Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell'intestino del generalista

L'obiettivo generale del seguente esperimento è descrivere una metodologia efficace utilizzata per caratterizzare filogeneticamente i batteri metabolicamente attivi nell'intestino di un insetto. Questo viene ottenuto somministrando innanzitutto all'insetto glucosio marcato con C 13, al fine di arricchire isotopicamente il DNA dei batteri metabolicamente attivi presenti nel loro intestino. Il passo successivo consiste nell'estrazione del DNA della comunità batterica presente nell'intestino.

Il terzo passaggio consiste nel separare il DNA delle specie metabolicamente attive, che hanno incorporato il C 13. Il DNA viene quindi identificato filogeneticamente e quantificato per le specie presenti mediante pirosequenziamento, permettendo così di identificare le specie batteriche metabolicamente attive che compongono la comunità presente nell'intestino dell'insetto.

Pertanto, l'intestino dell'organismo multicellulare rappresenta un'invenzione ingegnosa per sfruttare le capacità metaboliche dei microrganismi nel dissolvere o solubilizzare materia organica complessa, in modo che possa infine fungere da nutriente per l'ospite insetto. Per comprendere questo sistema, dobbiamo innanzitutto analizzare chi è presente nell'ambiente, e in secondo luogo quali attività metaboliche siano associate a ciascun microrganismo. Una volta ottenuti questi dati, possiamo ricostruire il flusso di metaboliti e prodotti di degradazione tra i microrganismi degradatori e l'ospite insetto.

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ecologia microbica, in particolare riguardo al modo in cui questi microrganismi interagiscono con il loro ospite. In questo senso, potremmo approfondire, chiarire e definire quali funzioni questi organismi svolgono per il loro ospite. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui batteri intestinali attivi in generale.

Tracciando il glucosio marcato, è possibile applicare la procedura anche ad altre fonti di carbonio, come la marcatura della cellulosa per identificare i batteri attivi coinvolti nel processo di digestione del nutriente. Mantenere op litri, uova e piastre di Petri a temperatura ambiente fino alla schiusa. Successivamente, trasferire le larve appena schiuse in una scatola di plastica pulita e allevarle con una dieta artificiale a 23-25 gradi Celsius in regime di fotoperiodo lungo, con 16 ore di illuminazione e 8 ore di buio. Dopo alcuni giorni, trasferire da 9 a 15 larve sane del secondo stadio evolutivo dalla scatola di allevamento a piastre di Petri individuali contenenti glucosio C 13 fresco.

Per ogni trattamento, sono necessarie almeno tre repliche costituite da tre larve ciascuna, alimentate con una dieta artificiale addizionata. Utilizzare una dieta artificiale che fornisca la stessa quantità di glucosio nativo presente in una fonte alimentare naturale come il cotone, per l'alimentazione del gruppo di controllo. Nelle successive 24 ore.

Rinnovare frequentemente le diete artificiali. Iniziare trasferendo le larve con pinzette morbide in una bacinella di acqua distillata per rimuovere i detriti più grandi. Successivamente, trasferirle in una nuova capsula pulita per anestetizzare e uccidere gli insetti.

Posizionarli sul ghiaccio e quindi abbassare la temperatura a meno cinque gradi Celsius in un contenitore refrigerato. Successivamente disinfettare gli insetti morti con etanolo al 70% e immergerli in PBS per la dissezione. Anche gli strumenti devono essere puliti con etanolo al 70%.

Iniziare con incisioni nella cuticola lungo i lati destro e sinistro. Cominciare dalla testa e terminare sull'ano. Rimuovere l'intero esoscheletro, i tubuli malpighiani e il corpo adiposo.

Quindi sostituire il buffer prima di aprire l'intestino con l'intestino isolato dagli altri tessuti. Elaborare l'intestino intero o sezioni per l'intestino medio o il retto. A seconda della domanda scientifica.

Trasferire i tessuti intestinali senza PBS in un piccolo tubo sterile e conservarli nel congelatore. Prima dell'estrazione del DNA, essiccare i campioni a 45 gradi Celsius in un dispositivo concentratore sotto vuoto per 30-90 minuti, a seconda delle dimensioni del tessuto. Successivamente, frantumare il tessuto essiccato utilizzando una bacchetta di plastica sterile per estrarre il DNA genomico mediante un kit per l'estrazione del DNA del suolo.

Quindi determinare la concentrazione del DNA finale eluito utilizzando uno spettrofotometro. Verificare un'estrazione riuscita del DNA metagenomico microbico dall'intestino dell'insetto preparando un saggio di PCR diagnostica utilizzando i primers generali batterici 27 F e 1,492 R. Per la diagnosi, far correre cinque microlitri di ogni prodotto PCR su un gel all'1% di agarosio a 300 volt e 115 milliampere per circa 20 minuti.

La dimensione corretta degli ampliconi è di 1,5 chilobasi. Raccogliere il DNA estratto corrispondente a ciascun replicato sperimentale. Mantenendo separati quelli con e senza glucosio C 13.

Normalizzare le concentrazioni di DNA per garantire che ogni campione contribuisca in modo equo al pool. Una concentrazione finale compresa tra 500 e 5.000 nanogrammi di DNA è adatta per il processo di ultracentrifugazione. Verificare nuovamente la concentrazione prevista mediante spettrofotometro in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite.

Preparare il mezzo a gradiente. Combinare il DNA quantificato con 4,8 millilitri di soluzione di cloruro di cesio. Successivamente, portare a volume aggiungendo sei millilitri di tampone per gradiente.

Trasferire con attenzione le miscele in provette da 5,1 millilitri per ultracentrifuga. Utilizzando una siringa e un ago, riempire le provette fino alla base del collo, evitando di pompare o formare bolle d'aria. Includere almeno un gradiente vuoto senza DNA in ogni corsa.

Per fungere da gradiente di riferimento, selezionare coppie di provette e bilanciarle entro 10 milligrammi. Applicare un tappo a ogni provetta ed assicurarsi che siano ermetiche capovolgendo la provetta e applicando una pressione moderata a mano. Utilizzare un rotore quasi verticale con otto alloggiamenti.

Sigillare attentamente i pozzetti del rotore e caricare il rotore nell'ultracentrifuga seguendo le istruzioni del produttore. Centrifugare il DNA a 50.000 giri al minuto a 20 gradi Celsius sotto vuoto per 40 ore. Selezionare l'accelerazione massima e la decelerazione senza frenata.

Dopo due giorni, rimuovere con attenzione i tubi dal rotore della centrifuga utilizzando pinzette. Posizionarli su un portatubi senza disturbare i gradienti formati e procedere immediatamente con l'elaborazione dei tubi. Innanzitutto, equilibrare un'HPLC utilizzando un flusso di 850 microlitri al minuto.

Quindi fissare il tubo dell'ultracentrifuga a un supporto con morsetto e perforare il fondo del tubo con un ago da 23 gauge di un pollice collegato a una siringa. Poi perforare con attenzione la parte superiore del tubo con un ago di controllo per evitare di disturbare la forma, il gradiente e la pratica preliminare, necessaria per garantire un'efficace separazione mediante gradiente di densità. Successivamente, inserire l'ago collegato al tubo della pompa nella parte superiore del tubo, dove non è presente liquido, e raccogliere le gocce provenienti dal fondo direttamente in provette Microfuge sterili da 1,5 millilitri; raccogliere una frazione ogni 30 secondi, con un volume di 425 microlitri per frazione.

In questo esempio, vengono raccolte 12 frazioni da ciascun gradiente. Successivamente, misurare la densità di ciascuna frazione separata mediante bilancia analitica. Procedere quindi con il recupero del DNA e il sequenziamento pirosequenziale consultando il protocollo scritto per 24 ore.

10 millimolare di glucosio C13 è stato aggiunto alla dieta delle larve ssop. La stessa quantità di glucosio normale è stata aggiunta all'alimento degli insetti di controllo. Successivamente, il DNA è stato estratto dalla comunità batterica presente nell'intestino degli insetti.

In un gel di elettroforesi, una banda intensa di DNA genomico nella parte superiore ha confermato un'estrazione del DNA riuscita, un PCR diagnostico. L'uso di primer universali per batteri ha mostrato la presenza di DNA batterico; è stata quindi eseguita una sequenza quantitativa mediante pirosequenziamento direttamente sui gradienti rappresentativi di SIP per rivelare la linea specie-specifica e l'abbondanza relativa. Un totale di 120.045 letture di alta qualità è stato generato con una lunghezza media di 404 OT.

Il profilo di pirosequenziamento ha mostrato un aumento dell'abbondanza di alcune specie, tra cui enterococcus e panto, nel campione etichettato rispetto al gruppo di controllo. Pertanto, questi batteri sono considerati metabolicamente attivi e meritano ulteriori studi. Di conseguenza, nel corso di questa procedura, è importante ricordare di includere un controllo adeguato nell'analisi CYP.

Pertanto, ciò ridurrebbe l'impatto del fondo, della contaminazione nel flash dei peli e garantirebbe che la diversità e l'abbondanza dei batteri che compaiono o scompaiono non siano un artefatto della massa stessa. Seguendo questa procedura o metodologie come l'ibridazione fluorescente in situ, si potrebbero utilizzare e svolgere ulteriori indagini. In tal caso, si indagherà sulla localizzazione e disposizione dei batteri all'interno dell'intestino dell'insetto.