Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una mappa bidimensionale del proteoma batterico. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una cultura batterica ed estraendo le proteine. Successivamente, le proteine raccolte vengono separate in una singola dimensione in base al loro pH.

Mediante focalizzazione isoelettrica dopo la separazione nella prima dimensione, le proteine vengono ulteriormente separate nella seconda dimensione in base al loro peso molecolare. Infine, il gel della seconda dimensione viene colorato e le proteine sono rese visibili. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano differenze nell'espressione proteica attraverso l'elettroforesi bidimensionale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della patogenesi batterica, ad esempio quali proteine vengono prodotte in determinate condizioni e in che modo diversi isolati batterici differiscono nella produzione proteica. Queste informazioni possono contribuire a identificare proteine candidate che potrebbero essere coinvolte nella virulenza. Dopo aver coltivato 100 millilitri di una coltura batterica del latte a fase stazionaria, trasferire 35 millilitri in un tubo da centrifuga e centrifugare a 4.500 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Risospendere il pellet in 35 millilitri di PBS freddo e ripetere la centrifugazione. Dopo aver risospeso il pellet in un millilitro di PBS freddo, trasferire la soluzione in una provetta microcentrifuga sterile da due millilitri e centrifugare nuovamente. Ripetere il lavaggio con un millilitro di PBS freddo prima di centrifugare a quattro gradi Celsius e 14.000 ×g per un minuto. Rimuovere il soprannatante e aggiungere un millilitro di soluzione P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F; trasferire il pellet risospeso in una provetta da due millilitri con tappo a vite contenente circa 0,5 millilitri di perle di vetro pre-sterilizzate.

Quindi, nella stanza fredda, per rompere le cellule utilizzare un mini bead beater per tre volte, un minuto ogni volta, ponendo il campione sul ghiaccio dopo ogni ciclo e centrifugando per un minuto prima di trasferire il soprannatante in un tubo sterile in polistirene da cinque millilitri. Per aumentare il rendimento, ripetere l'omogeneizzazione con i bead due volte aggiungendo un'ulteriore aliquota di P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Recuperare i campioni.

Successivamente, dopo aver determinato la quantità di proteina, conservare aliquote da 200 microgrammi a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo per eseguire la prima dimensione. Per iniziare la focalizzazione isoelettrica o IEF, utilizzare prima una soluzione detergente per pulire i supporti delle strisce, quindi risciacquare le strisce con acqua milli Q.

Quindi, dopo averli asciugati, lasciarli capovolti ad asciugare e assegnare a ciascun campione un numero di supporto per strisce gel. Caricare un campione proteico di 200 microgrammi precedentemente preparato nel pozzetto laterale del supporto e utilizzare la pipetta per distribuire il campione lungo il supporto usando pinzette pulite. Estrarre le strisce gel dalla confezione.

Rimuovere quindi lo strato protettivo dalle strisce di gel prima di posizionarle con il lato ruvido rivolto verso il basso, con un movimento lento e scorrevole, in modo da bagnare le strisce dall'estremità negativa a quella positiva. Per prevenire il surriscaldamento, posizionare un foglio di carta da trasferimento inumidito con acqua sterilizzata sopra l'elettrodo e sotto le strisce di gel. Rimuovere le bolle d'aria e ricoprire con uno strato sottile di olio minerale per evitare l'essiccazione.

Allineare i supporti per strisce gel sulla macchina IEF. Eseguire i campioni utilizzando il programma elencato qui. I gel possono essere rimossi in qualsiasi momento durante l'ultimo passaggio.

Al termine del programma, rimuovere le strisce dai supporti e, a meno che non vengano utilizzate immediatamente, coprirle con pellicola trasparente e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino al momento di eseguire la seconda dimensione della SDS-PAGE. Dopo aver assemblato l'apparato per la colata del gel per SDS-PAGE, preparare la soluzione del gel in un matraccio con tappo a vuoto e una barretta magnetica aggiungendo il buffer di Tris 1,5 M di draquel e una miscela di acqua MCU, quindi disaerare la soluzione a velocità moderata sotto vuoto per 20 minuti. Al termine del vuoto, aggiungere il 10% di SDS alla soluzione del gel pipettandolo lungo la parete del matraccio. Per evitare l'introduzione di bolle, aggiungere quindi il persolfato di ammonio e il TEMED appena preparati e mescolare.

Versare il gel e lasciarlo solidificare, quindi sciogliere il DTT nella soluzione di equilibrazione precedentemente preparata. Rimuovere le strisce dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius, srotolarle e posizionare le strisce IPG con il lato del gel rivolto verso il basso nel buffer, quindi incubare per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 4,5 litri di buffer per elettroforesi nel serbatoio di corsa.

Quindi, utilizzando pinzette, rimuovere le strisce dalla soluzione di equilibrazione e usare un tovagliolo di carta per eliminare il tampone in eccesso. Smontare l'apparato per la colatura del gel e lavare le lastre di vetro con acqua calda. Dopo aver sostituito l'acqua sulla parte superiore del gel con tampone di corsa, utilizzare pinzette pulite per posizionare una striscia sulla parte superiore della lastra lunga, con il lato del gel rivolto verso di voi.

Lubrificare la striscia con un x tampone e utilizzare una striscia di plastica per far scivolare ulteriormente la striscia IPG contro il gel, rimuovendo tutte le bolle d'aria tra la striscia e il gel. Aggiungere la soluzione sigillante all'agarro sulla parte superiore della striscia per fissarla in posizione. Successivamente, dopo aver ripetuto il procedimento per tutte le strisce, abbassarle nel serbatoio del gel.

Dopo aver verificato che il livello del buffer uno x nella camera esterna sia al livello indicato, fissare la camera superiore. Posizionare il telaio della camera superiore per il buffer sopra le lastre di vetro e premere verso il basso. Aggiungere il buffer di corsa due x nella camera superiore fino alla linea centrale.

Quindi aggiungere il buffer di corsa 1x nella camera esterna fino a raggiungere la linea superiore. Posizionare il coperchio e accendere l'apparecchio di elettroforesi e l'alimentatore. Far correre i campioni tutta la notte a 52 volt, 96 milliampere e 5 watt.

Eseguire l'elettroforesi fino a quando le linee di avanzamento si trovano a un centimetro dal fondo. Al termine del tempo di corsa, rimuovere le lastre dal supporto. Una volta rimosse le gel dalle lastre di vetro, fissarle in soluzione 1 per almeno un'ora o tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Quindi trasferire i gel nella soluzione di fissaggio 2 e agitare per un'ora. Lavare i gel in acqua Milli Q quattro volte, per 15 minuti ciascuna. Successivamente, utilizzare la soluzione di nitrato d'argento per colorare i gel per 30 minuti o fino a 48 ore.

Dopo aver lavato i gel per un minuto in acqua Milli Q, trasferirli nella soluzione di sviluppo fino a quando il gel non risulta colorato. Dopo circa cinque-trenta minuti, per arrestare la reazione, trasferire i gel nella soluzione di arresto per 10 minuti. Qui è mostrato un gel colorato con Kumasi Blues di estratti proteici totali da cellule intere di ol dia multivorans.

Isolati clinici coltivati in brodo LB o in brodo di mannosio e lievito, raccolti in fase stazionaria. Un'analisi comparativa dei profili proteici estratti dalle stesse colture batteriche in due occasioni diverse ha mostrato schemi di bande simili, indicando un'estrazione proteica riuscita. In questa figura, l'analisi mediante elettroforesi bidimensionale di 200 microgrammi di proteine totali da Bural dio, pseudo mostra una ricchezza di oltre 500 spot che possono essere identificati singolarmente mediante spettrometria di massa.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la citometria al fine di determinare le differenze quantitative e qualitative tra isolati batterici strettamente correlati. Inoltre, con una modifica al metodo di colorazione, i ricercatori possono identificare le macchie proteiche mediante escissione delle macchie e spettrometria di massa.