Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per Burkholderia Specie

I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine ​​totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una mappa bidimensionale di un proteoma batterico. Ciò si ottiene coltivando prima una coltura batterica e raccogliendo le proteine. Successivamente, le proteine raccolte vengono separate in un'unica dimensione in base al loro pH.

Per focalizzazione isoelettrica dopo la separazione della prima dimensione, le proteine vengono ulteriormente separate nella seconda dimensione in base al loro peso molecolare. Infine, il gel di seconda dimensione viene colorato e le proteine vengono visualizzate. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano differenze nell'espressione proteica attraverso l'elettroforesi bidimensionale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi batterica, come ad esempio quali proteine vengono prodotte in determinate condizioni e in che modo i diversi isolati batterici differiscono nella produzione di proteine? Queste informazioni possono aiutare a identificare le proteine candidate che possono essere coinvolte nella virulenza. Dopo aver coltivato una fresa da 100 millilitri in coltura di latte freddo in fase stazionaria, trasferire 35 millilitri in una provetta da centrifuga e centrifugare a 4.500 g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Risus, sospendere il pellet in 35 millilitri di PBS freddo e ripetere la centrifugazione. Dopo aver sospeso il pellet in un millilitro di PBS freddo, trasferire la soluzione in una microprovetta sterile da due millilitri e centrifugare nuovamente. Ripetere il lavaggio in un millilitro di PBS freddo prima di centrifugare a quattro gradi Celsius e 14.000 Gs.Per un minuto, scartare il surnatante e aggiungere un millilitro di soluzione P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F trasferito il pellet disciolto in un tubo con tappo a vite da due millilitri contenente circa 0,5 millilitri di perle di vetro pre-sterilizzate.

Quindi, nella cella frigorifera per disgregare le cellule, utilizzare un mini beader tre volte per un minuto ciascuna, posizionando il campione sul ghiaccio dopo ogni centrifuga per un minuto prima di trasferire il surnatante in una provetta sterile di polistirene da cinque millilitri. Per aumentare la resa, ripetere il bead bashing due volte con un'aliquota aggiuntiva di P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Estrarre i campioni.

Quindi, dopo aver analizzato la quantità di proteine, conservare aliquote da 200 microgrammi a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso per eseguire la prima dimensione. La messa a fuoco isoelettrica o IEF inizia utilizzando la soluzione di pulizia delle strisce per pulire i supporti delle strisce. Successivamente risciacquare le strisce con acqua milli Q.

Quindi lasciarli ad asciugare capovolti dopo l'essiccazione, assegnare ogni campione a un numero di supporto per strisce di gel. Caricare un campione di proteine da 200 microgrammi precedentemente preparato nel pozzetto laterale del supporto della striscia e utilizzare la pipetta per distribuire il campione lungo il supporto utilizzando una pinza pulita. Estrarre le strisce di gel dalla confezione.

Quindi rimuovere lo strato protettivo dalle strisce di gel prima di rivestirle con il lato ruvido rivolto verso il basso con un lento movimento di scorrimento per bagnare le strisce dall'estremità negativa all'estremità positiva. Per evitare il burnout, posizionare della carta assorbente inumidita con acqua sterilizzata sopra l'elettrodo e sotto le strisce di gel. Rimuovere le bolle d'aria e ricoprirle con un sottile strato di olio minerale per evitare secchezza.

Allineare i supporti per strisce di gel sulla macchina IEF. Eseguire gli esempi utilizzando il programma elencato qui. I gel possono essere rimossi in qualsiasi momento durante l'ultimo passaggio.

Al termine del programma, rimuovere le strisce dai supporti delle strisce e, a meno che non vengano utilizzate immediatamente, coprire con pellicola trasparente e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento di eseguire la seconda dimensione Pagina SDS Dopo aver assemblato l'apparato di ruote in gel per la pagina SDS, preparare la soluzione di gel in un pallone con una punta a vuoto e una barra di agitazione aggiungendo il tampone tris draquel 1,5 molare e la miscela di acqua MCU e degassare la soluzione a velocità moderata con l'aspirapolvere per 20 minuti. Al termine del vuoto, aggiungere il 10% di SDS alla soluzione di gel pipettandola lungo il lato del pallone. Per evitare di introdurre bolle, aggiungere l'ammonio per solfato e il temid appena preparati e mescolare.

Versare il gel e lasciarlo solidificare, quindi sciogliere il DTT nella soluzione di equilibratura precedentemente preparata. Rimuovere le strisce dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius, scartarle e posizionare le strisce IPG con il lato in gel rivolto verso il basso nel tampone e incubare per 30 minuti. Quindi, aggiungere 4,5 litri di tampone per elettroforesi al serbatoio in funzione.

Quindi, utilizzando una pinzetta, rimuovere le strisce dalla soluzione di equilibratura e utilizzare un tovagliolo di carta per drenare il tampone in eccesso. Smontare l'apparecchio per colata continua in gel e lavare le lastre di vetro con acqua tiepida. Dopo aver sostituito l'acqua sulla parte superiore del gel con il tampone da corsa, usa una pinzetta pulita per posizionare una striscia sopra la piastra lunga con il lato del gel rivolto verso di te.

Lubrificare la striscia con un tampone e utilizzare una striscia di plastica per far scorrere la striscia IPG più in basso contro il gel, rimuovendo tutte le bolle d'aria tra la striscia e il gel. Aggiungere la soluzione sigillante agarro sulla parte superiore della striscia per sigillarla in posizione. Quindi, dopo aver ripetuto il processo per tutte le strisce, abbassarlo nel serbatoio del gel.

Dopo essersi assicurati che il livello del tampone nella camera esterna sia al livello designato, collegare la camera superiore. Posizionare il telaio per la camera tampone superiore sopra le lastre di vetro e premere verso il basso. Aggiungere i due x buffer di scorrimento nella camera superiore fino alla linea mediana.

Quindi aggiungere il tampone di corsa one x alla camera esterna fino a raggiungere la linea superiore. Posizionare il coperchio sopra e accendere l'unità di elettroforesi e l'alimentatore. Far funzionare i campioni durante la notte a 52 volt, 96 milliampere e cinque watt.

Esegui i gel fino a quando le linee guida sono a un centimetro dal fondo. Al termine dell'autonomia, rimuovere le piastre dalla ruota. Una volta rimossi i gel dalle lastre di vetro, fissarli in soluzione uno per almeno un'ora o durante la notte a quattro gradi Celsius.

Quindi trasferire i gel nella soluzione di fissaggio due e far oscillare per un'ora. Lavare i gel in acqua Milli Q quattro volte per 15 minuti ciascuna. Quindi utilizzare una soluzione di nitrato d'argento per colorare i gel per 30 minuti o fino a 48 ore.

Dopo aver lavato i gel per un minuto in acqua Milli Q, trasferirli nella soluzione di sviluppo fino a quando il gel non è macchiato. Circa 5-30 minuti per fermare la reazione, trasferire i gel per fermare la soluzione per 10 minuti. Qui è mostrato un gel colorante Kumasi Blues di estrazioni di proteine di cellule intere da ol dia multivorans.

Isolati clinici coltivati in LB o brodo di mannitolo di lievito e raccolti in fase stazionaria. L'analisi comparativa dei profili proteici estratti dalle stesse colture batteriche in due diverse occasioni ha mostrato modelli di bande simili che indicano il successo delle estrazioni proteiche. In questa figura l'analisi dell'elettroforesi su gel 2D di 200 microgrammi di proteine totali da Bural dio, pseudo mostra un'abbondanza di oltre 500 macchie che possono essere identificate individualmente mediante spettrometria di massa.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria per determinare le differenze quantitative e quantitative tra isolati batterici strettamente correlati. Inoltre, con una modifica al metodo di colorazione, i ricercatori possono determinare l'identità delle macchie proteiche mediante escissione spot e spettrometria di massa.