tempo e le risorse sono presentate così come controlli di citometria a flusso ottimali per la caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie. Oltre al nostro protocollo, i lettori sono referred un recente articolo JoVE da Basu et al. per una eccellente discussione di alcuni aspetti tecnici della citometria a flusso per comprendere adeguati controlli e compensazioni 17.

<table><tbody><tr><td>DPBS (senza Ca o Mg) 10 x 500 ml</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>collagenasi</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di ioduro di propidio</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>pila stabile 20 microlitri</td><td>Rainin</td><td>SS-L10</td><td></td></tr><tr><td>Puntali con filtro da 20 microlitri</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td><td></td></tr><tr><td>stack stabile Punte da 250 microlitri</td><td>Rainin</td><td>SS-L250</td><td></td></tr><tr><td>Punte da 1000 microlitri</td><td>Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr><tr><td>Punte con filtro da 1000 microlitri</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>Punte con filtro da 250 microlitri</td><td>Rainin</td><td>SR-L200F</td><td></td></tr><tr><td>FC Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>filtri fisher 100mn</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>piatto di peso medio</td><td>Fisherbrand</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>foglio di alluminio</td><td>Fisherbrand</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>forbici tritacarne</td><td>Fisherbrand</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>provette FACS con filtro superiore</td> BD <td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Astuccio per pipette da 10 ml 200</td><td>BD Falcon</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>provette a fondo tondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>V</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td>pipetta a bulbo di trasferimento</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino adesivo</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga per colture cellulari</td><td>Sorvall</td><td>75253839</td> Adattatori Sorvall 75003723 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Concentrazione: 0,5 - 1 &mu; g/ 106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto F4/80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>Coniugato fluoroforo: APC Concentrazione: 0,2 &mu; g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: 17-4321</td></tr><tr><td>Ratto anti-topo CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Coniugato fluoroforo: FITC Concentrazione: 0,5 &mu; g/ cellule 106 Numero di catalogo del controllo isotipo: 11/1/4031</td></tr><tr><td>Criceto armeno anti-topo CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,8 &mu; g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipico: Dec-88</td></tr><tr><td>Capra anti-topo MGL1/2</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB4297P</td><td>Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,1 &mu; g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: IC108P</td></tr><tr><td>Capra anti-topo CD206</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB2535P</td><td>Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,1 &mu; g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: IC108P</td></tr><tr><td>R&</td><td> Sistemi D</td><td>FAB5538P</td><td>Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,1 &mu; g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: IC013P</td></tr><tr><td>Criceto armeno anti-topo TCR&#946;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>Coniugato fluoroforo: APC Concentrazione: 0,2 &mu; g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: 553956</td></tr><tr><td>Ratto anti-topo CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>552877</td><td>Coniugato fluoroforo: PE-Cy7 Concentrazione: 0,8 &mu; g/ cellule 106 Numero di catalogo del controllo dell'isotipo: 552784</td></tr><tr>Coniugato fluoroforo<td>anti-topo CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956 Biosciences</td><td>: Alexa Fluor 700 Concentrazione: 0,2 &mu; g/ 106 celle Numero di catalogo del controllo dell'isotipo: 557963</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 1. Elenco dei materiali e dei reagenti.</td></tr></tbody></table>

isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

La scoperta di una maggiore infiltrazione di macrofagi nel tessuto adiposo (AT) di roditori obesi e gli esseri umani ha portato ad un intensificarsi di interesse contributo delle cellule immunitarie all&#39;insulina locale e sistemica di resistenza. Isolamento e quantificazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie nel magri e obesi AT è oggi una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori immunometabolism; ancora estrema cura deve essere presa sia in stromale isolamento delle cellule vascolari e nella analisi di citometria a flusso in modo che i dati ottenuti siano affidabili e interpretabile . In questo video mostriamo come per tritare, digerire, e isolare la frazione di cellule vascolari-arricchito stromale immune. Successivamente, mostriamo come anticorpi etichetta macrofagi e linfociti T e come correttamente cancello su di loro in esperimenti di citometria a flusso. Sono forniti di flusso rappresentativi citometria trame di basso contenuto di grassi alimentati magra e ricca di grassi nutriti topi obesi. Un elemento critico di questa analisi è l&#39;uso di anticorpi che fannoNon fluorescenza nei canali dove AT macrofagi sono naturalmente autofluorescenti, così come l&#39;uso di controlli di compensazione adeguati.

Collagenasi digestione di AT seguito da centrifugazione differenziale è stato utilizzato per isolare il SVF da cuscinetti di grasso dell&#39;epididimo di topi maschi C57BL/6J alimentato un basso contenuto di grassi (10% kcal dai grassi) o ad alto contenuto di grassi (60% kcal dai grassi) dieta (LFD e HFD , rispettivamente) per 16 settimane. Cellule del SVF furono poi etichettati con anticorpi primari fluoroforo-coniugato a quantificare la percentuale di vitale ATM (Figura 1) e AT cellule T (figu...

Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule immunitarie del tessuto adiposo. Ciò si ottiene rimuovendo prima i cuscinetti adiposi epidermici. Nella seconda fase, il tessuto adiposo viene digerito con la collagenasi.Successivamente, la frazione vascolare stromale del tessuto adiposo viene isolata mediante centrifugazione differenziale. Nella fase finale, le cellule immunitarie del tessuto adiposo vengono marcate con anticorpi primari coniugati al fluoro quattro. In definitiva, la proporzione di macrofagi vitali e cellule T che risiedono nel tessuto adiposo può essere quantificata mediante citometria a flusso.Ciao, sono Alyssa Hasty. Oggi ti mostreremo come isolare e quantificare le cellule immunitarie dal tessuto adiposo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunometabolismo, come ad esempio come le popolazioni di cellule immunitarie nel tessuto adiposo cambiano in seguito a manipolazioni genetiche, farmacologiche o nutrizionali.A dimostrare la procedura oggi saranno Arian Kennedy e Jeb, o i borsisti post-dottorato nel mio laboratorio. Dopo aver bagnato accuratamente il pelo dell'animale soppresso con etanolo al 70%, praticare un'incisione a livello del processo xifoideo e aprire la cavità toracica per esporre il cuore facendo attenzione a non recidere i vasi sanguigni principali. Quindi, agganciare l'atrio destro per consentire al sangue e al perfu otto di uscire dal sistema circolatorio.Quindi usa un paio di pinze per afferrare il cuore e inserisci delicatamente un ago attraverso l'apice nel ventricolo sinistro. Ora perfondere lentamente il topo con 15 millilitri di PBS sterile. Quindi aprire la cavità peritoneale e rimuovere i cuscinetti adiposi gonadici pereg facendo attenzione per evitare qualsiasi tessuto gonadico.Metti i cuscinetti adiposi in una barchetta di siero di latte su ghiaccio contenente due millilitri di DPBS privo di magnesio e calcio integrato con lo 0,5% di BSA, quindi trita il tessuto adiposo in pezzi sottili. Ecco come dovrebbe apparire il grasso al termine della macinazione. Versare ora l'omogeneizzato di tessuto adiposo tritato in una provetta conica da 15 millilitri.Sciacquare il webo con un millilitro di DPBS integrato con BSA e versare il lavaggio nel tubo conico. Quindi, sciacquare la barca WHE con tre millilitri di soluzione di collagenasi e versare il lavaggio nel tubo. Incubare l'omogeneo in un agitatore rotazionale per 20 minuti a 200 giri/min e 37 gradi Celsius.Quindi aggiungere 10 millilitri di DPBS integrato con BSA all'omogenato utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri. Quindi, iterare più volte l'omogeneizzato digerito e posizionare la provetta sul ghiaccio. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Dopo aver centrifugato le cellule, decantare la bocca e poi pidacciare gli eritrociti contaminanti all'interno del pellet di cellule della frazione vascolare stromale. Con tre millilitri di tampone CK. Aggiungi rapidamente il buffer fax per neutralizzare il buffer A CK.Dopo il lavaggio e la rep pellettizzazione, le celle rimettono in sospensione il pellet nel tampone fax. Quindi contare le cellule vitali mediante esclusione trian blue e diluire ulteriormente la sospensione cellulare fino a una concentrazione finale da cinque a 10 volte da 10 a sei cellule per millilitro. Iniziare la colorazione incubando le cellule con anticorpi bloccanti anti-US CD 16, CD 32 FC a una concentrazione finale di 0,5-1 microgrammo per 10 nelle sei cellule per 10 minuti su ghiaccio.Quindi dividere le celle in dimensioni maggiori o uguali a 10 per le sei aliquote e trasferire le aliquote in tubi a fondo tondo di polistirene da 12 x 75 millimetri. Combinare le celle in eccesso in un numero adeguato di provette per accogliere la compensazione richiesta e la fluorescenza modificata meno uno controlli. Quindi aggiungere gli anticorpi primari coniugati al fluoro quattro e i controlli isotipici nelle provette appropriate alle concentrazioni appropriate.Dopo aver incubato i campioni al buio a quattro gradi Celsius per 30 minuti, lavare i campioni due volte in due millilitri di tampone fax Resus sospendendo i pellet in una quantità maggiore o uguale a 400 microlitri di tampone fax Dopo il secondo lavaggio, trasferire i campioni in nuove provette a fondo tondo in polistirene da 12 x 75 millimetri dotate di parti superiori del tubo del filtro per celle da 35 micrometri. Poco prima dell'analisi, aggiungere un dado di vitalità per la discriminazione delle cellule morte vive ai campioni appropriati. Quindi utilizzare un controllo negativo non colorato per regolare la dispersione laterale su una scala logaritmica e la dispersione in avanti su una scala lineare.Quindi, disegnare un gate iniziale di diffusione della luce in base al tipo di cella analizzata e regolare il guadagno del tubo fotomoltiplicatore in modo che le celle non colorate si trovino all'estrema sinistra di un singolo istogramma a parametro approssimativamente centrato sulla tenda dei due segni per i canali appropriati. Utilizzando le perle di compensazione della cattura degli anticorpi, eseguire la compensazione multicolore e quindi impostare i gate sperimentali in base alla fluorescenza modificata precedentemente preparata meno uno controlli. Infine, raccogliere il numero appropriato di eventi in base alla prevalenza della popolazione di interesse e registrare i dati sperimentali.In questa prima serie di grafici di densità, le cellule della frazione vascolare stromale isolate dal tessuto adiposo epidermico delle urine sono state colorate per F 4 80 e CD 11 B per l'identificazione dei macrofagi del tessuto adiposo. Questi primi tre pannelli dimostrano la strategia iniziale di gating, compresa la discriminazione del doppietto di diffusione della luce e i cancelli di vitalità. Nei prossimi due pannelli, si possono osservare controlli rappresentativi di fluorescenza modificata meno uno utilizzati per impostare i gate sperimentali.In questo esempio, gli anticorpi F 4 80 e CD 11 B sono stati sostituiti con controlli isotipici appropriati per tenere conto dell'autofluorescenza e del legame non specifico. Le porte del quadrante sono state quindi disegnate per identificare i macrofagi vitali del tessuto adiposo F quattro 80 CD 11 B. La proporzione di macrofagi del tessuto adiposo F 40 80 positivi CD 11 B positivi isolati da topi alimentati con basso contenuto di grassi e ad alto contenuto di grassi potrebbe quindi essere confrontata come illustrato in questi grafici di densità rappresentativi.In questa prossima serie di pannelli, il gate iniziale di diffusione della luce è stato limitato alla popolazione di linfociti per evitare di includere cellule mieloidi autofluorescenti. In queste ultime due coppie di pannelli, viene mostrato il gating rappresentativo per le cellule T del tessuto adiposo CD quattro positive e CD otto positive. I linfociti vitali del tessuto adiposo sono stati inizialmente sottoposti a controllo per TCR R beta tcr.Le cellule T del tessuto adiposo R beta positivo sono state quindi controllate per l'espressione di CD quattro e CD otto. È stato quindi possibile confrontare la proporzione di cellule T beta TCR e di cellule T CD quattro positive e CD otto positive isolate dal tessuto adiposo di topi alimentati ad alto contenuto di grassi e a basso contenuto di grassi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule immunitarie del tessuto adiposo.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule staminali derivate dalla cresta neurale (ADSC) derivate da creste neurali marcate in modo fluorescente da tessuto adiposo dell'arco periaortico murino. Dopo l'isolamento, le NCADSC vengono rilevate, selezionate utilizzando la smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza e successivamente coltivate su una piastra, promuovendo la proliferazione cellulare.

Isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa da tessuto adiposo periaortico murino

Nel 2001, i ricercatori della UCLA hanno descritto l'isolamento di una popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule o ASC staminali derivate da tessuto adiposo, dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive l'isolamento di ASC da lipoaspirato utilizzando un protocollo digestione enzimatica manuale mediante collagenasi.

Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

Presentiamo le tecniche necessarie per isolare la frazione vascolare stromale (SVF) dai depositi di tessuto adiposo inguinale (sottocutaneo) e perigonadico (viscerale) di topo per valutare la loro espressione genica e l'attività collagenolitica. Questo metodo include l'arricchimento di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC)ad alto contenuto di Sca1 utilizzando la separazione cellulare immunomagnetica.

Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica<sup&gt; alta</sup&gt; derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del &gt;90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.

Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino

Impara a isolare le cellule immunitarie dal tessuto adiposo mediante digestione con collagenasi e citometria a flusso. Questo metodo consente di quantificare macrofagi e linfociti T per studiare le malattie immunometaboliche.

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

Esplora altri video