Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di inoculare attraverso l'iniezione con ago, una coltura di sospensione cellulare MAUS USTA Lago ed eseguire uno screening della reazione di resistenza alla malattia delle linee di ingresso incrociate del labirinto tete e del labirinto teosinte. Ciò si ottiene selezionando prima le linee di piante per l'inoculazione e lo screening. Successivamente, vengono piantati i semi per gli esperimenti sperimentali e di inoculazione con iniezione con ago di controllo.

10 giorni dopo, la sospensione cellulare prodotta dall'U viene iniettata nello stelo di ogni pianta. Infine, vengono confrontate le reazioni di resistenza degli impianti sperimentali e di controllo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una corretta inoculazione dell'iniezione con ago attraverso la visualizzazione del fenotipo della pianta inoculata con te. Mais.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che rilascia l'agente patogeno direttamente tra le foglie. Questo elimina il problema della penetrazione dell'agente patogeno. Per iniziare a selezionare le linee di piante per l'inoculazione e lo screening come mostrato qui, per questo studio sono state utilizzate due linee di labirinto, cinque linee di teosinte e 40 linee trasversali di labirinto di Teosinte con resistenza non caratterizzata a U Mais per esperimenti sperimentali e di inoculazione con iniezione di ago di controllo.

Pianta quattro semi di ogni linea di piante in piccoli appartamenti spingendo i semi di circa mezzo pollice nel terreno con un dito e coprendoli leggermente di terra. Quindi posiziona le piante in una camera di crescita e innaffia i semi fino a quando non sono in ammollo, assicurandoti che rimangano sotto il terreno Dopo l'irrigazione. Coltiva le piante con ambienti diurni e notturni di 28 e 20 gradi Celsius e cicli di luce e buio rispettivamente di 14 e 10 ore.

E circa 500 micromolari per metro quadrato al secondo di radiazione fotosinteticamente attiva nella parte superiore della chioma. Mantenere l'umidità relativa durante il giorno e la notte rispettivamente a circa il 70% e il 90% e mantenere tutte le piante nella stessa camera di crescita per mantenere un ambiente di crescita congruente in tutto l'esperimento. Otto giorni dopo aver piantato i semi, usa un anello sterile per striare l'huis da un brodo di glicerolo congelato sull'agar destrosio di patata o sulle piastre PDA incubare a 30 gradi Celsius per due giorni e monitorarlo regolarmente per assicurarsi che cresca bene sotto una cappa a flusso laminare.

Usa uno stuzzicadenti sterile per selezionare una singola colonia per ogni ceppo e mettili in provette da tre millilitri di brodo PD. Incubare le colture a 30 gradi Celsius e 200 RPM per due giorni, controllando periodicamente la crescita. Quindi, misurare l'OD 600 delle colture per assicurarsi che siano state coltivate fino a un OD di 1,0.

Utilizzando l'acqua, portare le colture a una concentrazione finale di 1 milione di cellule per millilitro in un volume finale di 30 millilitri. Questa concentrazione di sospensione cellulare patogena provoca costantemente una buona infezione delle piante. Quindi, prima dell'inoculazione, mescola volumi uguali dei due ceppi che hai prodotto.

Prima di riempire una siringa da tre millilitri con la sospensione cellulare, riempire la siringa di controllo con acqua per iniettare con il minimo danno alla pianta. Il tessuto attacca un ago ipodermico di 457 millimetri per 1,3 centimetri all'estremità di ciascuna siringa. Rimuovi le piante dalla camera di crescita e iniettale con un angolo di 90 gradi appena sopra la linea del suolo.

Inserire con cautela l'ago dell'U maus nello stelo di una pianta sperimentale fino a quando non si trova al centro dello stelo. Iniettare circa 100 microlitri della sospensione cellulare. Spingerà attraverso lo stelo e sarà visibile mentre si muove nel vortice della pianta.

Continuare a iniettare ulteriori piante sperimentali fino a quando le siringhe non si svuotano. Quindi riempirla d'acqua per pulire l'ago da qualsiasi tessuto vegetale e riempire la siringa fino a quando tutte le piante non sono state iniettate. Utilizzare la siringa dell'acqua per iniettare gli impianti di controllo in modo simile.

Quando le iniezioni sono complete. Rimetti le piante nella camera di crescita ogni giorno. Innaffia solo il terreno e controlla lo sviluppo di agenti patogeni e le reazioni di resistenza delle piante.

Utilizzando una valutazione della reazione di resistenza da uno a cinque, scalare, valutare e registrare le reazioni di resistenza per ciascuna pianta 7, 10, 14 e 21 giorni dopo l'inoculazione o DPI. I valori numerici sulla scala di valutazione aumentano con l'aumentare della gravità della malattia. Ad esempio, A1C una A o due reazioni di resistenza indicano resistenza.

Una reazione di tre, quattro o cinque resistenze indica suscettibilità. Confrontare le reazioni di resistenza degli impianti sperimentali e di controllo e selezionare gli impianti sperimentali con A1C con una a o due reazioni di resistenza. Queste piante sono considerate resistenti al matis.

In questo esperimento, la maggior parte delle piante inoculate con humus, erano suscettibili all'infezione. Le piante hanno mostrato un grave sviluppo della malattia dimostrato dalla formazione di galle del fusto e della galla basale con spore nere di teli. Diverse piante sono morte dopo l'inoculazione a causa della gravità della malattia.

Al contrario, le piante di controllo erano molto pulite e non mostravano lo sviluppo di agenti patogeni su nessuna parte della pianta, indicando che lo sviluppo di agenti patogeni sulle piante sperimentali era dovuto all'inoculazione con iniezione con ago con U Mais, sono state identificate tre linee di aggressione incrociata Mais Teosinte resistenti a U Mais, e un'inoculazione riuscita è stata verificata dalla sclerosi minore, ciano nella produzione, o formazione di galle fogliari minori. Questa tecnica può essere eseguita in modo altamente efficiente con riproducibilità. Questo aiuta nell'inoculazione e nella fenotipizzazione di un gran numero di piante.