Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell'intestino del generalista Spodoptera littoralis Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo ¹³ C-glucosio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di dettagliare una metodologia efficiente impiegata per caratterizzare geneticamente i batteri metabolicamente attivi nell'intestino di un insetto. Ciò si ottiene somministrando prima glucosio marcato con C 13 all'insetto per arricchire isotopicamente il DNA dei batteri metabolicamente attivi nel loro intestino. Il passo successivo è quello di estrarre il DNA della comunità batterica presente nell'intestino.

Il terzo passo consiste nel separare il DNA della specie metabolicamente attiva, che ha incorporato il C 13. Il DNA viene quindi identificato filogeneticamente e quantificato per le specie presenti mediante pirosequenziamento. Identificando così le specie batteriche metabolicamente attive che compongono la comunità presente nell'intestino dell'insetto.

Quindi l'intestino di un organismo multicellulare è un'invenzione ingegnosa per sfruttare le capacità metaboliche dei microrganismi di dissolvere o solubilizzare la materia organica complessa in modo che possa finalmente servire come nutrimento per l'insetto ospite. Per capire il sistema, dobbiamo analizzare prima chi c'è là fuori, e in secondo luogo chi ha quali attività metaboliche. Se disponiamo di questi dati, possiamo ricostruire il flusso di metaboliti e prodotti di degradazione tra i microrganismi degradanti e l'insetto ospite.

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia microbica, in particolare nel modo in cui questi microbi interagiscono con il loro ospite. In questo senso, potremmo saperne di più e chiarire e definire quali sono le funzioni che questi organismi svolgono per il loro ospite. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sui batteri intestinali attivi in generale.

Tracciando il glucosio ucle, può essere eseguito anche su altre fonti di carbonio, come l'etichettatura del cellosio per identificare i batteri attivi coinvolti nel processo di digestione del nutriente ocrant. Mantenere i litri, le uova e le piastre di Petri aggiungere la temperatura ambiente fino alla schiusa. Quindi trasferisci le larve appena nate in una scatola di plastica pulita e allevarle con una dieta artificiale a 23-25 gradi Celsius in un regime di lunga giornata con 16 ore di illuminazione e otto ore di buio dopo pochi giorni trasferisci da nove a 15 larve sane di secondo stadio dalla scatola di allevamento a piastre di Petri individuali contenenti glucosio C 13 fresco.

Dieta artificiale a spillo, sono necessarie almeno tre repliche di tre larve ciascuna per trattamento. Usa una dieta artificiale che fornisca la stessa quantità di glucosio nativo come fonte di cibo naturale come il cotone per nutrire il gruppo di controllo. Nelle prossime 24 ore.

Rinnova frequentemente le diete artificiali. Inizia trasferendo le larve con una pinza morbida in una pozza di acqua distillata per rimuovere i detriti di grandi dimensioni. Quindi trasferire in un nuovo piatto pulito per anestetizzare e uccidere gli insetti.

Metteteli sul ghiaccio e poi abbassate la temperatura a meno cinque gradi Celsius in un frigorifero. Quindi disinfettare gli insetti morti con etanolo al 70% e immergerli in PBS per la dissezione. Gli strumenti devono inoltre essere puliti con etanolo al 70%.

Inizia con incisioni nella cuticola lungo i lati destro e sinistro. Inizia dalla testa e termina dall'ano. Rimuovi l'intero esoscheletro, i tubuli del malio e il corpo grasso.

Quindi sostituire il tampone prima di aprire l'intestino con l'intestino isolato dagli altri tessuti. Elaborare l'intero budello o le sezioni per l'intestino, l'intestino medio o l'intestino posteriore. A seconda della domanda scientifica.

Trasferisci i tessuti intestinali senza PBS in un piccolo tubo sterile e conservali nel congelatore. Prima dell'estrazione del DNA, essiccare i campioni a 45 gradi Celsius in un dispositivo concentratore sottovuoto per 30-90 minuti, a seconda delle dimensioni del tessuto. Successivamente, schiaccia il tessuto essiccato usando un Pele di plastica sterile per estrarre il DNA genomico utilizzando un kit per l'estrazione del DNA nel suolo.

Quindi determinare la concentrazione del DNA finale eluso utilizzando uno spettrofotometro. Verificare la corretta estrazione del DNA metagenomico microbico dall'intestino dell'insetto preparando un test diagnostico PCR utilizzando i primer generali batterici 27 F e 1, 492 R. Per la diagnosi. Far funzionare cinque microlitri di ciascun prodotto PCR su un gel agros all'1% a 300 volt e 115 milliampere per circa 20 minuti.

La dimensione corretta degli ampliconi è di 1,5 kilobasi. Unire il DNA estratto corrispondente a ciascuna replica sperimentale. Tenendo separati quelli con e senza glucosio C 13.

Normalizzare le concentrazioni di DNA per garantire che ogni campione contribuisca equamente al suo pool. Una concentrazione finale da 500 a 5.000 nanogrammi di DNA è adatta per il processo di ultracentrifugazione. Ricontrollare la concentrazione prevista con lo spettrofotometro in una provetta sterile da 15 millilitri con tappo a vite.

Imposta il medio del gradiente. Combina il DNA quantificato con 4,8 millilitri di soluzione di cloruro di cesio. Quindi rabboccare il volume con sei millilitri di tampone di gradiente.

Trasferire con cura le miscele in provette da ultracentrifuga da 5,1 millilitri. Usando una siringa e un ago, riempire i tubi fino alla base del collo ed evitare di pompare o formare bolle d'aria. Includi almeno un gradiente vuoto senza DNA in ogni corsa.

Per fungere da gradiente di riferimento, selezionare coppie di tubi e bilanciarli con una precisione di 10 milligrammi. Applicare un copritubo su ciascun tubo e assicurarsi che non presentino perdite capovolgendo il tubo e applicando una pressione moderata a mano. Utilizzare un rotore quasi verticale con otto pozzetti.

Sigillare accuratamente i pozzetti del rotore e caricare il rotore nell'ultracentrifuga secondo le istruzioni del produttore. Centrifuga il DNA a 50.000 giri/min a 20 gradi Celsius sotto vuoto per 40 ore. Selezionare l'accelerazione massima e la decelerazione senza frenare.

Due giorni dopo, rimuovere con cautela le provette dal rotore della centrifuga utilizzando una pinza. Posizionarli in una griglia senza disturbare le sfumature formate e lavorare immediatamente le provette. Per prima cosa equilibrare un HPLC utilizzando una portata di 850 microlitri al minuto.

Quindi collegare la provetta per ultracentrifuga a un supporto a morsetto e forare il fondo della provetta con un ago da 23 gauge da un pollice collegato a una siringa. Quindi perforare con cura la parte superiore del tubo con un minatore di controllo per evitare di disturbare la forma, la pendenza e la pratica in anticipo per garantire un movimento PSA di successo. Quindi, inserire l'ago attaccato al tubo della pompa nella parte superiore del tubo dove non c'è fluido e raccogliere le gocce dal fondo direttamente in tubi Micro fuge sterili da 1,5 millilitri raccolgono una frazione ogni 30 secondi per 425 microlitri per frazione.

In questo esempio, vengono raccolte 12 frazioni da ogni gradiente. Quindi, misurare la densità di ciascuna frazione separata su una bilancia analitica. Procedere con il recupero del DNA e il pirosequenziamento consultando il protocollo testuale per 24 ore.

10 millimolari di glucosio C 13 sono stati integrati nella dieta di ssop litri. Larva. La stessa quantità di glucosio normale è stata aggiunta al cibo degli insetti di controllo. Successivamente il DNA è stato estratto dalla comunità batterica dell'intestino dell'insetto.

Su un gel per elettroforesi, una forte banda di DNA genomico nella parte superiore ha confermato il successo dell'estrazione del DNA, una PCR diagnostica. L'uso di primer batterici universali ha dimostrato la presenza di DNA batterico, il pirosequenziamento quantitativo è stato eseguito direttamente sui gradienti SIP rappresentativi per rivelare il lignaggio delle specie e la loro abbondanza relativa. Sono state generate un totale di 120.045 letture di alta qualità con una lunghezza media di 404 OT.

Il profilo di pirosequenziamento ha mostrato una maggiore abbondanza di alcune specie, tra cui enterococcus e panto nel campione marcato rispetto a quello del gruppo di controllo. Pertanto, questi batteri sono considerati metabolicamente attivi e meritano ulteriori studi. Quindi, mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare di coinvolgere un controllo adeguato nell'analisi del CYP.

Quindi, che sottrarrebbe l'impatto dello sfondo, la contaminazione nel flash dei capelli e garantire che la diversità e l'abbondanza dei batteri che appaiono o scompaiono non siano artefatti della massa stessa. Seguendo questa procedura o metodologie come l'ibridazione in situ a fluorescenza, è possibile utilizzare ed eseguire per rispondere a ulteriori domande. In tal caso si occuperà della localizzazione e della disposizione dei batteri all'interno dell'intestino dell'insetto.