Name: Nanomeccanica di interazioni farmaco-bersaglio e di rilevamento di resistenza antibatterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Scopri la nanomeccanica delle interazioni farmaco-bersaglio per quantificare la resistenza antibatterica utilizzando sensori a leva. Questo metodo innovativo facilita la scoperta di nuovi agenti antibatterici.

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Joseph W. Ndieyira è stata sostenuta da Engineering and Physical Sciences Research Council (EPRSC), Centro di ricerca interdisciplinare in Nanotecnologie (IRC), la Royal Society (RS) e Biano consulenza (BNC). Ringraziamo, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matteo Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment e Gabriel Aeppli per le discussioni utili.

1. Preparazione di cantilever <ol><li> Utilizzando Teflon pinzette immergere numero selezionato di circuiti integrati a sbalzo (cantilever ciascuna, di 500 micron di lunghezza, 100 micron di larghezza e 0,9 micron di spessore) in una soluzione Piranha preparata di fresco (con rapporto di 01:01 H 2 SO 4 e H 2 O 2) per 20 min . </li><li> Dopo circa 20 minuti togliere i chip a sbalzo dalla soluzione piranha e sciacquarli accuratamente con acqua deionizzata e trasferire immediatamente in una soluzione piranha appena preparata. Ripetere il punto 1.1 di cui sopra, se i chip contengono macchie di sporco in caso contrario procedere alla fase successiva. </li><li> Dopo una pulizia completa in acqua deionizzata, risciacquare con etanolo puro e asciugare i chip a sbalzo su una piastra riscaldante a 75 ° C per eliminare eventuali tracce di acqua. Ispezionare utilizzando un microscopio ottico per confermare la loro pulizia. </li><li> Trasferire i chip a sbalzo ripuliti in camera di evaporazione e pompa giù, mira a raggiungere un vuotopressione di 10 -7 mbar. </li><li> Una volta che la pressione di vuoto richiesto è raggiunto, cappotto un lato di ciascun array cantilever con un 2 nm titanio primo a agisce come strato di adesione prima di un ulteriore strato di oro 20 nm di spessore. Per confermare il loro spessore, utilizzare monitor a cristalli di quarzo collocato direttamente sopra la sorgente di destinazione. </li><li> Lascia rivestite chip sensore a sbalzo in oro nella camera per 1-2 ore a raffreddare sotto vuoto prima di aprire. </li><li> Trasferire i chip di fresco evaporati in un recipiente di immagazzinaggio di vuoto riempito con argon per impedire qualsiasi forma di contaminazioni. </li></ol> 2. Cantilever Chip Funzionalizzazione <ol><li> Prima, disporre i tubi micro-capillari su una fase funzionalizzazione 2 secondo le dimensioni del passo di 250 micron cantilever. </li><li> Poi iniettare 2 mM soluzioni etanoliche tiolici di molecole bersaglio di superficie, cioè mucopeptides batteriche (D-Ala e D-Lac), e un &#39;inert &#39;alkanethiol terminante in trietilenglicole (PEG), noto per resistere biomolecolare adsorbimento. Ciascuno dei 16 tubi capillari devono contenere un assortiti molecole di cattura superficiali determinati in modo casuale al fine di evitare pregiudizi utente. </li><li> Avanti incubare per 20 min le travi a sbalzo in microcapillari pieno di soluzioni tioli contenenti molecole di cattura di superficie. Assicurarsi che le soluzioni delle molecole di cattura di superficie sono confinati su ogni singolo sensore a sbalzo per evitare o minimizzare contaminazioni crociate. Se questo processo viene utilizzato correttamente, dovrebbe alterare sistematicamente i cantilever rivestite d&#39;oro appena preparati in sensori attive chimicamente formate da SAM permette di obiettivi mucopeptide batteriche a formare sulle superfici rivestite d&#39;oro come recettori. </li></ol> 3. Preparazione della soluzione <ol><li> Sciogliere 0.1 M mono-e di-base sali di fosfato di sodio in acqua ultrapura (18,2 MW · cm resistività) e mescolare tØ produrre un valore di pH di 7,4. </li><li> Aggiungere 0,002% del PS80 per le soluzioni tampone per ridurre al minimo gli effetti di aggregazione causati da interazioni non specifiche di molecole di farmaco per la vetreria. </li><li> Diluire farmaci con soluzioni appena tamponata al differenti concentrazioni desiderate che consentiranno il calcolo di K d. </li><li> Filtrare le soluzioni farmacologiche preparate utilizzando filtri da 0,2 micron e ultrasuoni per 5 minuti a temperatura ambiente prima di spurgo con argon. </li><li> Ripetere la procedura con il farmaco nel siero tamponata utilizzando siero intero. Delicatamente vortice per 15 minuti con l&#39;aggiunta di 5 min per garantire la completa solubilità. </li></ol> 4. Surface stress Detection <ol><li> Caricare un funzionalizzato chip del sensore a sbalzo in una camera di cella di flusso del liquido. </li><li> Allineare il punto laser sulla estremità libera di ciascun sensore e confermare l&#39;allineamento riscaldando la camera di liquido per 1 ° C. Tutti gli otto d&#39;oro rivestite array di sensori a sbalzo devono essere sottoposti Compressive ribasso piegatura causa dell&#39;effetto bimetallico causato dalle differenze nei tassi di espansione di silicio e oro. </li><li> Dopo il riscaldamento per circa 10 minuti, lasciare che i cantilever raffreddare per altri 10 min. </li><li> Calcolare la variazione di curvatura ai segnali di flessione massimo tra sensori cantilever singoli e se la deviazione standard relativa dei segnali di flessione è ≤ 5% quindi accettare l&#39;allineamento come auspicabile altrimenti ripetere il processo. </li><li> Quindi, misurare le frequenze di risonanza di tutte le otto cantilever di calcolare le costanti di primavera. Se la variazione della costante fra ciascun sensore sbalzo entro un chip molla è ≤ 1% quindi accettare il chip come aventi proprietà meccaniche coerenti altrimenti sostituire il chip sensore cantilever. </li><li> Successivamente, utilizzare un sistema fluidico (Modello Genie Plus) attraverso una valvola a sei vie per realizzare lo scambio liquido all&#39;interno della cella di flusso durante l&#39;acquisizione dei dati deve essere realizzato tramite un LabView automatizzato cosìftware. </li><li> Per monitorare il cantilever flessione dei dati, utilizzare i seguenti protocolli di misura: i) iniettare soluzione tampone o siero senza farmaci per la misurazione di controllo della durata di 5-30 minuti per stabilire una linea di base; ii) iniettare la soluzione di droga per 30-60 min; iii) iniettare 10 mM HCl lavaggio per 10-60 min a dissociarsi complesso farmaco vincolato; iv) infine iniettare un ulteriore lavaggio con la soluzione tampone per altri 5-30 minuti per rigenerare i peptidi superficie e per ripristinare il segnale di base. Controllare sempre che i segnali sono acquisiti sotto flusso di liquido costante di 30-180 microlitri / min e ad una temperatura fissa di 25 ° C in un armadio a temperatura controllata. </li><li> I segnali piegatura assoluti di tutte le otto cantilever devono essere monitorati con tempo seriale multiplato metodo fascio ottico con un singolo rivelatore sensibile posizione. </li><li> Analizzare i segnali di curvatura da ogni concentrazione di farmaco, le piegature differenziali risultanti vengono convertiti in un stres differenzialis tra i lati superiore e inferiore del cantilever usando l&#39;equazione di Stoney. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi è dichiarata

Questi risultati dimostrano che i sensori dell&#39;array cantilever hanno la sensibilità per rilevare e quantificare i cambiamenti nella farmaco-bersaglio interazioni di legame particolare in resistenza alla vancomicina associata alla delezione di un singolo legame H dalla tasca di legame del farmaco. Mostriamo una sensibilità di rilevazione nanomolare di Van, in accordo con precedenti risonanza plasmonica di superficie (SPR) studi 18,19, e rivelano che il metodo a sbalzo in grado di rilevare direttamente e quantificare molecole di droga nel sangue a concentrazioni clinicamente rilevanti, come ordinariamente applicata nella pratica clinica. I nostri dati suggeriscono che lo stress superficie differenziale può essere descritto da una forma equazione prodotto (1), cioè (i) un termine chimica che descrive le specifiche eventi di legame farmaco-bersaglio, e (ii) un termine geometrico che descrive la connettività meccanico tra reagito chimicamente siti superficiali, il che implica che le interazioni chimiche locali a scindere il meccanico globaleAl interazioni del cantilever. Mentre il termine chimico è dato dalla isoterma di adsorbimento Langmuir classica, il termine geometrico rivela un meccanismo percolativo dei farmaci bersaglio superficiali indotte sollecitazioni modifiche. La soglia critica pc ~ 10% (Figura 5) è necessario rilevare la flessione cantilever differenziale, mostrando che lo stress superficie viene trasdotto collettivamente quando una frazione relativamente grande superficie è occupata da molecole antibiotiche. Per p ≥ pc, la connettività meccanica tra siti superficiali trasformati chimicamente costituisce progressivamente, e le interazioni repulsive a corto raggio come interazioni steriche tra i nodi della rete nanomeccanico crescono i flessione verso il basso dell&#39;intero cantilever. Si è ipotizzato che il nostro modello di percolazione nanomeccanico può giocare un ruolo importante nel modo antibiotico glicopeptide di azione nei batteri reali. Questi risultati evidenziano l&#39;elevata sensibilità della tecnologia cantilever per studying modalità di azione degli antibiotici &quot;e rappresentano uno strumento di ricerca romanzo per studiare i farmaci per migliorare la comprensione delle operazioni di antibiotici a scala nanometrica per informare e consentire la scoperta di farmaci potenti per controllare i problemi di infezioni superbug. Per preparare il sistema a sbalzo per misure riproducibili e sensibili, abbiamo affrontato una serie di obiettivi del protocollo, in particolare per il caricamento del campione nella cella microfluidica e procedure operative standard per consentire rilevazioni nanomeccaniche quantitativi. Significato della tecnologia a sbalzo rispetto ai metodi esistenti In sintesi si segnala che, mentre questa tecnologia è stato proposto più di 25 anni fa, non ha trovato la sua strada nella clinica a causa della mancanza di misurazioni accurate e ripetitive su medicalmente obiettivi significativi. Qui mostriamo le procedure che stabiliscono la rilevanza di utilizzo cantilever nanomeccaniche di indagare il meccanicoal di antibiotici influenza sui bersagli parete cellulare batterica e per rilevare la resistenza antibatterica. Metodi di screening di farmaci convenzionali richiedono un certo tipo di marcatura fluorescente o radioattiva di una molecola reporter per misurare il legame di un analita al suo bersaglio, spesso in connessione con un saggio di legame competitivo o enzimatico e saggi della proteina 20. Etichettatura di biomolecole non è solo in termini di tempo e costoso ma l&#39;etichetta può anche interferire con l&#39;interazione molecolare ostruendo il sito di legame, portando a falsi negativi. Inoltre, i composti fluorescenti sono spesso idrofobo che può portare a fondo vincolanti positivi e falsi. A causa di queste limitazioni, vi è un crescente interesse per nuove tecniche di etichetta-liberi che permettono a qualsiasi complesso molecolare per essere proiettato con lo sviluppo di analisi minimo. Le più affermate tecnologie di superficie label-free al momento sono SPR e Quartz Crystal Microbalance (QCM). In contrasto SPR che misura esimocostante dielettrica e, un&#39;etichetta - tecnologia cantilever libero rileva il ceppo superficie generata da un&#39;interazione ligando-recettore, che può misurare direttamente le forze generate dal nanomeccaniche specifico legame di ligandi per recettori di superficie. L&#39;unicità di questi sensori è che la loro sensibilità non si basa sulle proprietà dielettriche causati da variazioni di massa dovuto al legame come in SPR e QCM ma piuttosto su una minuta variazione indotta nel piano sollecitazione superficie l&#39;analita, rendendo la tecnologia unico adatta per studiare le nanomeccanica di molecole farmacologiche ad clinicamente rilevanti concentrazioni di antibiotico (3-27 micron) 17. Cantilever sono anche particolarmente adatti a piccola molecola (come i frammenti di DNA e farmaci) rilevamento in condizioni fisiologiche tra cui ambienti complessi, che è in gran parte la base dell&#39;industria farmaceutica e sarà dunque servire come strumento complementare nella scoperta della droga. La tecnologia a sbalzo sono stati applicati con successo nelcampi della genomica 3,5, gas sensing 21, proteomica 22 e farmaci 1. Inoltre, cantilever sono fabbricati con la tecnologia del silicio a basso costo e per la loro compatibilità con i processi di microfabbricazione, cantilever possono essere miniaturizzati per aumentare la sensibilità e la parallelizzazione in grandi array di sensori per lo screening multiplo composto droga e superiori ricco di informazioni di throughput test di screening. Miglioramenti della strumentazione e disegno sperimentale consentirà una vasta gamma di interazioni da analizzare in tempo reale per contribuire a far avanzare la ricerca di una nuova generazione di Superdrugs per affrontare i problemi della multidrug infezioni resistenti. Fasi critiche all&#39;interno del protocollo Lo sviluppo di protocolli di misura affidabili è fondamentale per le applicazioni di questa tecnologia. Per ottenere misurazioni quantitative farmaco-bersaglio soddisfacenti e per determinare la minima concentrazione di antibiotici tcappello potrebbe essere rilevato in un tampone o di sangue, siero passaggi critici del protocollo sono stati affrontati. Il primo compito consiste tuning e ottimizzazione chimiche cattura di superficie per migliorare il rilevamento specificità sbalzo e sensibilità. Innegabilmente, trasduzione stress di superficie è un fenomeno collettivo, richiedendo una relativamente grande frazione della superficie da ricoprire per stabilire la connettività tra regioni chimicamente reattivi. Mostriamo che variando la densità dei peptidi superficie sottostante, una soglia critica ~ p ≥ 10%, viene determinato se la scala sollecitazione superficiale in funzione della densità peptide e zero altrimenti (Figura 5). È importante che gli esperimenti sono progettati per studiare l&#39;uniformità di sollecitazione lungo le cantilever per garantire deflessioni massime di segnale per misurazioni sensibili. Inoltre, i protocolli efficienti di rigenerazione della superficie devono essere a posto, consentendo in tal modo una serie di misurazioni di ciclo e di ridurre i costi per ogni test. Mentre la progettazione di un recettore di superficie utilizzando tiolato fine idrofobica, l&#39;orientamento della molecola del recettore e la spaziatura tra di esse è vitale per permettere l&#39;auto-assemblaggio di imballaggio denso a causa di interazioni Van-der-Waals fra le molecole di minimizzare le interazioni aspecifiche. Inoltre, le molecole di cattura devono contenere un polietilenglicole (PEG) linker per consentire una parte della matrice di rilevamento di essere idrofilo per impedire inserimento di molecole di analita nella soluzione di reagire direttamente con la superficie di oro non rivestito. Le molecole linker PEG devono agire come distanziatori per ridurre i vincoli sterici e permettono quindi gli analiti soluzione di interagire specificamente con i recettori di superficie per indurre il cambiamento misurabile stress di superficie. Il sensore matrice sbalzo deve essere saggiato con almeno una misurazione di riferimento in situ e il segnale visualizzato in tempo reale è una deflessione differenziale, ottenuta sottraendo la deflessione del cantilever assoluto riferimento dal sEnsing cantilever. Così un cantilever riferimento è essenziale per tenere conto di interazioni non specifiche, quali variazioni di temperatura, variazioni dell&#39;indice di rifrazione o interazioni sul lato inferiore nonfunctionalized del cantilever. Ottimizzazione della portata (~ 30-150 microlitri / min) forma un passaggio critico all&#39;interno del protocollo perché assicura un efficace scambio di liquidi ed una sufficiente massa costante trasporto di materiali di soluzione. La progettazione di una cella a liquido deve consentire volume ottimale (5-80 ml) per portate veloci per permettere perfetto liquido di scambio per superare le limitazioni di trasporto di massa. La portata è particolarmente critica durante l&#39;esecuzione di misure cinetiche 23. Grandi camere del liquido di volume richiedono tassi incontrollabili alta portata che portano a requisiti di volume del campione di grandi dimensioni, che aumentano inutilmente il prezzo del saggio. Precedentemente abbiamo usato a gravità per iniettare diversi campioni nella camera del liquido di misurazione. Flusso di gravità ha il vantaggio che does non richiedono parti meccaniche e quindi non introduce rumore supplementare nel sistema. Tuttavia, la sua notevole svantaggio è che funziona in maniera affidabile solo a tassi relativamente elevati di flusso (~ 200 l / min). Ovviamente, una portata minore (≤ 1 ml / min) richiederebbe volumi di campione limitato per unità di tempo, ma dall&#39;altro rende le reazioni molto più lenta e richiede più tempi di contatto da qui. Inoltre, flusso di gravità ha una grande varianza nella sua portata in quanto dipende la differenza di altezza tra ingresso e uscita, che diminuisce come soluzioni campione sono consumati durante l&#39;esperimento. Per evitare problemi di flusso di gravità, una pompa a siringa deve essere utilizzata. Il vantaggio di utilizzare una pompa a siringa è che permette una velocità di flusso costante in un lungo periodo di tempo permette agli esperimenti da realizzare in un ambiente più controllato. Limitazioni del protocollo La sfida principale per ottenere una riproducibile und specifico rilevamento biologico utilizzando sensori cantilever sta nel garantire che le proprietà dello strato recettore sono biochimicamente &quot;attivo&quot; e uniforme per ogni test. Il segreto del successo sperimentale è in una attenta pretrattamento del chip sensore con un protocollo standardizzato e pulizia con immobilizzazione chimiche linker per orientare le molecole recettoriali nella loro conformazione attiva. Nella nostra configurazione attuale, abbiamo funzionalizzare gli array a sbalzo utilizzando piccoli capillari di vetro, che potrebbero essere oggetto di alcuni inconvenienti e può essere problematico in alcuni casi. Questi capillari di vetro sono aperti ad entrambe le estremità e quindi i solventi di esempio può evaporare facilmente. Ad esempio, se la temperatura della fase funzionalizzazione non è controllata con precisione, la velocità di evaporazione può variare significativamente in tempi diversi soprattutto quando si usano solventi volatili come l&#39;etanolo. Vi è anche una possibilità di lieve variazione nel tempo di incubazione da uno sbalzo all&#39;altro gato che i liquidi di rilevamento devono essere caricati consecutivamente nei capillari. L&#39;altro fattore limitante nella funzionalizzazione capillare è la mancanza di capacità di assicurare che cantilever siano inserite nei capillari esattamente nello stesso modo. Inoltre, a volte i cantilever devono essere tirato fuori leggermente dai capillari per evitare la contaminazione incrociata dei campioni liquidi possono fluire sul corpo chip. Siamo in grado di risolvere questi problemi con l&#39;impiego di osservatori a getto d&#39;inchiostro come una procedura di rivestimento superficiale alternativa a cantilever cappotto. Mentre sarebbe consentire il controllo esatto di rivestimento campione con la possibilità di scaling up per grandi array, l&#39;inconveniente più comune è che le piccole gocce che si depositano sulle cantilever possono evaporare in pochi secondi e richiede un ambiente a umidità controllata. Pertanto, il tempo di incubazione non può essere regolata facilmente, che potrebbe essere desiderabile per alcune applicazioni. Il sottile gioco dei fattori come campione voLume, tempo di incubazione e di tasso di evaporazione hanno un impatto diretto sulla esposizione dei cantilever al campione funzionalizzazione e la cura deve essere presa per assicurare chimiche superficiali ottimizzate per saggi sbalzo come qualsiasi piccola variazione della densità molecolare recettore avrà un grande effetto sul cantilever risposta. Modifiche al progetto sperimentale (cioè tecniche o materiali alternativi) Per superare la sfida principale per ottenere procedura rivestimento riproducibile per il futuro sviluppo della tecnologia a sbalzo, diverse strategie sono richieste che avrebbe utilizzato a sbalzo integrate nei canali microfluidica. L&#39;idea è che i chip a sbalzo speciali devono essere progettati in modo che ogni sbalzo viene inserito in un proprio canale di consentire in linea nelle procedure di funzionalizzazione situ in cui i canali vengono affrontati singolarmente. Queste modifiche progettuali sperimentali consentirebbe processo di rivestimento da eseguireed in un ambiente controllato e chiuso in cui l&#39;esposizione al solvente è monitorato proprio dal tempo di incubazione e di portata per immobilizzazione automatizzata di molecole di cattura sui chip sbalzo. Gli stessi canali possono quindi essere utilizzati per gli esperimenti di legame effettivo in cui tutti i cantilever potrebbero essere esposti alla stessa soluzione di analita. Oltre alla procedura di funzionalizzazione a sbalzo, il meccanismo di lettura a sbalzo avrebbe anche bisogno di miglioramento. Il metodo di deflessione del fascio ottico è altamente sensibile ed è stato usato con successo in tecnologia microscopia a forza atomica (AFM) per molti anni. Tuttavia, per le applicazioni di sensori sbalzo autoportanti la lettura ottica ha alcuni svantaggi, ad esempio non permette misure in liquidi opachi come sangue, l&#39;allineamento di un array di laser può richiedere molto tempo e noioso e la configurazione corrente non può distinguere tra deviazioni basculanti e verticale. Così il futuro sviluppo del cantilevtecnologia ER dovrà prendere in considerazione gli aspetti del design del sensore generale (ad esempio, geometrie a sbalzo) e la lettura a sbalzo per i protocolli di misura robusti, sia nei campi e ambienti di laboratorio. Manalis e collaboratori 22 hanno sviluppato nuovi tipi di sensori cantilever cave dove i cantilever hanno un canale microfluidico incorporato all&#39;interno del fascio, consentendo al dispositivo di operare sotto vuoto con fattori di alta qualità. In questa modalità, cantilever agiscono come microbilancia 22, e quindi non è più necessario avere una asimmetria tra le due parti rispetto alla funzionalizzazione, così le molecole di cattura possono essere physisorbed o covalentemente attaccati direttamente sul silicio, tipicamente usando SAM o silani 24. I cantilever possono anche essere modificati con uno strato polimerico sottile che verrà coniugato ad anticorpi per 25 biochimici di rilevamento. Risoluzione dei problemi Un professionista comuneblema associato alle misurazioni sbalzo è l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nella cella di flusso microfluidica. Si deve prestare attenzione a garantire che bolle d&#39;aria vengono introdotti nella cellula liquido durante il montaggio del chip. Segnale drifting è anche un altro problema comune causato dalle differenze di temperatura dei campioni. I cantilever devono essere equilibrati a stabilizzarsi prima che le misurazioni sono effettuate. Tutti i buffer, analiti e soluzioni rigenerazione devono essere memorizzati nella stessa stanza come strumento sbalzo per consentire tutte le soluzioni di avere la stessa temperatura. Anche se la pompa siringa può fornire portate molto precisi ed estremamente bassa, è generalmente associata al rumore meccanico nelle misure sbalzo. È quindi importante mettere a punto un semplice ed efficace riduttore di rumore per evitare rumori inutili nei segnali di deflessione. Il riduttore di rumore consiste di piccolo serbatoio liquido situato tra la pompa a siringa e la cellula liquido, che assorbe tegli rumore meccanico dalla pompa. A causa della natura sensibile del rivelatore ottico, il sistema di misurazione a sbalzo dovrebbe idealmente essere utilizzato in una configurazione chiusa per bloccare eventuali luci parassite di interferire con il sistema di lettura ottica. Inoltre, la qualità degli strati di rilevamento può diminuire in modo significativo se un gran numero di fasi di lavaggio sono effettuate su cantilever limitano la durata del chip sensore. Applicazioni alternative o futuri Dopo aver imparato questa tecnica Cantilever rivestiti con SAM terminano nella ammino-o-gruppo carbossilico possono essere usati come sensori di pH. I gruppi funzionali terminali o protonate deprotonare seconda del pH della soluzione e può generare una carica superficiale che porta il cantilever per piegare 24. Dato che i sensori cantilever possono monitorare interazioni farmaco-bersaglio associati alla destabilizzazione della parete cellulare dei batteri vita 1,6,7, saranno pertanto contribuire ala ricerca e per lo sviluppo di una nuova generazione di antibiotici per combattere le infezioni farmaco-resistenti. In cantilever futuro sarebbe utilizzato come microbilance per misurare la massa e tassi di crescita delle cellule singole 26. La tecnologia a sbalzo sarà benefico per lo studio della risposta cellulare a diversi fattori di crescita o farmaci. Offrirà inoltre un nuovo strumento per la rapida individuazione di biomarcatori multipli, che ha immediata rilevanza nelle applicazioni mediche e point-of-care. Data la versatilità, piccole dimensioni, e la solidità di sensori cantilever, formeranno un monitor sensibile di fattori ambientali nocivi. Essi hanno già dimostrato la loro sensibilità nel rilevare i gas tossici e nocivi che possono sfuggire dal laboratorio e le unità di produzione industriale nell&#39;ambiente, come ad esempio l&#39;acido fluoridrico 27 o cianuro di idrogeno 28.

Le molecolari di riconoscimento paradigma alla base di ampie fasce della biologia e della medicina. In farmacologia, per esempio, l&#39;obiettivo è di interferire con un percorso patologico di mira un partecipante chiave di un processo biochimico come transglycoslyation o transpeptidazione che catalizza la reticolazione di peptidi batterici parete cellulare. Il disegno farmaco viene quindi ridotto a definire una molecola adatta ad indirizzare una specifica docking sito batterica per indurre una misura perfetta. Un esempio classico emulare il successo di questo approccio è vancomicina (Van), che si rivolge la parete cellulare peptidoglicano, una caratteristica strutturale conservata di un batterio. In una nascente batterio Gram-positivo, la matrice peptidoglicano consiste di peptidi che terminano nella sequenza lisina-D-alanina-D-alanina, legato tramite un C55 lipidici 8-10 linker qui chiamati D-Ala. Questi peptidi a vista sui precursori peptidoglicano sono fondamentali per laprotezione meccanica delle cellule batteriche contro le forze ambientali dure, e soprattutto, non si trova nelle cellule umane, rendendoli bersagli ideali per farmaci antibiotici. Van lega specificamente al C-terminale dei peptidi batterici che formano una parete cellulare moderatamente forte Van-peptide complesso come mostrato in Figura 1. Questa interazione tra Van ed i peptidi blocchi esposte le azioni delle transpeptidasi e transglycosylases, che catalizzano la reticolazione delle pareti cellulari 1, efficacemente impedisce loro di reticolazione e quindi indebolisce nanomechanically la cellula batterica porta alla sua morte per rottura 1,6, 7. L&#39;emergere di Enterococcus vancomicina-resistenti (VRE) è un crescente problema sanitario 11 e perché la resistenza batterica in enterococchi pone a causa della sottile cambiamento di un&#39;ammide linkage di un estere collegamento 8, questa apparentemente semplice cambiamento strutturale sulla superficie del batterio cancella un singolo legame idrogeno dal sito attracco Van &#39;s, con conseguente modifica della tasca di legame. Importante questo processo altera il pentapeptide terminale alanina presente in Enterococcus vancomicina sensibile (AES) a una lisina-D-alanina-D-lattato 10,12, qui denominato D-Lac, ottenendo una riduzione significativa Van-D-Lac affinità di legame da tre ordini di grandezza di rendering Van terapeuticamente inefficace contro le infezioni da enterococchi 1, L&#39;allarmante crescita di batteri resistenti agli antibiotici è quindi guidando lo sviluppo di approcci innovativi per accelerare e ripristinare l&#39;attività antibatterica degli agenti antibatterici o la scoperta di farmaci più potenti contro multidrug resistenza batterica infezioni. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; I nostri esperimenti utilizzando cantilever free-standing si ispira ai sistemi come le celle che sfruttano l&#39;energia chimica in movimento. La capacità dei sensori cantilever di tradurre energia chimica in movimento meccanico li sonde unici con notevoli vantaggi per il monitoraggio perturbazioni meccaniche dei bersagli parete cellulare batterica in tempo reale rende. I sensori a sbalzo richiedono &#39;tag&#39; nessun reporter e biomolecole vengono rilevati rapidamente in una reazione a passo singolo. Essi possono schermare più farmaci in parallelo in ambienti fisiologici come soluzioni tampone e siero intero. Inoltre, la tecnologia a cantilever utilizza referenziamento situ per misure differenziali consentano loro di rilevare specificamente interazioni farmaco-bersaglio e, in virtù della loro fabbricazione attraverso vie di lavorazione dei semiconduttori standard, essi sono suscettibili di produzione di massa e parallelizzazione per screening ad alto rendimento di migliaia di farmaci per ora. In particolare più array di sensori a sbalzo, sono strumenti utili per lo studio antibiotico resistenza alla vancomicina - perché la resistenza alla vancomicina è essenzialmente un problema meccanico 1,6,7. Le reazioni tra un modello bersaglio parete cellulare batterica e Van in soluzione possono essere rilevati dal monitoraggio delle variazioni di sollecitazione clinicamente rilevante indotti da interazioni di legame farmaco-bersaglio. Lo stress generato da reazioni di superficie che si manifesta in un segnale di flessione a sbalzo è analizzato otticamente da sensori illuminando con un fascio laser. Inoltre adattando il rivestimento ricettivo della superficie batterica molecole bersaglio sulla parte superiore del sensore a sbalzo, vicino a un numero illimitato di analiti (Van), le specifiche interazioni biochimiche e la biomeccanica del modello batterica matrice parete cellulare viene monitorato in tempo reale. A parte l&#39;evento riconoscimento molecolare, ci sono diversi fattori che possono causare sensori cantilever la defSELECT, che includono - variazioni di temperatura, di legame non specifici o variazioni di indice di rifrazione della soluzione. Per tenere conto di segnali non specifici, misure differenziali in situ vengono eseguite dove la curvatura sia della misura e cantilever riferimento al controllo continuo per analizzare interazioni specifiche. Inoltre, la sensibilità di rilevamento dei sensori cantilever che dipendono dalle chimiche superficiali e della geometria può essere migliorata regolando la densità superficiale p (dove p è definito come il rapporto tra la superficie occupata da molecole di cattura per l&#39;intera superficie superiore dello sbalzo coperto dalla popolazione totale di molecole come determinato da X-ray spettroscopia di fotoelettroni (XPS) 1. Ecco questo protocollo dettagli come vancomicina o qualsiasi altro antibiotico vincolante per batterio precursori analoghi (mucopeptides) a concentrazioni clinicamente rilevanti in una soluzione tamponatasiero del sangue ND può essere rilevato utilizzando senza etichetta tecnologia a sbalzo. Superfici d&#39;oro freschi vengono utilizzati perché monostrati auto-assemblati (SAM) tendono a formare facilmente strati stabili su oro pulito 13,14. SAM consiste tipicamente di brevi molecole con un gruppo tiolico covalentemente attaccata alla superficie d&#39;oro mentre l&#39;unità di acquisizione desiderata sull&#39;altra estremità è permesso di interagire liberamente con gli obiettivi di analiti in soluzione. Tioli formano un sistema flessibile particolarmente dato che molti composti tiolici con diversi gruppi terminali chimici sono disponibili in commercio o sono facilmente sintetizzati in laboratorio. Tuttavia, occorre prestare attenzione a garantire che molecole con un gruppo tiolico devono avere i terminali corretti, ad esempio in una proteina o peptide di coniugazione, il gruppo amminico deve essere rivolto verso l&#39;interno per la reazione con il gruppo carbossilico del gruppo tiolico legato sul superficie a verificarsi. Qui, i tioli erano direttamente coniugati con mimetici tripeptidici di lipidi batterica II dal bparete cellulare acterial obiettivi sintetizzato metodologia in fase solida utilizzando commercialmente disponibile precaricato Wang-D-Ala e Wang-D-Lac resine e lo standard Fmoc-gruppo di protezione chimica 15. Anche se questa descrizione è focalizzata alla vancomicina, chiaramente può essere esteso ad altri antibiotici e infatti ulteriori studi sono invitati da ricercatori di diversi settori particolarmente in biochimica, farmacologia e scienza dei materiali di adottare facilmente questo protocollo per i propri esperimenti.

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>Non in produzione</td></tr><tr><td>Valvola</td><td></td> a sei vie <td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>Consente l'iniezione a concentrazione multipla</td></tr><tr><td>EB Evaporatore</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, Regno Unito</td><td>Il fascio di elettroni è preferibile a causa della deformazione dei cantilever causata da problemi di riscaldamento termico Recipiente</td></tr><tr><td></td><td></td> di stoccaggio <td>Agar Scientific, Regno Unito</td><td>Mantiene freschi i film rivestiti d'oro</td></tr><tr><td>Capillare</td><td></td> in vetro <td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td><td>Per la funzionalizzazione capillare degli array a sbalzo Modello</td></tr> di <tr><td>pompa Genie</td><td></td><td>Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td><td>Buono per la portata controllata di campioni liquidi in canali microfluidici</td></tr><tr><td>0,2-4,5 e mu; m Filtri</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>Per il filtraggio dei campioni</td></tr><tr><td>Chip</td><td></td> a sbalzo <td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Altamente sensibile</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, Regno Unito</td><td>Per la produzione di soluzioni tampone</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, Regno Unito</td><td>Per la produzione di soluzioni tampone</td></tr><tr><td>Polisorbato 80 (PS80) o Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>Utilizzato in soluzioni tampone per prevenire interazioni non specifiche su vetreria</td></tr><tr><td>DI acqua</td><td></td> deionizzata <td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td><td>Utilizzato per la produzione di soluzioni</td></tr><tr><td>Siero intero</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td><td>Utilizzato in misurazioni che imitano le condizioni fisiologiche</td></tr><tr><td>Vancomicina (Van)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Regno Unito</td><td>Farmaco utilizzato</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Regno Unito</td><td>Utilizzato per le procedure di pulizia della vetreria</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, Regno Unito</td><td>Utilizzato per le procedure di pulizia della vetreria</td></tr><tr><td>D-Ala e D-Lac</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Recettori di superficie rivestiti sul cantilever per il rilevamento delle interazioni</td></tr> <tr>farmaco-bersaglio<td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td><td>Software utilizzato per l'interfaccia strumentale per consentire misure controllate</td></tr></tbody></table>

nanomeccanica di interazioni farmaco-bersaglio e di rilevamento di resistenza antibatterica

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Il sensore a sbalzo, che agisce come un trasduttore di reazioni tra modello matrice parete cellulare batterica immobilizzato sulla sua superficie e farmaci antibiotici in soluzione, ha mostrato un notevole potenziale in applicazioni di rilevamento biochimiche con sensibilità e specificità 1-5 senza precedenti. Le interazioni farmaco-bersaglio generano sollecitazioni superficie, provocando il cantilever piegare, e il segnale possono essere analizzati otticamente quando è illuminato da un laser. La variazione di tensione superficiale misurata con precisione su scala nanometrica permette interruzioni di biomeccanica del modello della parete batterica bersagli per essere rintracciati in tempo reale. Nonostante che offre notevoli vantaggi, più array di sensori a sbalzo sono mai state applicate nel quantificare le interazioni di legame farmaco-bersaglio. Qui riportiamo l&#39;uso di silicio più array sbalzo rivestiti con alkanethiol monostrati auto-assemblati mimano matrice parete batterica a stu quantitativamentedy interazioni di legame antibiotiche. Per capire l&#39;impatto di vancomicina sulla meccanica delle strutture della parete cellulare batterica 1,6,7. Abbiamo sviluppato un nuovo modello 1 che propone che a sbalzo di curvatura può essere descritto da due fattori indipendenti, i), vale a dire un fattore chimico, che è dato da un Langmuir classica adsorbimento, da cui si calcola l&#39;equilibrio termodinamico costante di dissociazione (K d) e ii) un fattore geometrico, essenzialmente una misura di come recettori di peptidi batterici sono distribuiti sulla superficie cantilever. La distribuzione superficiale dei recettori peptidici (p) è utilizzato per studiare la dipendenza della geometria e ligando caricamento. Si dimostra che un valore di soglia di p ~ 10% è fondamentale per applicazioni di rilevamento. Sotto del quale non vi è alcun segnale rilevabile piegatura mentre al di sopra di questo valore, il segnale di curvatura aumenta quasi linearmente, rivelando che lo stress è un prodotto chimico di un locale vincolante factor e un fattore geometrico combinato dalla connettività meccanica delle regioni reagito e fornisce un nuovo paradigma per la progettazione di agenti potenti per combattere le infezioni superbug.

Il cambiamento lo stress misurato con precisione su scala nanometrica con sensibilità senza precedenti per un singolo delezione H-bond, viene sfruttato per tracciare le perturbazioni modello batteriche biomeccanica della parete cellulare in tempo reale (figure 2a-d). Il limite di sensibilità di rilevazione della droga per Van è stata studiata in modo seriale diluendo la sua concentrazione in passi da 1.000 micron a ≤ 10 nm, rivelando 10 Nm (~ 15 ng / ml), come la concentrazione minima che dà luogo ad una media di ~ -9 ± 2 nm come i segnali differenziali di piegatura (figura 2c). La capacità di rilevare gli antibiotici in ambiente fisiologico è stato ulteriormente approfondito nel siero in un intervallo di concentrazione clinicamente rilevante di 3-27 micron 17. A seguito di iniezione del 7 mM Van nel siero (siero di vitello fetale 90% più il 10% di sodio fosfato pH 7,4) in tutte cantilever in condizioni identiche, il segnale differenzialeDala nel siero era 105 ± 4 nm, mentre per i cantilever rivestiti DLac, nessuna flessione è stata osservata (Figura 3). Le notevoli segnali di flessione osservati per Dala patinata (vancomicina sensibile) cantilever sono causati dalle forti interazioni di legame farmaco-bersaglio. Tuttavia per DLac patinata (resistenti alla vancomicina) a sbalzo, la presenza di repulsione terra-stato della coppia solitaria di ossigeno e la riduzione del legame NH nel vancomicina tasca di legame 10,12 contribuisce all&#39;indebolimento delle interazioni di legame farmaco-bersaglio che si traduce in meno o no cantilever piegatura, specialmente per basse concentrazioni di vancomicina (Figura 3). Tuttavia, per la concentrazione alta vancomicina, osserviamo i segnali di flessione misurabili per DLac. Inoltre, il nostro disegno sperimentale è importante per in situ referenziamento dove tutto cantilevers rivestiti con entrambe dala e DLac sono esposti contemporaneamente allo stesso analita in tempo reale. Per comprendere il ruolo preciso di chimica e geometria, abbiamo progettato un modello 1 che descrive la correlazione tra le interazioni solvente e la meccanica di superficie. Questo produce il stress di superficie: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> per p&gt; pc e zero altrimenti (1) Il primo termine dell&#39;equazione (1) è l&#39;isoterma di adsorbimento di Langmuir, che rappresentano eventi di legame farmaco-bersaglio e il secondo termine è la forma di legge di potenza che descrive le conseguenze meccaniche su grande scala di formazione delle reti stressati. La costante a corrisponde alla massima sollecitazione superficie quando tutti i siti di legame accessibili sono occupati e K d è la superficie di equilibrio di dissociazione consTant sulla mensola. L&#39;analisi come mostrato in Figura 4 è il risultato del fit globale dell&#39;equazione (1) sovrapposto misurati segnali di stress rivelano differenziali; un ~ 29,7 ± 1,0 o 14,1 ± 3,0 mN / m e K d ~ 1,0 ± 0,3 o 800 ± 310 mM per D-Ala o DLac peptidi, dove A corrisponde a una misura dello stress superficie quando tutti i siti di legame accessibili sono occupati. La maggiore sensibilità dei cantilever era sintonizzato variando sistematicamente la densità peptide p monitorando i dati tensione in funzione della p mentre concentrazioni antibiotiche fissate a 10, 100, e 250 mM, rispettivamente (Figura 5). Il processo è stato ripetuto con lo stress in funzione delle concentrazioni Van mentre le densità peptidici fissati a p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: contenuti-width = src &quot;5 pollici&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Rilevazione sbalzo di antibiotici interazioni di legame di superficie. a) Rappresentazione schematica di una matrice di sensori cantilever e la modalità con cui le interazioni farmaco-bersaglio vengono rilevati nanomechanically. b) Chemical interazione legame tra una molecola di farmaco (Van) e l&#39;analogo mucopeptide batterico (D-Ala o D-Lac). c) Il meccanismo con cui un mutati batteri sensibili alla vancomicina (VSE) acquisisce resistenza alla vancomicina da eliminazione di un H-bond singolo nella tasca di legame. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Monitoraggio delle interruzioni del modello batteriche biomeccanica della parete cellulare in tempo reale. a) segnali assoluti di flessione di D-Ala, D-Lac e PEG sbalzo rivestiti in tampone fosfato e vancomicina 250 micron. I segnali di riferimento PEG differenziali sono mostrati in linee nere. B) segnali differenziali di flessione di D-Ala e D-Lac cantilever rivestite in tampone fosfato 250 mM e vancomicina. C) Il differenziale sbalzo deflessione di un segnale dipendente dalla dose in funzione del tempo in presenza di concentrazioni di vancomicina rispettivamente dell&#39;ordine di 10 Nm (linea gialla), 100 nm (linea rossa) e 1.000 Nm (linea rosso scuro). d) I segnali di flessione della leva differenziali per tre D-Ala sensori a sbalzo rivestiti come funzione del tempo, in presenza di 10nM vancomicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figura 3. Monitoraggio delle interruzioni del modello biomeccanica della parete cellulare batterica in tempo reale per un D-Ala e D-Lac cantilever rivestite in presenza di 7 pM vancomicina in siero fetale di vitello. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Figura 4. Indagare le nanomeccanica di interazioni farmaco-bersaglio. Plot che mostra la superficie differenziale di risposta allo stress misurato per D-Ala (cerchi neri) e D-Lac (cerchi rossi) a sbalzo rivestiti in funzione della vancomicinaconcentrazione in soluzione [van]. I dati sono descritti da equazioni (1) (linee continue). 1 <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figura 5. Ottimizzazione della nanomeccanico sensibilità di rilevazione di interazioni ligando-recettore mediante l&#39;esame la dipendenza di carico recettore e geometria attraverso monostrati misti. Misurati differenziali superficiali di stress risposte dei sensori cantilever in funzione di D-Ala copertura della superficie, p in presenza di concentrazioni di vancomicina fissi soluzione a 10 micron (linea nera), 100 micron (linea rossa), e 250 mM (linea verde).

Acquisita la resistenza agli antibiotici è un problema sanitario pubblico ed è attualmente classificato dall&#39;OMS come una delle più grandi minacce alla vita umana. Qui si descrive l&#39;uso della tecnologia a sbalzo per quantificare la resistenza antibatterica, fondamentale per la scoperta di nuovi farmaci e potenti contro multidrug batteri resistenti.

Nanomeccanica di interazioni farmaco-bersaglio e di rilevamento di resistenza antibatterica

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni nelle proprietà meccaniche dei modelli di cellule batteriche sottostanti causate dalle interazioni di legame con il farmaco bersaglio, e quantificare la resistenza antibatterica. Questo viene ottenuto depositando innanzitutto uno strato di oro di 20 nanometri su un lato dell'array di sensori a mensola pre-pulito. Il secondo passaggio consiste nell'autodisporre i bersagli superficiali appropriati, che imitano i fenotipi batterici sensibili e resistenti ai farmaci, su sei dei sensori a mensola, mentre gli altri due sensori a mensola vengono rivestiti con bersagli modello batterici irrilevanti da utilizzare come controlli di misurazione.Successivamente, gli array di sensori a mensola vengono caricati in una camera di flusso liquido. L'ultimo passaggio consiste nel preparare soluzioni di farmaco in intervalli di concentrazione clinicamente rilevanti e nell'iniettare in sequenza ciascuna concentrazione di farmaco sugli array di sensori a mensola. Infine, un fascio laser focalizzato sulle estremità libere dell'array di sensori a mensola viene utilizzato per rilevare le deflessioni della mensola causate dalle variazioni di tensione superficiale derivanti dalle interazioni di legame tra il farmaco e il suo bersaglio.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la risonanza plasmonica di superficie e il microbilancio a cristallo di quarzo è che rileva direttamente la deformazione superficiale generata dalle interazioni di legame tra farmaco e bersaglio, misurando forze ano-meccaniche specifiche indotte dal legame di ciascun farmaco ai bersagli sulla superficie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della farmacologia, come la velocità, l'efficienza e la precisione della somministrazione del farmaco. Generalmente, le persone nuove rispetto a questo argomento incontreranno difficoltà a causa dell'allineamento laborioso del campione.Tuttavia, abbiamo recentemente introdotto un nuovo meccanismo di lettura, che non richiede un allineamento iniziale del campione, e in futuro l'utilizzo di questo metodo sarà molto più semplice e user-friendly. Per iniziare, utilizzare una pinzetta in teflon per immergere una chip a mensolaletta in una soluzione di parama appena preparata per 20 minuti. Le mensolalette utilizzate in questo esperimento sono lunghe 500 micrometri, larghe 100 micrometri e spesse 0,9 micrometri.Dopo 20 minuti, rimuovere la mensola e risciacquarla accuratamente con acqua deionizzata. Ispezionare il chip pulito mediante microscopio ottico per individuare eventuali impurità. Riposizionare i chip con residui di polvere o sporco in una soluzione di piranha fresca per ulteriori 20 minuti.Dopo un'accurata pulizia in acqua deionizzata, risciacquare la chip in etanolo puro ed asciugarla su una piastra riscaldante a 75 gradi Celsius per circa 30 secondi per rimuovere eventuali tracce di acqua. Successivamente, ispezionarla nuovamente mediante microscopio ottico per verificarne la pulizia. Trasferire la chip con la mensola pulita in una camera di evaporazione caricata con sorgenti di titanio e oro.Pompare fino a raggiungere una pressione di vuoto di uno per 10 alla meno sette millibar. Una volta raggiunto il vuoto richiesto, rivestire un lato di ciascun array di cantilever con uno strato di titanio spesso due nanometri. Successivamente, configurare il sistema per depositare uno strato d'oro spesso 20 nanometri sul titanio, che funge da strato adesivo.Verificare lo spessore di ogni strato mediante un monitor a cristallo di quarzo posizionato direttamente sopra la sorgente del target. Una volta raggiunto lo spessore corretto, lasciare le lamelle del cantilever rivestite d'oro nella camera per uno o due ore affinché si raffreddino sotto vuoto prima di aprire la camera. Successivamente, trasferire la lamella del sensore a cantilever in un contenitore sotto vuoto riempito con Argonne per prevenire qualsiasi forma di contaminazione.Le chip della mensola possono essere conservate qui indefinitamente. Tuttavia, se non è disponibile un contenitore per la conservazione, la chip deve essere utilizzata immediatamente subito prima dell'esperimento. Disporre i tubi capillari microscopici nei canali su una piastra di funzionalizzazione in base alla distanza tra le mensole di 250 micrometri.Quindi allinearli utilizzando una lamella di vetro e fissarli in posizione con una molletta per impedire che si muovano durante l'esperimento. Successivamente, preparare soluzioni due millimolari di recettori di superficie folati ottenuti da bersagli della parete cellulare batterica sensibili e resistenti ai farmaci, usando etanolo puro. Successivamente, inserire un cantilever separato in ciascuno dei tubi capillari microscopici.Assicurarsi che le soluzioni delle molecole di cattura superficiale siano confinate a ciascun sensore a mensola per evitare contaminazioni. Assegnare quindi casualmente una miscela di queste molecole di cattura superficiale ai tubi capillari microscopici, e successivamente iniettare otto microlitri delle soluzioni bersaglio superficiali nei tubi assegnati. Lasciare incubare le mensole nelle soluzioni per 20 minuti.In questo periodo, i cantilever appena preparati rivestiti d'oro diventeranno sensori chimicamente attivi grazie all'autoassemblaggio di peptidi muco-batterici in un monolayer sulle loro superfici rivestite d'oro. Iniziare sciogliendo sali di fosfato mono e dibasico di sodio 0,1 molare in acqua ultrapura e mescolare fino a ottenere un valore di pH di 7,4, quindi filtrare la soluzione attraverso filtri da 0,2 micron. Successivamente, aggiungere lo 0,002% di polisorbato 80 alla soluzione tampone.Questo ridurrà al minimo gli effetti di aggregazione causati da interazioni non specifiche delle molecole del farmaco con il materiale vetroso. Successivamente, diluire la vancomicina e l'orin con soluzioni appena tamporate alla concentrazione desiderata di 100 picomolari a 250 micromolari, il che permetterà il calcolo di KD. Vortexare e sonicare i campioni per assicurare una completa dissoluzione del farmaco nel tampone e nel siero, al fine di determinare se l'azione del farmaco è modificata dalle proteine sieriche. Ripetere questa procedura con le stesse concentrazioni del farmaco, aggiungendole però al siero intero.Vortexare anche i campioni di siero per un totale di 20 minuti durante il mescolamento per garantire la completa solubilità dei farmaci. Infine, spurgare le soluzioni con Argonne per iniziare il rilevamento dello stress superficiale attraverso le mensoline. Caricare innanzitutto gli otto sensori a mensola funzionalizzati sul chip in una camera a flusso liquido.Successivamente, allineare il punto laser sull'estremità libera di ciascun sensore. Verificare l'allineamento riscaldando la camera liquida di un grado Celsius. Tutti e otto gli array di sensori a mensola rivestiti in oro subiranno una flessione verso il basso di tipo compressivo a causa dell'effetto bimetallico provocato dalle differenze nei tassi di espansione tra silicio e oro.Dopo aver riscaldato per circa 10 minuti, calcolare la variazione di flessione nei segnali massimi di flessione tra i singoli sensori a mensola. Se la deviazione standard relativa dei segnali è minore o uguale al 5%, accettare l'allineamento come desiderabile. In caso contrario, ripetere il processo seguendo l'allineamento.Lasciare raffreddare le leve fino alla temperatura ambiente per 10 minuti per garantire l'equilibrazione. Successivamente, misurare le frequenze di risonanza di tutte e otto le leve e calcolare le loro costanti elastiche. Se la variazione della costante elastica tra ciascun sensore a leva è minore o uguale all'1%, accettare la calibrazione.In caso contrario, sostituire il sistema fluidico di collegamento del sensore del chip della mensola, come la pompa a siringa mostrata qui, collegandolo al chip accettore tramite una valvola a sei vie. Impostare la portata del sistema a un valore costante compreso tra 30 e 180 microlitri al minuto e configurare l'intero sistema all'interno di un armadio a temperatura controllata a 25 gradi Celsius. Successivamente, iniziare a iniettare esclusivamente tampone o siero senza farmaco per acquisire una misurazione di riferimento di controllo della durata compresa tra cinque e 30 minuti.Avviare il software della vista automatizzata del laboratorio per acquisire simultaneamente i dati di deflessione da ciascuna delle mensoline. Monitorare i segnali di curvatura assoluta di tutte e otto le mensoline mediante un metodo ottico a fascio multiplexato nel tempo in serie, utilizzando un singolo rivelatore sensibile alla posizione. Una volta acquisita la linea di base, iniettare una soluzione del farmaco per 30-60 minuti seguendo il campione di prova.Viene iniettato un lavaggio con HCl 10 millimolare per un periodo compreso tra 10 minuti e un'ora al fine di dissociare eventuali complessi di farmaco legati. Utilizzando questo sistema, è possibile ottenere una precisione su scala nanometrica e una sensibilità senza precedenti, arrivando a rilevare la perdita di un singolo legame a idrogeno. La modifica all'estremità di una catena peptidica da D-alanina a D-lattato provoca una significativa riduzione del legame con la vancomicina, rendendo resistenti a questa terapia i batteri che presentano la sequenza DLAC. Quando diverse concentrazioni del farmaco sono state testate sulla catena peptidica terminante con D-alanina, si è osservato un effetto dose-dipendente della vancomicina, con una concentrazione minima rilevabile di circa 10 nanomolar.È stata ulteriormente studiata la capacità di questo sistema di rilevare antibiotici in un ambiente fisiologico, nel siero a una concentrazione clinicamente rilevante di sette micromolar. Mentre le cantilever rivestite con D-alanina hanno comunque mostrato una considerevole flessione in queste condizioni, quelle rivestite con DLAC non l'hanno mostrata. Utilizzando punti dati provenienti da diverse concentrazioni del farmaco, è possibile creare modelli che descrivono gli eventi di legame tra il farmaco e il bersaglio.Le linee di adattamento mostrate qui combinano l'assorbimento del langur, l'isoterma e un termine per descrivere le conseguenze meccaniche su larga scala della formazione di una rete sotto stress. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti per confermare l'efficienza e l'accuratezza della somministrazione del farmaco, nonché qualsiasi segno di resistenza batterica se eseguita correttamente.

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