Name: Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Impara a visualizzare il trasporto anterogrado e la diffusione del virus herpes in colture neuronali primarie mediante imaging cellulare dal vivo con proteine fluorescenti. Questo metodo consente di studiare la dinamica virale in tempo reale.

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LWE e RK sono supportati dal National Institutes of Health sovvenzioni R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03. MPT è stato sostenuto da un Cancer Society Postdoctoral Fellowship americana Research (PF-10-057-01-MPC). La consulenza e la conoscenza del dottor Matteo Lyman e Dr. Oren Kobiler hanno contribuito a progettare la configurazione microscopio e metodi di imaging cellulare dal vivo. Abbiamo anche estendere grazie a Neal Barlow e Brian T. Kain di Nikon Instruments per la loro assistenza tecnica per l&#39;acquisto, l&#39;installazione e la performance del microscopio.

Sezione 1 - Condizioni di controllo ambientale per la microscopia a fluorescenza live-cell <ol><li> 30 min prima di ogni esperimento di imaging collegare e iniziare il riscaldamento del microscopio stadio top incubatore. <ol><li> Accendere il microscopio, fonti di luce trasmessa e epifluorescente e controlli hardware automatizzati. Aprire il software di controllo del microscopio, NIS Elements, per la connessione al microscopio ed iniziare il raffreddamento della macchina EM-CCD. </li><li> Fissare Lens più caldo per obiettivo appropriato (60X o 100X immersione in olio). Nota: Selezionare lente dell&#39;obiettivo in base a tipo di esperimento. Il contrasto di interferenza differenziale 100X (DIC) è meglio per il monitoraggio di anterogradi assemblee virioni trasportano mentre l&#39;obiettivo di fase 60X è adatto a visualizzare diffusione anterograda. Un ingrandimento inferiore, obiettivi ad immersione non petrolifere non richiedono una lente più caldo in quanto non entrano in contatto diretto con il campione. </li><li> Attaccare stadio superiore incubatore sul palco motorizzato di mi<html> croscope. Assicurare l&#39;inserto appropriato che conterrà il campione è a posto. Collegare la linea di aria umidificata dal controllo incubatrice alla porta di ingresso sul palcoscenico superiore dell&#39;incubatrice. </li><li> Accendere incubatore e lente controlli più caldi e regolare le impostazioni di temperatura alle condizioni precedentemente verificati specifici per l&#39;obiettivo e il campione viene ripreso (vedi discussione). </li><li> Aprire la valvola di controllo del 5% di CO 2 / serbatoio atmosferico del 95% per fornire CO 2 dell&#39;aria integrato per mettere in scena top incubatore. La portata deve essere compresa tra 60 e 80 ml di gas al minuto. Tassi più veloci si tradurrà in una vasta disidratazione del campione, nonostante la camera di umidificazione. </li></ol></li><li> Aggiungere olio lente per lente dell&#39;obiettivo e collocare immediatamente la cultura che verrà ripreso nella fase top incubatore. </li><li> Raggiungere l&#39;equilibrio di temperatura in coltura per un minimo di 10 min. Un&#39;ora è preferito, in particolare per l&#39;imaging notte descritto nella Sezione 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Sezione 2 - Imaging in tempo reale di anterograda Virion Transport Protocol Eventi <ol><li> Da sei a otto ore prima di imaging, infettare un piatto di 35 mm coprioggetto-fondo maturo, dissociate neuroni SCG con 1 x 10 6 unità formanti placca del virus di interesse (Vedi Tabella 1 per esempio i virus) con il metodo descritto in Taylor et al. 2012A 11. Se testare più di un virus, vaccinazioni off-set da 30-60 min per consentire l&#39;imaging di campioni sequenziali a volte simile post infezione. </li><li> Inserire piatto in fase top incubatore per un minimo di 10 minuti prima di eseguire qualsiasi esperimento. Mentre la temperatura si equilibra, il piano focale si sta spostando e avrà un impatto negativo eventuali esperimenti di imaging. </li><li> Utilizzando la luce trasmessa e l&#39;oculare del microscopio, trovare un corpo cellulare neuronale che ha una estensione assonale chiaramente isolato. In alternativa, utilizzare l&#39;appropriata illuminazione a fluorescenza per trovare una cellula che esprime DATECimporti della tabella di proteine ​​fluorescenti. È importante limitare l&#39;esposizione del campione ad illuminazione fluorescente, in questo passaggio e passaggi successivi, a causa della luce danno cellulare indotto e candeggio delle proteine ​​fluorescenti. </li><li> Attenuare illuminazione a fluorescenza per ridurre l&#39;intensità della luce di eccitazione a cui le cellule sono esposte. Impegnarsi luce attenuando densità neutra (ND) i filtri nel percorso luce di illuminazione a fluorescenza. Per i filmati che durano più di 1 min, un minimo di ND4 devono essere utilizzati per prevenire fotometabolismo di proteine ​​fluorescenti e ampia foto-danneggiamento degli assoni. Strutture altamente fluorescenti in genere può essere visualizzato con un ND8 filtro in posizione. </li><li> Utilizzando il software microscopio (Figura 2 e Supplemental Movie 1A), accendere la luce-percorso alla telecamera EM-CCD. </li><li> Determinare i tempi di imaging e le condizioni ottimali per ogni canale fluorescente. <ol><li> Avviare una finestra immagine dal vivo utilizzando il pulsante &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Determinare le impostazioni di esposizione della fotocamera ottimali per ogni proteina fluorescente. Non superare i 300 ms per canale come aberrazioni dinamiche di strutture virioni rapido movimento si verificherà. Utilizzare il guadagno EM della fotocamera per un ambiente di 300 (raccomandati dal produttore guadagno massimo), per ridurre al minimo il tempo di esposizione e migliorare il rilevamento dei segnali dim. Tempi di esposizione corretta dovrebbe produrre un&#39;immagine con bassa intensità di fondo e segnali ad alta specifiche. </li></ol></li><li> Dopo aver impostato esposizioni e trovare una regione ben definita di assone, il software deve essere configurato per eseguire l&#39;acquisizione di immagini automatizzato. Fermare la finestra di imaging dal vivo per evitare campione sbiancamento. <ol><li> Nel software NIS Elementi, selezionare il 6D - Definire / Esegui applicazione Experiment dal &quot;Applicazioni&quot; menu a discesa. </li><li> Nella finestra di acquisizione del ND, fare clic sulla scheda Ora che determinerà la frequenza di acquisizione delle immagini. Impostare l&#39;intervallo su &quot;No Delay&quot; e la durata di 5 min. Thsoftware e Viene quindi acquisire fotogrammi dell&#39;immagine alla massima frequenza possibile per la durata di 5 min. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Lambda&quot;, che permette di selezionare le configurazioni hardware pre-impostati utilizzati per l&#39;acquisizione di immagine multipla fluorescente. Fare clic sulla prima casella e nel successivo menu a discesa per selezionare una configurazione hardware appropriato. Ripetere l&#39;operazione per tutte le proteine ​​fluorescenti per essere ripreso. </li><li> Assicurarsi che le schede per &quot;XY Posizioni&quot;, &quot;Z-Series&quot; e &quot;Grande immagine&quot; sono de-selezionati. </li><li> Sopra le schede, selezionare la casella &quot;Save to File&quot; per salvare automaticamente le immagini sul disco rigido durante l&#39;acquisizione. Configurare il percorso e il nome file del file di output esperimento. Come esperimenti vengono eseguiti in sequenza, il software verrà aggiunto un numero sequenziale alla fine del nome file designato. </li><li> Una volta che tutte le schede sono state selezionate. Avviare l&#39;esperimento facendo clic sul pulsante &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Ottimizzare la velocità di acquisizione delle immagini attraverso le impostazioni di esposizione e imagdimensione e. Usando una piccola regione dell&#39;area dell&#39;immagine-grado spesso accelerare velocità di acquisizione fotogrammi. Definire la regione di interesse con lo strumento ROI nel NIS-Elements, selezionando un&#39;area compresa tra il 25% e il 50% della superficie totale dell&#39;immagine. In alternativa, i tempi di esposizione più brevi potranno aumentare i tassi di acquisizione del telaio, ma diminuisce la qualità del segnale (vedi discussione). </li></ol></li></ol> Sezione 3 - Pernottamento Time-lapse imaging di anterograda spread Eventi <ol><li> Quattro ore prima di imaging, infettano una cultura neuronale compartimenti costruiti in 35 mm μ-Dish. Seminare corpi cellulari neuronali con 1 x 10 6 unità formanti placca del virus di interesse (Vedi Tabella 1 per esempio i virus) con il metodo descritto in Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Posizionare delicatamente piatto cultura nella fase top incubatore. Garantire la posizione dell&#39;obiettivo è impostato sul lato del piatto. Portare lentamente l&#39;obiettivo a fuoco, assicuzione l&#39;obiettivo non spinge fino nel campione. Quando il campo fuoco è stato identificato, spostare lentamente l&#39;obiettivo verso il centro del piatto, vicino alla barriera interna demarking il lato interno del vano assone. Durante il movimento, assicurano la profondità fuoco viene mantenuta ed evitare spingendo nel campione. Flessione della superficie plastica dall&#39;obiettivo danneggiare gli assoni e la plastica. </li><li> Aggiungere circa 2 ml di calda (~ 37 ° C), tampone fosfato salino al piatto cultura esterno dell&#39;anello Teflon. Questo circonda la coltura neuronale con un anello di PBS per minimizzare campione disidratazione e fornire isolamento termico. </li><li> Attendere che la temperatura si stabilizzi per almeno 1 ora prima di iniziare l&#39;acquisizione di immagini automatica (3.8). Passi 3.5 tramite 3.7 possono essere configurati in questo periodo. </li><li> Limitare l&#39;intensità della luce al livello più basso possibile per coinvolgere tutti i filtri a densità neutra. Ciò consentirà l&#39;acquisizione di immagini frequente over lunghi periodi di tempo senza eccessivi foto-danneggiamento. Ridurre l&#39;illuminazione si tradurrà in basso segnale, richiedendo esposizioni più lunghe (vedi discussione). </li><li> Utilizzare le impostazioni di esposizione storici o prima di set-up sperimentale generare un piatto parallelo di cellule epiteliali infettate esprimono le proteine ​​fluorescenti bersaglio per stabilire le impostazioni di esposizione, come descritto nella sezione 2.5. </li><li> Dopo aver impostato fidi ai canali necessari, è tempo di configurare il software per l&#39;acquisizione delle immagini automatizzata. Fermare la finestra di imaging dal vivo per limitare campione sbiancamento. <ol><li> Nel software di elementi (Figura 2 e film supplementare 2), selezionare il 6D - Definire / Esegui applicazione Experiment dal &quot;Applicazioni&quot; menu a tendina per visualizzare la finestra di acquisizione del ND. </li><li> Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda Ora. Impostare l&#39;intervallo di &quot;5 min&quot;. Impostare la durata di 20 ore. Il campo loop verrà calcolata automaticamente per il numero di ripetizioni del program si esibirà. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Lambda&quot;. Fare clic sulla prima casella e nel successivo menu a discesa selezionare la configurazione lambda appropriato per contrasto di fase. Ripetere l&#39;operazione per le posizioni successive, selezionando le impostazioni appropriate per ciascuna proteina fluorescente per essere ripreso. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Grande immagine&quot;, che determina i parametri di immagini multiple per essere combinati in un unico grande campo di vista. Una zona di buone dimensioni composto da 5 x 2 immagini utilizzando un 7% di sovrapposizione cuciture. Ciò consentirà il massimo numero di celle per posizione per essere ripreso senza influire sulla frequenza di acquisizione delle immagini. Inoltre, deselezionare la casella di controllo per &quot;Shutter Chiudi attivo durante il movimento Stage&quot;. Questa opzione aumenta la velocità di acquisizione da parte di non chiudere persiane tra le immagini. </li><li> Selezionare la scheda &quot;XY posizioni&quot;, per identificare più posizioni che verranno sequenzialmente imaged in parallelo durante il corso del film durante la notte. Selezionare le posizioni che definiscono il centro Point per ogni grande area dell&#39;immagine. Selezionare 6-8 posizioni immagine del campione. Una buona zona immagine avrà piccoli gruppi di cellule in stretta apposizione di assoni chiaramente definiti. Cellule non dovrebbero essere impilati uno sopra l&#39;altro e assone bundling dovrebbero essere minimizzati. Il punto di messa a fuoco è il nucleo della cellula. Posizionare l&#39;obiettivo tale che un involucro nucleare chiaramente definito è visto per la maggior parte delle cellule. </li><li> Assicurarsi che la scheda &quot;Z-Series&quot; è deselezionata. </li><li> Configurare la funzione di salvataggio automatico, come descritto sopra nella sezione 2.6.5. </li><li> Testare l&#39;esposizione e le impostazioni di posizione con &quot;1 ciclo di tempo&quot;. Valutare le immagini risultanti per l&#39;illuminazione a luce trasmessa, messa a fuoco e l&#39;inquadratura. Se il focus si è spostato, reimpostare la messa a fuoco per ogni posizione nella scheda XY. Attendere 10 minuti e ripetere questo passaggio fino a fuoco è stabile. </li><li> Dopo che tutte le impostazioni sono stati verificati e testati, avviare l&#39;esperimento automatica facendo clic sul pulsante &quot;Esegui ora&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Sezione 4 - Elaborazione di immagini e di esportazione Data Export <ol><li> Set di dati ottenuti durante live-cell imaging di eventi di trasporto o di diffusione devono essere esportati dal software NIS Elements in tipi di file comunemente utilizzati per un successivo utilizzo in presentazioni e pubblicazioni (Supplemental Movie 3). Per esportare i filmati aprire l&#39;appropriato cruda ND2 file. Nel NIS Elements e selezionare la visualizzazione &quot;split-componente&quot; per visualizzare i canali desiderati fluorescenti. La riproduzione del file a una velocità adeguata; 5 fotogrammi al secondo è un buon punto di partenza per la visualizzazione di fast-trasporti. </li><li> Includere un timestamp per rappresentare un orologio in tempo reale durante la riproduzione del filmato. Fai clic destro sull&#39;immagine e selezionate, Add-informazione ND. Un contatore digitale apparirà nell&#39;angolo in alto a sinistra. <ol><li> Modificare il time-stamp per visualizzare le informazioni. Fare clic destro sul bancone e selezionare Modifica informazioni-ND. Nella successiva finestra di pop-up, modificare il testo in modo da riflettere l&#39;immaginariong parametri che sono importanti. Modifica del carattere, colore e dimensione per chiarezza. </li></ol></li><li> Vai al menu &quot;Modifica&quot; e trovare &quot;Crea vista istantanea&quot; oppure premere il tasto &quot;x&quot;. Questo comando apre la finestra &quot;vista istantanea&quot;. Selezionare &quot;Applica a tutti i fotogrammi&quot; per generare un 8-bit, RGB, file di esportazione-ready contenente i canali fluorescenti da tutto il film. </li><li> Salva come file. AVI per la compatibilità cross-platform. Impostare la velocità di riproduzione a 200 msec per fotogramma. I file avi. Generati da NIS elementi possono poi essere ulteriormente compressi con altri software di conversione nel tipo di file desiderato. </li></ol>

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;obiettivo di imaging cellulare dal vivo sta osservando processi biologici che si verificano senza significative alterazioni con l&#39;atto di osservazione. Questo obiettivo è raggiunto attraverso l&#39;ottimizzazione tre variabili: il controllo ambientale, la velocità di formazione immagine, e l&#39;illuminazione a fluorescenza. Queste variabili interdipendenti devono essere bilanciati per ottenere condizioni di imaging vitali. I protocolli presentati utilizzano specifiche condizioni per produrre i risultati rappr...

L&#39;infezione del sistema nervoso periferico (SNP) di alphaherpes virus come il virus herpes simplex (HSV) -1, -2, e virus pseudorabies (PRV) prevede diversi passaggi intricati e altamente regolamentato in tutto il ciclo vitale del virus. Trasporto all&#39;interno neuroni del sistema nervoso periferico è fondamentale durante gli eventi di entrambi infezione virale primaria e la successiva diffusione inter-host. I meccanismi molecolari che modulano due componenti del ciclo di vita virale; trasporto diretto delle assemblee virali di distanza dal corpo cellulare all&#39;interno di assoni (trasporto anterogrado) e la successiva trasmissione dei virioni di cellule sensibili (diffusione anterograda) sono importanti per la comprensione herpesvirus patogenesi. Il trasporto e l&#39;uscita di particelle virali in neuroni dipende montaggio di un virione maturo infettiva 1,2. Saggi precedentemente fissato, tra l&#39;immunofluorescenza (IF) e la microscopia elettronica (EM), sono stati usati per studiare lo stato di assemblaggio delle particelle e la protinterazioni ein connessi ai trasporti virione e la diffusione 3-6. Tuttavia la natura dinamica del trasporto di virioni e manufatti sperimentali introdotte dalla fissazione chimica confusa l&#39;interpretazione delle immagini fisse 7,8. Recentemente, un certo numero di proteine ​​di fusione virale-fluorescenti sono state descritte per HSV e PRV cui impatti trascurabili sulla funzionalità delle proteine. Proteina fluorescente verde (GFP) e proteine ​​fluorescenti rossi (mCherry o MRFP) fluorofori sono spesso in coppia per consentire l&#39;imaging di due dei tre componenti strutturali di un virione maturo: capside, tegumento, e glicoproteina 9-11. Imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado utilizzando virus dual-etichettati visualizza lo stato di assemblaggio delle particelle virali durante il trasporto. Fluoroforo simili esprimendo ceppi virali vengono utilizzati per visualizzare il numero e la diversità dei genomi virali a seguito diffusione 12,13. Le proprietà delle proteine ​​fluorescenti (recensione in 14,15) di grande impattola capacità di visualizzare assemblee virali o cellulari. Le proprietà intrinseche della proteina fluorescente, tra cui auto-interazione e di stabilità, devono essere considerati durante la progettazione e la sperimentazione di nuovi fusioni proteiche per la conservazione della funzionalità di tipo selvaggio. In concomitanza con la fusione di proteine ​​fluorescenti, due ben caratterizzati in sistemi di colture cellulari in vitro sono impiegate per l&#39;imaging cellulare dal vivo di infezione da herpes virus: dissociata 16 e 17 compartimenti stagni (Figura 1A) ratto superiori gangli (SCG) neuroni cervicali. In entrambi i sistemi, embrione del SCG sono sezionati, dissociato da corpi cellulari singoli, e cromato per la coltura in vitro 18. Neuroni SCG sono parte del sistema nervoso autonomo e possono essere facilmente coltivate e differenziati per il fattore di crescita neuronale (NGF) in un maturo polarizzato stato ex vivo. Neuroni SCG dissociate formano una rete estesa di assoni che permette fo la visualizzazione di particelle virali in quanto sottoposti trasporto anterogrado 6. Culture SCG compartimenti stagni forniscono isolamento fluidico del corpo cellulare dei neuroni (vano S) e termini assoni distali (vano N) 19. Un certo numero di protocolli dettagliati per la costruzione e l&#39;uso di neuroni compartimenti utilizzando originale 20 o modificati Campenot camere di 17 sono stati pubblicati in precedenza. Isolamento fluidico permette di infezione selettiva dei corpi cellulari neuronali e l&#39;individuazione di virioni progenie dopo il trasporto a isolate Termini assoni. Placcatura cellule epiteliali nei termini prima dell&#39;infezione fornisce cellule riceventi per la diffusione dell&#39;infezione virale. Ci sono molti elementi essenziali importanti per tutti gli esperimenti di imaging cellulare dal vivo, ma la più rilevante per i nostri protocolli sono: acquisizione automatica immagine, illuminazione fluorescente, velocità di formazione immagine e di controllo ambientale. Per tutti gli esperimenti di imaging, utilizziamorovesciata, automatizzato, microscopio a epifluorescenza illuminazione (Figura 1B). Il microscopio è costruito attorno al Nikon Eclipse Ti base e si avvale di un certo numero di sistemi motorizzati controllati da computer per riconfigurare rapidamente il microscopio durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine automatizzato. Per l&#39;illuminazione a fluorescenza, usiamo un ampio spettro di mercurio lampada ad arco che può essere attenuato con filtri a densità neutra lungo il sentiero dell&#39;illuminazione. Filtri di eccitazione limitano lo spettro di illuminazione fluorescente e quando accoppiato con multi-pass specchi dicroici e filtri di emissione di fluorescenza visualizzare i composti fluorescenti specifici. I filtri di eccitazione e di emissione sono montati, veloce commutazione ruote portafiltri indipendenti per consentire una rapida acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti differenti. La velocità di acquisizione dell&#39;immagine è ulteriormente rafforzata con una telecamera EM-CCD sensibile e veloce, utile per il rilevamento di segnali di bassa intensità e breve immagine tempi di lettura. Controllo ambientale sulla microscope è raggiunto con un alto stadio riscaldato incubatore e un riscaldatore lente obiettivo di mantenere i campioni a temperature elevate, mentre un umidificata e CO 2 atmosfera arricchita viene passato nell&#39;incubatore. Il microscopio è tenuto in una stanza buia con temperatura ambiente mantenuto vicino ai 25 ° C e luce esterna minimizzato con tende oscuranti su tutte le finestre. I seguenti protocolli descrivono l&#39;uso di questo sistema per il trasporto anterogrado e dosaggi diffusione. Un certo numero di alternative esistono per il controllo per le variabili di imaging cellulare dal vivo. Il controllo delle impostazioni di microscopia può essere eseguita manualmente o tramite sistemi automatizzati dipendenti dal software proprietario. Illuminazione a fluorescenza può essere ottenuto con sorgenti laser alogeno, LED o. La velocità di formazione immagine viene modificata dalla velocità di commutazione filtro e il tempo di visualizzare il segnale con il sistema di rilevamento associato. Controllo ambientale può essere realizzato con hardware specializzato sul mifase croscope, recinto di tutto o parte del microscopio in una scatola riscaldata e umidificata, o elevando la temperatura della stanza in cui verrà eseguita microscopia. Ciascuna di queste alternative presenta vantaggi e svantaggi relativi a costi e prestazioni. Nel protocollo successivo, abbiamo dettaglio l&#39;uso di cellule vive per studiare rapido trasporto anterogrado e la diffusione di anterograda alphaherpes virus attraverso l&#39;uso di ceppi virali ricombinanti. In tempo reale l&#39;imaging cellulare dal vivo visualizza capside, tegumento, e / o della glicoproteina co-localizzazione su strutture dinamiche in fase di trasporto all&#39;interno assoni 11. Pernottamento timelapse di imaging di colture neuronali compartimenti visualizza assonale uscita virione e l&#39;infezione di cellule suscettibili 12. I protocolli presentati qui sono stati ottimizzati per l&#39;uso con il nostro sistema di imaging particolare, ma sono presentati in termini generali relativi ai quattro elementi di imaging cellulare dal vivo. Nella discussione abbiamovolontà ulteriore dettaglio alcuni ottimizzazione che è necessario per la sperimentazione di successo.

<table><tbody><tr><td>piatto di coltura con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek Corporation; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, Verona, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Corpo del microscopio </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio motorizzato X-Y stage</td><td>Prior Scientific; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>Ruote portafiltri motorizzate</td> Ruota portafiltri <td></td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 a 10 posizioni</td></tr><tr><td>Sorgente di illuminazione fluorescente </td><td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Canada,</td> Set di filtri a fluorescenza multibanda <td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - Telecamera ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide stage top incubatore ambientale</td><td>Live Cell Instruments; Seoul, Corea del Sud</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore per lenti dell'obiettivo</td><td>Bioptecs; Butler, PA</td><td>150803 Controller 150819-12-08 Software di analisi del riscaldatore</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td><td>Elementi</td><td></td> NIS</tr></tbody></table>

imaging cellulare dal vivo di alphaherpes virus trasporti anterograda e diffusione

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Progressi nelle tecniche di microscopia di fluorescenza di cellule vive, così come la costruzione di ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti hanno permesso visualizzazione in tempo reale di trasporto e diffusione del virus alphaherpes infezione di neuroni. L&#39;utilità di nuove proteine ​​di fusione fluorescenti a membrana virale, in involucri, e capsidi, in collaborazione con l&#39;imaging cellulare dal vivo, identificato assemblee di particelle virali in fase di trasporto all&#39;interno di assoni. Utensili simili sono stati impiegati con successo per analisi di cellula-cellula diffusione di particelle virali per quantificare il numero e la diversità di virioni trasmessi tra le cellule. È importante sottolineare che le tecniche di imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado e la diffusione producono una ricchezza di informazioni tra le velocità delle particelle di trasporto, distribuzioni di particelle, e le analisi temporali della localizzazione delle proteine. Accanto a classici tecniche genetiche virali, queste metodologie hanno fornito spunti criticiin importanti questioni meccanicistici. In questo articolo descriviamo in dettaglio i metodi di imaging che sono stati sviluppati per rispondere alle domande fondamentali della alphaherpes trasporto e diffusione del virus.

Anterograda Trasporti L&#39;applicazione di questo protocollo per le infezioni delle dissociate culture SCG con PRV 348, un ceppo ricombinante PRV esprimono GFP-US9 e proteine ​​di fusione della membrana GM-mCherry, ha facilitato la visualizzazione del trasporto anterogrado di virioni (Figura 3 e Movie supplementare 4). L&#39;incorporazione di queste proteine ​​di fusione in particelle virali risultati nella loro rilevazione sul trasporto puncta, e le condizion...

L&#39;imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l&#39;analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l&#39;infezione di neuroni primari.

Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare gli eventi relativi al trasporto e alla diffusione del virus dell'herpes mediante fusioni con proteine fluorescenti in colture primarie di neuroni. Questo obiettivo viene raggiunto innanzitutto stabilendo l'incubazione del campione a temperature fisiologicamente rilevanti su un microscopio in grado di commutare rapidamente l'illuminazione fluorescente. Nel secondo passaggio, i parametri dell'acquisizione di immagini in fluorescenza vengono impostati per limitare eventuali danni cellulari da fototossicità, pur ottenendo dati adeguati.Successivamente, viene eseguita l'acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti o l'acquisizione multi-posizione. Nell'ultimo passaggio vengono acquisite immagini composte da più campi. I dati vengono analizzati e rielaborati per la presentazione e la pubblicazione.In definitiva, questo metodo di imaging su cellule vive viene utilizzato per tracciare il movimento di particelle virali fluorescenti all'interno dei neuroni e per seguire l'infezione mentre si diffonde tra le cellule. Questo approccio può fornire informazioni sul trasporto e sulla diffusione del virus nell'ambiente neuronale. Può inoltre essere applicato ad altri eventi dinamici della biologia cellulare e della microbiologia, come l'internalizzazione endocitica di particelle o la migrazione cellulare.Prima di qualsiasi esperimento di imaging, collegare e avviare il riscaldamento dell'incubatore per il piatto del microscopio. Dopo 30 minuti, accendere il microscopio, le sorgenti di luce trasmessa ed epifluorescente e i comandi hardware automatici. Quindi aprire NIS Elements, il software di controllo del microscopio, per stabilire la connessione con lo strumento.Qui viene mostrata una schermata di un'interfaccia utente standard di NIS Elements. I pulsanti di riproduzione e arresto controllano la finestra dell'immagine in tempo reale, che mostra le configurazioni hardware attuali per l'acquisizione delle immagini e ciò che viene attualmente acquisito. Nella barra superiore sono presenti una serie di configurazioni ottiche che implementano impostazioni hardware predefinite per configurare il microscopio per la rilevazione in trasmissione o in fluorescenza.Il controllo della fotocamera e le impostazioni di esposizione consentono la configurazione del rilevamento della fotocamera per ottimizzare la qualità dell'immagine e la velocità. Tutti gli esperimenti sono coordinati utilizzando i controlli di acquisizione ND. Successivamente, collegare un riscaldatore per obiettivo all'obiettivo a immersione in olio appropriato, quindi collegare l'incubatore da banco alla piastra motorizzata del microscopio.Assicurarsi che l'apposito inserto per il campione sia correttamente posizionato, quindi collegare la linea d'aria umidificata proveniente dal controllo dell'incubatore alla porta di ingresso dell'incubatore da tavolo. Accendere i controlli dell'incubatore e del riscaldatore obiettivo, quindi regolare le impostazioni di temperatura alle condizioni precedentemente verificate specifiche per l'obiettivo e il campione da acquisire. Infine, aprire la valvola di controllo della bombola di anidride carbonica al 5% e aria atmosferica al 95% per fornire all'incubatore da tavolo aria arricchita di anidride carbonica.Per visualizzare in tempo reale gli eventi di trasporto dei virioni di grado enterico, inserire prima una piastra di coltura cellulare contenente neuroni infetti nell'incubatore posto sul tavolo del microscopio per un periodo minimo di 10 minuti prima di eseguire l'esperimento. Quindi, utilizzando la luce trasmessa e l'oculare del microscopio, individuare un corpo cellulare neuronale che presenti un'estensione assonale chiaramente isolata.Trovare aree immaginabili nella coltura neurale è la parte più difficile di questa procedura. Il successo è garantito predisponendo più colture, nel caso di scarsa crescita cellulare o infezione, o di un'alterazione fisica della coltura durante l'acquisizione delle immagini. Utilizzare ora il software del microscopio per commutare il percorso della luce verso la fotocamera EM CCD, quindi fare clic sul pulsante di riproduzione per avviare una finestra di immagine in tempo reale.Dopo aver determinato le impostazioni ottimali di esposizione della fotocamera per ogni serie di proteine fluorescenti, impostare il guadagno di moltiplicazione elettronica della fotocamera a 300. Ridurre al minimo il tempo di esposizione e migliorare il rilevamento di segnali deboli. Arrestare la finestra di acquisizione in tempo reale per prevenire lo sbiancamento del campione.Successivamente, dopo aver impostato i tempi di esposizione e aver individuato una regione ben definita dell'assone negli elementi NIS, configurare il software per l'acquisizione sequenziale delle immagini. Aprire il menu a discesa delle applicazioni e selezionare l'applicazione "six D define run experiment". Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda temporale per determinare la frequenza di acquisizione delle immagini.Impostare l'intervallo su nessun ritardo e la durata su cinque minuti. Ora fare clic sulla scheda Lambda per selezionare le configurazioni hardware preimpostate utilizzate per l'acquisizione di immagini fluorescenti multiple. Fare clic sulla prima casella e quindi nei successivi menu a discesa selezionare una configurazione hardware appropriata.Selezionare la casella "salva su file" e configurare la posizione e il nome del file di output dell'esperimento. Una volta impostati tutti questi parametri, fare clic sul pulsante "esegui ora" per avviare l'esperimento. La velocità di acquisizione delle immagini viene ottimizzata mediante le impostazioni di esposizione e le dimensioni dell'immagine acquisita.Utilizzare lo strumento di area di interesse in NIS Elements per definire l'area di interesse. Selezionare un'area compresa tra il 25 e il 50% della superficie totale dell'immagine per eseguire l'acquisizione temporale notturna di eventi di diffusione di enteri. Innanzitutto, posizionare delicatamente la piastra colturale nell'incubatore posto sul tavolo ottico.Dopo aver verificato che la posizione dell'obiettivo sia impostata sul lato della piastra, portare lentamente a fuoco l'obiettivo, avendo cura che non prema verso l'alto nel campione. Una volta identificato il campo di messa a fuoco, spostare lentamente l'obiettivo al centro della piastra, vicino alla barriera interna, che delimita il lato interno del compartimento assonale, avendo cura di mantenere la messa a fuoco in profondità ed evitare di premere verso l'alto nel campione. Successivamente, circondare i neuroni nella piastra di coltura con circa due millilitri di PBS a 37 gradi Celsius all'esterno dell'anello in teflon per minimizzare qualsiasi disidratazione del campione e fornire isolamento termico.Quindi attivare tutti i filtri a densità neutra per ridurre l'intensità dell'illuminazione al livello più basso possibile, consentendo acquisizioni di immagini frequenti nel tempo prolungato senza eccessivi danni fotoindotti. Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda dell'immagine grande e quindi selezionare un'area composta da cinque per due immagini. Utilizzando un sovrapposizione di giunzione del 7% per acquisire in modo sequenziale più posizioni in parallelo.Durante la ripresa del filmato notturno, selezionare la scheda posizioni XY. Definire quindi le posizioni che indicheranno il punto centrale di ciascuna area dell'immagine grande. Il punto di messa a fuoco deve corrispondere al nucleo della cellula; posizionare l'obiettivo in modo che per la maggior parte delle cellule sia visibile una membrana nucleare ben definita.Quindi fare clic una volta sul ciclo per verificare le impostazioni di esposizione e posizione e valutare le immagini risultanti per luce trasmessa, illuminazione, messa a fuoco e inquadratura. Dopo aver verificato e testato tutte le impostazioni, avviare l'esperimento automatizzato cliccando sul pulsante esegui ora per esportare i filmati ottenuti durante l'acquisizione di immagini di cellule vive. Aprire innanzitutto il corretto file ND2 grezzo in NIS Elements e selezionare la vista a componenti separati.Per visualizzare i canali fluorescenti desiderati, riprodurre il file a una velocità adeguata. Cinque fotogrammi al secondo rappresentano un buon punto di partenza per visualizzare trasporti rapidi, includendo un timestamp che indichi un orologio in tempo reale durante la riproduzione del filmato. Fare clic con il tasto destro sull'immagine e selezionare AGGIUNGI informazioni ND.Un contatore digitale apparirà nell'angolo in alto a sinistra; per modificare il timestamp, fare clic con il tasto destro sul contatore e selezionare "modifica informazioni ND". Nella finestra popup successiva, modificare il testo in modo da indicare i parametri di imaging pertinenti. Modificare il colore e la dimensione del carattere del testo per una maggiore chiarezza.Quindi andare al menu di modifica e selezionare Crea istantanea della vista per aprire la finestra dell'istantanea della vista, al fine di generare un file esportabile a 8 bit RGB contenente i canali fluorescenti provenienti dall'intero filmato; selezionare applica a tutti i fotogrammi. Infine, salvare il file in formato A VI per garantire compatibilità tra piattaforme e impostare la velocità di riproduzione a 200 millisecondi per fotogramma. In questa immagine a contrasto di fase, viene mostrata una coltura rappresentativa, matura e dissociata, di gangli cervicali superiori (SCG) utilizzata per l'analisi del trasporto di virioni intergradati: i neuroni infettati dal virus della pseudorabbia (PRV) 3 48 esprimono le proteine di fusione membranare GFPS nove e GMM cherry.In questa figura viene mostrata un'immagine rappresentativa di cellule vive di assoni del ganglio cervicale superiore (SCG) ottenuta otto ore dopo l'infezione con P RV 3 48. All'interno degli assoni distali, strutture in trasporto anterogrado sono visualizzate in due canali fluorescenti, GFP e mCherry. Una struttura in trasporto anterogrado, indicata dalle frecce bianche, si sposta progressivamente all'interno dell'assone. I due fluorocromi risultano spazialmente sfasati a causa dell'acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti e del rapido movimento delle strutture virali.L'applicazione di questo protocollo alle infezioni di colture SCG dissociate con PRV 3 48 ha facilitato la visualizzazione del trasporto anterogrado dei Vons. L'incorporazione di queste proteine di fusione nelle particelle virali consente il loro rilevamento sui punti di trasporto, osservabili come punti fluorescenti in movimento. Le condizioni di imaging sopra menzionate riducono al minimo lo spostamento di ciascun fluoroforo su una particella in movimento durante il cambio dei filtri.L'utilizzo di ruote portafiltri a commutazione rapida e di specchi dicotroici multipasso abbinati permette di acquisire rapidamente in sequenza due o più canali fluorescenti a velocità fino a 0,8 fotogrammi al secondo in una finestra di acquisizione di tre minuti. Si osservano frequentemente numerosi Punta in movimento e si generano rapidamente ampi campioni per analisi di colocalizzazione. Qui viene mostrato uno schema del sistema di coltura compartimentalizzato raffigurato nell'immagine, con neuroni del ganglio cervico-toracico superiore (SCG) seminati nel compartimento di sinistra e con proiezioni assonali che si estendono al di sotto delle barriere interne fino al compartimento più a destra.Le seguenti immagini sono state selezionate da un filmato in time-lapse composto da immagini affiancate che mostra la trasmissione di virioni da assoni infettati dal PRV 4 27 a cellule epiteliali riceventi. In questo primo pannello emerge l'immagine delle fluorescenze YFP e RFP in un determinato momento successivo all'infezione. Quando le cellule riceventi iniziano ad esprimere proteine ​​di fusione fluorescenti legate alla membrana YFP e VP26-MRFP, queste vengono mostrate.La scatola bianca evidenzia un'area delle cellule epiteliali del ricevente contenente assemblaggi di capside infettivi. Qui viene mostrata la stessa area dell'immagine precedente, osservata esclusivamente attraverso il canale RFP. La linea bianca continua indica la rappresentazione schematica del contorno cellulare.Le linee bianche tratteggiate indicano le nuclei cellulari e le linee blu delimitano gli assoni. In questo secondo pannello, i canali YFP e RFP sono mostrati insieme. Si noti il gran numero di puntini MRFP associati ai tratti assonali.Queste cellule sono state recentemente infettate e non esprimono alcuna delle due proteine di fusione. Le cellule infette possono essere tracciate a ritroso per visualizzare i capside fluorescenti che hanno iniziato l'infezione virale. Queste singole cellule possono essere isolate dal campo ampio e seguite senza una perdita significativa di dettaglio.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la microscopia su cellule vive influenza il processo biologico in osservazione. Tuttavia, un'attenta ottimizzazione di questi protocolli permette la visualizzazione senza alterazioni.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Questo video mostra un metodo per monitorare il traffico di cellule infette da proteina 0, ICP0 nell'infezione da virus dell'herpes simplex-1. Dopo la sintesi de novo, ICP0 trasloca nel nucleo, spostandosi successivamente nel citoplasma durante la progressione dell'infezione. La microscopia a immunofluorescenza rivela e analizza la localizzazione subcellulare della proteina, offrendo informazioni sul suo traffico nelle fasi dell'infezione.

Una tecnica di immunofluorescenza per la localizzazione di proteine virali in cellule infette

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Descriviamo un protocollo per monitorare la mobilità radiale delle cellule immunitarie non aderenti in vitro utilizzando un collettore/apparato di vetrini per sedimentazione cellulare. La migrazione cellulare viene tracciata su monostrati di cellule tumorali o su proteine della matrice extracellulare. L'esame al microscopio ottico e a fluorescenza consente di osservare la mobilità cellulare e la funzionalità citotossica.

Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

ICP0 subisce la traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l'uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell'infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.

Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Il trasporto endocitico e retrogrado delle proteine dalla membrana plasmatica alla rete trans-Golgi è essenziale per mantenere l'omeostasi della membrana e regolare la segnalazione. Qui, descriviamo un metodo per visualizzare e quantificare il trasporto endocitico di proteine cargo transmembrana mediante microscopia su cellule vive utilizzando nanocorpi anti-GFP derivatizzati in cellule HeLa.

Imaging con cellule vive del trasporto endocitico utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura

Impara a visualizzare il trasporto anterogrado e la diffusione del virus herpes in colture neuronali primarie mediante imaging cellulare dal vivo con proteine fluorescenti. Questo metodo consente di studiare la dinamica virale in tempo reale.

Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione

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