Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente

L'obiettivo generale di questa procedura è assemblare un saggio di rivestimento del tegumento seminale per esplorare come l'endosperma controlli la germinazione del seme in un rabbit opsis in risposta a diverse condizioni ambientali a livello sia genetico che in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto utilizzando un ago da siringa e pinzette troncate per dissezionare con attenzione il tegumento seminale e l'embrione dal seme di Arab Opsis. Nel secondo passaggio, i tegumenti seminali dissezionati vengono delicatamente trasferiti su un mezzo di germinazione.

Successivamente, i tegumenti dei semi vengono assemblati in un singolo strato circolare. Nell'ultima fase, gli embrioni vengono disposti al centro del letto di tegumenti assemblato, anch'essi in un singolo strato circolare.

L'endosperma svolge un ruolo essenziale nel controllo della germinazione del seme nei nostri semi ab autopsy. E il saggio di piegamento del codice del seme è un procedimento genetico in vitro per identificare i componenti molecolari delle vie di segnalazione attive nell'endosperma che regolano la germinazione del seme. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché è complesso dissezionare rapidamente l'embrione senza danneggiarlo.

L'età del materiale da semina è altrettanto importante da considerare, poiché con il passare del tempo esso perde la capacità di controllare la determinazione cellulare. Iniziare versando da 50 a 60 microlitri di semi maturi e asciutti di Arabidopsis in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere quindi un millilitro di etanolo al 70% alla provetta e agitare i semi a temperatura ambiente mediante vortex o a 1200 giri al minuto. Dopo 10 minuti, centrifugare la provetta per tre secondi a 4.000 G per concentrare i semi sul fondo della provetta.

Quindi utilizzare una punta da aspirazione sotto vuoto per aspirare con attenzione l'etanolo, lasciando i semi sul fondo del tubo. Aggiungere ora un millilitro di acqua distillata sterile ai semi e agitare per altri 10 minuti. Dopo aver centrifugato nuovamente i semi, aspirare il surnatante e aggiungere un altro millilitro di acqua distillata sterile al tubo, assicurandosi che il flusso d'acqua sospenda i semi in modo omogeneo in tutto il tubo.

Quindi posizionare il tubo in un portatubi per permettere ai semi di depositarsi sul fondo del tubo. Dopo circa 30 secondi, aspirare con attenzione l'acqua per piastrare i semi. Versare innanzitutto 30 millilitri di mezzo di germinazione appena preparato a 50 gradi Celsius in una piastra di Petri da 100 millimetri. Ri-sospendere i semi in 200 microlitri di acqua distillata sterile, quindi utilizzare una punta da un millilitro per micropipetta per trasferirli sulla superficie del mezzo di germinazione.

Aspirare l'acqua che circonda i semi, quindi lasciare la piastra di Petri e i semi scoperti nell'armadio a flusso laminare per un'ulteriore essiccazione. Dopo due ore, chiudere la piastra di Petri, lasciando i semi nella cappa per altri 90 minuti. A questo punto, posizionare un microscopio stereoscopico all'interno della cappa.

Versare 30 millilitri di mezzo di germinazione in un’altra piastra di Petri da 100 millimetri, quindi posizionare due fogli rettangolari di carta Watman autoclavata da 3 millimetri affiancati sulla superficie del mezzo. Il passaggio più difficile di questa procedura è la dissezione del seme, poiché A, il seme è molto sottile, quindi è necessario fare molta attenzione per evitare di danneggiare l’embrione durante il taglio del seme, utilizzando una pinzetta sterile a punta smussata Dumont numero cinque.

Trasferire i semi sui fogli, tenendo poi le pinzette chiuse. Premere delicatamente un singolo seme contro la carta. Utilizzare ora la punta di un ago per siringa insulinica da 29 gauge per tagliare il tegumento del seme lungo l'asse semi-principale più lungo, il più vicino possibile al punto in cui i colletti si uniscono alla radice.

Quindi utilizzare la pinzetta per premere il seme contro la carta. Applicare nuovamente pressione all'estremità delle pinzette più vicina all'apice della radichetta per liberare l'embrione dal tegumento seminale ed assemblare un saggio di coltura su tegumento seminale. Posizionare innanzitutto un pezzo di rete di nylon sterile di dimensioni 3,5 per cinque centimetri in un'altra piastra da 100 millimetri appena colata con mezzo di germinazione.

Quindi utilizzare la siringa per spingere delicatamente gli embrioni e i tegumenti seminicali sui bordi metallici della pinzetta e trasferire i tessuti vegetali sulla maglia di nylon. Utilizzare la pinzetta e la siringa per assemblare un singolo strato circolare dei tegumenti seminicali, assicurandosi che siano il più vicini possibile tra loro e che le aperture dei tegumenti siano rivolte verso l'alto. Successivamente, posizionare gli embrioni in un singolo strato circolare al centro del letto di tegumenti, verificando che anche gli embrioni siano il più vicini possibile tra loro.

Infine, incubare i saggi su letto di seaco in continuo sotto luce a 20-21 gradi Celsius, in accordo con risultati precedenti. Semi di un mutante opsys di coniglio incapaci di sintetizzare la gierillina o mutanti carenti di GA non riescono a germinare 80 ore dopo l'inibizione del seme. Al contrario e in ulteriore accordo con risultati precedenti, la rimozione del tegumento seminale induce la crescita dell'embrione del mutante carente di GA, a meno che l'acido OB CIC o un BA siano presenti nel mezzo, suggerendo che l'endosperma dei mutanti carenti di GA rilasci un BA verso l'embrione per bloccarne la germinazione.

In questa immagine, 80 ore dopo l'inibizione del seme, viene mostrato un saggio di coltura su testa di seme con embrioni mutanti deficienti di GA su un letto di 80 testa di semi mutanti deficienti di GA. In accordo con la nostra ipotesi, le teste di semi mutanti deficienti di GA bloccano la crescita degli embrioni mutanti deficienti di GA. Qui viene mostrato un saggio di coltura su testa di seme con embrioni mutanti deficienti di GA coltivati su un letto di teste di semi mutanti deficienti di GA che mancano anche della capacità di sintetizzare A BA; 80 ore dopo l'inibizione del seme, come previsto, le teste di semi mutanti non sono in grado di bloccare la crescita degli embrioni mutanti deficienti di GA.

In modo analogo, embrioni mutanti deficienti di GA coltivati su un letto di tegumenti seminicali mutanti deficienti di GA privi del fattore deli RGL due, non sono stati in grado di bloccare la crescita di embrioni mutanti deficienti di GA seguendo questa procedura. Un altro metodo, come l'analisi dell'espressione genica proveniente dal tegumento seminale ed embrioni isolati da semi, può essere eseguito al fine di indagare l'interazione genetica utilizzando il bagno del tegumento seminale. Pertanto, una volta padroneggiata la tecnica, essa dovrebbe consentire ai ricercatori nel campo della germinazione dei semi di esplorare come il tegumento seminale controlla la crescita embrionale in risposta a stimoli ambientali nei nostri s.