Name: Microiniezione Wound Assay e In vivo Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a Drosophila Embrioni. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Impara la microiniezione per visualizzare la risposta epidermica alle ferite in embrioni di Drosophila. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica in tempo reale tramite microscopia confocale.

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Questo protocollo è stato sviluppato in collaborazione con i precedenti membri del McGinnis Lab, Kim A. Mace e Joseph C. Pearson. Ringraziamo i continui sforzi da parte Bloomington Drosophila Stock Center per il loro lavoro per organizzare e distribuire le scorte di valore. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento dal National Institutes of Health (R01 GM077197 e K12 GM68524) e la famiglia di Herbert Stern. MTJ è attualmente supportato da Grant Numero 5G12RR003060-26 dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e Grant Numero 8G12MD7603-27 dal National Institute on Minoranza Salute e disparità di salute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell&#39;Istituto Nazionale su Salubrità di Minoranza e disparità di salute o il National Institutes of Health.

Il protocollo ferita embrionale Drosophila può essere riassunto in cinque fasi: (1) Embrione Collection, (2) embrioni Preparazione (3) Embrione Offensiva, (4) Microiniezione embrioni, e (5) Embrione Fixation. 1. Embrione Collection <ol><li> Raccogliere mosche adulte, 2-3 giorni dopo eclosing, aggiungere 50 femmine e 25 maschi per una gabbia di raccolta degli embrioni. </li><li> Posizionare un succo fresco di mela agar più piatto lievito ogni mattina per tre giorni. Note: Per la raccolta ottimale di embrioni, il ciclo le mosche su un programma di 12 ore diurne in un incubatore a 25 ° C (5:00 luci &quot;ON&quot; e 17:00 le luci &quot;OFF&quot;); mosche femmine reagiscono ai cambiamenti del ciclo di luce e sarà depositare grandi quantità di uova durante il passaggio da luci &quot;ON&quot; per le luci &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> Nel pomeriggio del Day-3, inserire un fresco succo di mela, più piastra di agar lievito sulla gabbia e raccogliere embrioni per 2 ore. Posizionare una nuova piastra di lievito sulla gabbia e salvare la2 piastra di raccolta h. </li><li> Conservare la piastra di raccolta per un ulteriore 14 ore a 25 ° C per invecchiare gli embrioni. Note: La guarigione delle ferite può essere dosati in qualsiasi momento durante lo sviluppo di Drosophila, i giornalisti trascrizionali ferita indotta descritti in questo documento hanno un&#39;attività ottimale tra le fasi 15-16 Dicembre. Con la fase tardiva 17, l&#39;embrione è troppo vecchio per bucare facilmente la cuticola maturazione e attivare efficacemente i giornalisti ferita o individuare la trascrizione ferita indotta. Per consentire il tempo di raccolta e il tempo ferimento che si hanno durante le ore di punta del laboratorio, seguiamo un programma di raccolta di embrioni per 2 ore (16:00-18:00), sostituire la piastra di raccolta con una nuova piastra alle 18:00, l&#39;età la piastra di raccolta a 25 ° C per 14 ore (durante la notte), e conclude gli embrioni alle 08:00 (giorno successivo). </li></ol> 2. Embrione Preparazione Note: Questo protocollo include l&#39;uso di molti strumenti e oggetti che sono taglienti o fatti di glass. Trattare tutti i taglienti e oggetti in vetro con cura per evitare lesioni personali. <ol><li> Rimuovere delicatamente gli embrioni da lastre di raccolta con un pennello con l&#39;aggiunta di 2-3 ml di acqua alla piastra e vorticoso. Trasferire l&#39;acqua e gli embrioni da piastra in nylon mesh e tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere 4-5 ml di candeggina per la protezione di una piastra Petri piatto di plastica ed immergere l&#39;estremità maglia coperta del tubo di raccolta contenente gli embrioni in candeggina per 2 min; che rimuove il guscio esterno dell&#39;embrione. Ruotare manualmente il tubo di raccolta un paio di volte per evitare che gli embrioni di aggregazione nella candeggina. Sciacquare embrioni con 10x acqua e asciugare il tubo di raccolta maglie coperto contenente gli embrioni dechorionated su un tovagliolo di carta. </li><li> Utilizzare un ago da dissezione per trasferire ~ 50 embrioni da nylon mesh a una piastra di agar. Aggiungiamo colorante alimentare verde alla piastra di agar per aggiungere contrasto e di aiuto in allineamento embrione. Sotto un microscopio da dissezione, fare due file parallele di ~ 25 embrioni, allineando la Embryos sul vetrino in modo che siano perpendicolari alla puntura sull&#39;apparato microiniezione. Lascia un po &#39;di spazio (circa 1 lunghezza dell&#39;embrione) tra gli embrioni a fini di scambio del gas. I due file parallele dovrebbero essere di circa 5 mm. </li><li> Posizionare un vetrino con nastro biadesivo sulla parte superiore degli embrioni allineati e premere delicatamente il vetrino per trasferire gli embrioni dalla piastra verde alla diapositiva. Poi asciugare gli embrioni ~ 25 min per ridurre la pressione interna dell&#39;embrione ed evitare una raffica quando ferendone. </li><li> Mettere 2-3 gocce di halocarbon mix petrolio negli embrioni per impedire ulteriore disidratazione. </li></ol> 3. Embrione Offensiva <ol><li> Posizionare il vetrino embrione nello stadio microscopio iniezione. Trova gli embrioni nel campo visivo e praticare spostando la fase del microscopio invertito. Note: Prima di lavorare con l&#39;ago, concentrarsi sul piano medio dell&#39;embrione lungo l&#39;asse dorsoventral. Per consentire ferimento efficiente dellaembrioni allineati, iniziano ferendo la riga più vicino all&#39;apparato ago. Spostare la fase di portare la parte superiore della fila di embrioni allineati nel campo visivo. </li><li> Posizionare con cura e fissare un ago tirato in porta-aghi. Utilizzare il micromanipolatore per spostare l&#39;ago verso il basso verso diapositiva. Allineare l&#39;ago con l&#39;embrione, in uno stesso piano focale. Una volta che l&#39;ago è a fuoco con l&#39;embrione, non spostare l&#39;ago con il micromanipolatore. </li><li> Spostare il palco per forare l&#39;embrione tutto e per tutto, per poi passare a quello successivo embrione nella riga. Una volta fatto ferendo la prima riga, utilizzare il micromanipolatore per spostare l&#39;ago completamente in alto e lontano dal palco prima di spostare la slitta, ruotare manualmente lo scivolo di 180 ° e ferita la seconda fila. </li><li> Conservare gli embrioni sotto Halocarbon a temperatura ambiente e procedere con la fissazione di embrioni se facendo ibridazione in situ o colorazione degli anticorpi (vedere Procedura passo 5). In alternativa, conservare gli embrioni per 4-6 oresotto Halocarbon e procedere con la trascrizione visualizzazione reporter fluorescente ferita (Rappresentante dei risultati). Note: Per la visualizzazione del reporter fluorescente, abbiamo anestetizzare gli embrioni con il 50% 1-fenossi-2-propanolo 13. Gli embrioni vengono rimossi dall&#39;olio alocarburi e collocati su una nuova diapositiva. Abbiamo posto perle di vetro intorno gli embrioni, aggiungiamo qualche goccia di anestetico, e posto un vetrino su embrioni. </li></ol> 4. Embrione microiniezione Note: L&#39;apparato microiniezione che usiamo nel protocollo non è automatizzato per fornire volume specifico durante il dosaggio. Aggiungiamo un colorante alla soluzione per visualizzare la microiniezione e cercare di normalizzare il volume erogato. Se troppa soluzione viene iniettata nel dell&#39;embrione, la membrana vitellina scoppierà. <ol><li> Carico ago dal retro con 1 ml di soluzione chimica più colorante (come 0,6 MH 2 O 2). Consenti capillareazione per disegnare la soluzione chimica alla punta dell&#39;ago. </li><li> Per rompere un ago, inserire un vetrino in un angolo su un vetrino e cappotto il bordo con la miscela di olio halocarbon. Portare l&#39;ago montato a fuoco con il bordo del coperchio slittamento angolato e delicatamente spostare bordo vetrino attraverso la punta dell&#39;ago fino rotto. Applicare una pressione su apparecchi microiniezione e controllare che la soluzione chimica più colorante scorre l&#39;ago. </li><li> Posizionare la diapositiva contenente embrioni allineati sul palco microscopio. Procedere per mettere a fuoco l&#39;embrione e l&#39;ago nello stesso piano. Contemporaneamente puntura e la soluzione microinject chimica più tingere in ogni embrione. Note: aghi ostruiti si verificano di frequente, rompere un ago nuovo per evitare microiniezione incompleta. Una punta smussata dell&#39;ago non liquidata in modo pulito come una punta angolata ago. Regolare il vetrino di un non-angolo di 90 ° durante la rottura è ottimale per produrre una punta angolata ago. </li></ol> 5. Formaldeide Fixation Note: I prodotti chimici utilizzati in questa fissazione Drosophila sono dannosi. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (es. guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) durante la manipolazione dei prodotti chimici. Seguire le singole linee guida istituzionali per lo smaltimento di sostanze chimiche regolamentate. <ol><li> Dopo ferimento, attendere 15, 30, 60, o più minuti per l&#39;attivazione trascrizionale di geni ferita indotta a verificarsi. Per rimuovere gli embrioni da diapositive di iniezione, scolare con cura il mix Halocarbon dalle diapositive, appoggiare la slitta contro un rack e asciugare alla fine con un Kimwipe. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro per sciacquare eptano sul vetrino e lavare il liquido di risciacquo in una piastra di Petri di vetro. Eptano scioglierà il nastro e rilasciare gli embrioni. Continuare a sciacquare fino a quando tutti gli embrioni vengono rimossi dalla diapositiva. Passare alla diapositiva successiva, fino a quando tutti gli embrioni vengono rimossi da diapositive. </li><li> Trasferire la soluzione più eptano embrione dal piatto di vetro in un sci 20 mlntillation flaconcino. Agitare il flaconcino per 2-3 minuti, togliere il eptano e aggiungere 5 ml di eptano fresca. </li><li> Aggiungere 5 ml di fresco, soluzione di fissaggio (vedi elenco reagenti per la ricetta). Tappare il flacone e allegare ad una piattaforma agitatore orbitale. Agitare il flacone contenente gli embrioni per 25 min a 220-230 rpm. </li><li> Dopo aver agitato, lasciare che le bolle all&#39;interfaccia pop. Rimuovere completamente la fase di fondo, acquosa con una pipetta, evitando di tirare su gli embrioni. Lo strato inferiore è costituito da soluzione di fissaggio e deve essere smaltito correttamente. </li><li> Aggiungere 5 ml di metanolo, tappare la fiala e agitare vigorosamente a mano per 20-30 secondi, turbolenza e metterlo in panchina. Embrioni feriti resteranno al interfase e non si depositano sul fondo. Note: Dopo la fissazione della membrana vitellina di un embrione non ferita normalmente scoppio durante la fase di disidratazione con metanolo. Tuttavia, la membrana vitellina in un embrione ferito è già rotto e la fase di disidratazione non rimuoverà il memb vitellinarane. Hand-devitellinzation è necessario per completare il protocollo di fissaggio. </li><li> Rimuovere con attenzione lo strato eptano cima e poi aggiungere 5 ml di metanolo fresco. Agitare il flacone e gli embrioni devono affondare. </li><li> Rimuovere il metanolo più soluzione embrione con una pipetta di trasferimento vetro e raccogliere in una provetta di raccolta nylon mesh in un piatto di vetro. </li><li> Rimuovere il metanolo e lavare gli embrioni con una soluzione 1x PBS. </li><li> Trasferire gli embrioni dalla rete di nylon ad una piastra di succo di mela. Distribuire gli embrioni lungo la superficie della piastra. </li><li> Trasferire gli embrioni di un vetrino nastro biadesivo. Coprire gli embrioni con 1x PBS. Note: Gli embrioni tendono a raggrupparsi a causa della membrana vitellina. Utilizzando un succo di mela luogo permette una rapida separazione degli embrioni clumped. Gli embrioni devono essere rimossi dalla piastra e trasferite su un vetrino nastro biadesivo perché embrioni affondano nella piastra di agar quando la forza è applicata per rimuovere l&#39;embrione dalmembrana vitellina. </li><li> Spingere con cautela gli embrioni con un ago da dissezione a &quot;pop&quot; la membrana vitellina. L&#39;embrione dovrebbe sprofondare nel PBS. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire la 1x PBS più embrioni in una provetta da 1,5 ml. Lavare gli embrioni con 1x PBS e conservare a 4 ° C. Procedere a disidratare gli embrioni utilizzando una Etanolo: serie PBS e continuare con ibridazione in situ o protocollo immuno-14. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una risposta trascrizionale di regolamentazione immediata a stimoli esterni permette alle cellule di coordinare una risposta localizzata a stimoli extracellulari, che possono includere lo stress, danni o infezioni. Il controllo improprio di una risposta localizzata può avere effetti dannosi sulle cellule vicine, nonché uno spreco di risorse per riparare il danno. L&#39;embrione di Drosophila offre un ottimo sistema per condurre esperimenti di base guarigione della ferita in un poco costoso e facile da mantenere organismo modello. Il potenziale di collaborazioni tra ricerca in altri organismi modello e Drosophila offre un&#39;opportunità unica di esplorare molte questioni biologiche. Una tecnica aggiuntiva dei reporter ferita è la combinazione genetica di sfondi mutanti, prevedere un metodo efficace per testare il contributo dei nuovi geni per l&#39;attivazione della via di risposta epidermica ferita. Abbiamo giornalisti epidermiche ferita indotta trascrizionali available sia il 2 e 3 cromosomi rd 5. In questo studio utilizziamo UAS e sistemi GAL4 di sovraespressione 16. Per gli studi con letali alleli mutanti determiniamo il background genetico utilizzando un cromosoma bilanciatore fluorescente, ad esempio Kruppel-GFP 17. Abbiamo analizzato la localizzazione ferita giornalista in diversi background genetici (Tabella 1). Una eventuale modifica della tecnica è quella di combinare microiniezione e ferimento. Microiniezione può essere utilizzato per introdurre una soluzione chimica nell&#39;embrione. Diversi composti chimici sono stati testati e sono stati trovati a disciplinare l&#39;attività dei giornalisti epidermica ferita 9. Questo metodo di ferimento simultanea e microiniezione può essere utile per aumentare il numero di cellule in Drosophila che risponde un segnale ferita e può essere utilizzato direttamente per monitorare cambiamenti di espressione genica dopo ferendo 18. Una futura applicazione della tecnica microiniezione sarà quello di testare nuove sostanze chimiche per la regolazione della risposta epidermica ferita. Drosophila come sistema modello per studi genetici offre una vasta gamma di protocolli semplici per affrontare efficacemente questioni complesse. Recenti rapporti sulla fattibilità di tecniche di Drosophila mette in evidenza l&#39;uso di hemocyte migrazione 19 e parassitarie vespa infezione 20 come un mezzo per ampliare ulteriormente l&#39;impatto della comunità di ricerca Drosophila. Oltre agli studi di riparazione della ferita, Drosophila fornisce un modello classico per la rigenerazione del sistema disco immaginale 21,22. I progressi combinati negli studi di rigenerazione del disco immaginali e puntura / microiniezione ferimento offre un ottimo sistema per scoprire i componenti ben conservati di riparazione dei tessuti.

Manipolazione di embrioni di Drosophila utilizzando una tecnica di microiniezione è un&#39;analisi consolidata 1. Il significato del metodo epidermica ferita risposta giornalista è di combinare il protocollo per puntura / microiniezione con reporter fluorescenti e visualizzare una risposta in vivo di danno epidermico in embrioni di Drosophila. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di consentire una più ampia gamma di scienziati di utilizzare Drosophila come strumento per studiare i processi che regolano la risposta trascrizionale di danno epidermico puntura. L&#39;epidermide singoli strati in Drosophila offre un sistema semplice per studiare una risposta epidermica ferita dopo un infortunio puntura 2. L&#39;embrione Drosophila è un sistema modello robusto per geneticamente sezionare le fasi di riparazione delle ferite, compresa la risposta ferita, infiammazione e riepitelizzazione 3. Questo è in parte perché molti o più zigotiche mutanti sopravvivono alla fine del embryogenesè e sviluppare le barriere epidermiche anche quando patterning di sviluppo va profondamente storto. Caratterizzazione precedente di un fattore di trascrizione testa granulare ben conservato (Grh), hanno identificato che i geni Grh bersaglio Dopa decarbossilasi (DDC) e tirosina idrossilasi (PLE) sono trascrizionale attivati ​​intorno ai siti di lesione 4. Drosophila come organismo modello per la risposta della ferita fornisce una linea complementare di indagine per avanzare gli studi in mammiferi guarigione delle ferite 5. Studi successivi hanno identificato i geni aggiuntivi ferita indotta Drosophila e sviluppato un &quot;toolkit&quot; di molti giornalisti ferita fluorescenti per monitorare la vivo epidermica risposta ferita a pulire ferendone 6. Recenti rapporti sulla regolazione della guarigione della ferita Drosophila sono concentrati sul fenotipo chiusura della ferita, permettendo la scoperta di molte vie che regolano la migrazione delle cellule 7,8. Con l&#39;analisi dellareporter ferita fluorescenti, i nostri studi hanno identificato una nuova serie di geni necessari per l&#39;espressione localizzata di epidermiche geni ferita inducibile 9. Uno dei meriti del metodo di risposta ferita giornalista è che i risultati forniscono un quadro più chiaro in un meccanismo di come i segnali vengono trasdotte dal sito di lesione alle cellule vicine. Tuttavia, uno dei demeriti del metodo di risposta ferita giornalista è che i risultati non collegano direttamente fenotipi nella guarigione o riparazione della ferita. Uso più ampio del protocollo ferita puntura pulito nelle schermate genetici e chimici consentirà nuovi regolatori della risposta trascrizionale di epidermiche ferendo essere identificati e altre eventuali la traduzione di guarigione delle ferite scoperte in modelli di mammiferi di trattamenti di pregiudizio.

<table><tbody><tr><td>lievito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>succo di mela</td><td>agar generico</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>candeggina</td><td>Olio alocarbonico generico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>olio alocarburo, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- fenossi-2-propanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>perossido di idrogeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>metil-&beta;-ciclodestrina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>blu di toluidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>formaldeide, 16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>eptano chimico tossico</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>sostanza chimica tossica</td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>sostanza chimica tossica</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase free H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila incubatrice</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>gabbia per mosche</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>provetta per raccolta embrioni</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>capsula di Petri in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>nastro biadesivo</td><td>Pennello generico</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Generico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ago da dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td> vetrino per <td>oggetti appuntiti</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td> vetrino per <td>microscopio per oggetti appuntiti</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td> microscopio da dissezione <td>per oggetti appuntiti</td></tr><tr><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ago capillare</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>FHC 30-30-1<td>estrattore di aghi</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>porta ago per microiniezione</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td> micromanipolatore Narishige MN151 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio invertito</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>in vetro Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>oggetto appuntito</td></tr> in <tr><td>vetro Pasteur pipetta</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td><td></td></tr><tr><td>bulbo per il trasferimento</td> di oggetti appuntiti <td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>fiala di scintillazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>agitatore orbitale</td> per oggetti appuntiti <td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>tubo da 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr> soluzione di fissazione <tr><td>confocale</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td>a scansione laser</tr> <tr><td></td><td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldeide</td><td>2,5 ml</td><td></td><td>sostanza chimica tossica</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0,5 ml</td> 0,5 m <td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr> senza <tr><td>RNasi H2O</td><td>1,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscela di olio alocarbonico</td> <td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>olio alocarbonico, 700 W</td><td>5 ml olio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alocarbonico, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microiniezione wound assay e<em&gt; in vivo</em&gt; localizzazione di epidermal wound risposta giornalisti a<em&gt; drosophila</em&gt; embrioni.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Drosophila sviluppa uno strato epidermico robusto che serve sia per proteggere le cellule interne da un ambiente esterno duro e per mantenere l&#39;omeostasi cellulare. Lesioni puntura con aghi di vetro fornisce un metodo diretto per innescare una rapida risposta epidermica ferita che attiva ferita reporter trascrizionali, che possono essere visualizzati da un segnale giornalista localizzata in embrioni vivi o larve. Lesione di puntura o laser fornisce anche i segnali che promuovono l&#39;assunzione di emociti al sito della ferita. Sorprendentemente, grave (fino in fondo) lesioni puntura in embrioni fase avanzata interrompe solo raramente normale sviluppo embrionale, come maggiore del 90% di tali embrioni feriti sopravvivere adulta quando embrioni vengono iniettati in un mezzo di olio che minimizza la perdita immediata di emolinfa da siti di puntura . La procedura ferita richiede micromanipolazione degli embrioni di Drosophila, include l&#39;allineamento manuale degli embrioni in agPiastre Ar e trasferimento degli embrioni allineati vetrini da microscopio. Il test di risposta epidermica ferita Drosophila fornisce un sistema rapido per testare i requisiti genetici di una varietà di funzioni biologiche che promuovono la guarigione delle ferite, così come un modo per schermare per potenziali composti chimici che promuovono la guarigione delle ferite. Il ciclo di vita breve e semplice routine di coltura fanno Drosophila un potente organismo modello. Drosophila pulita la guarigione delle ferite appare per coordinare la risposta rigenerativa epidermica, con la risposta immunitaria innata, in modi che sono ancora oggetto di indagine, che fornisce un ottimo sistema per trovare conservato normativo meccanismi comuni di Drosophila e mammiferi epidermica ferimento.

Per ottenere i risultati mostrati in questo metodo, la fase di lettura aperta della proteina fluorescente verde (GFP) è fuso ad un promotore / ferita indotta sequenza enhancer da dopa decarbossilasi (DDC) e DsRed è fuso ad una sequenza enhancer ferita da tirosina idrossilasi ( PLE) 4,6. In un live Drosophila, maturazione della proteina reporter fluorescente ferita è ottimale 4-6 ore dopo il ferimento, che permette di tempo per l&#39;accumulo di proteine ​​sufficiente per visualizzare, così come il tempo per la proteina fluorescente per ossidare allo stato fluorescente 15. Per osservare la localizzazione giornalista, un microscopio a fluorescenza composto è sufficiente. Per osservare un ingrandimento maggiore della localizzazione giornalista, un microscopio confocale è ottimale per generare una sporgenza massima di più sezioni ottiche (Figura 1). Confocale immagini in vivo di embrioni di Drosophila è complicata dal raondulazioni pid dell&#39;embrione. . Una full-view di embrione può essere ottenuta con 20X oggettiva e una vista ravvicinata del sito di ferita può essere ottenuta con obiettivo 40x. Un top-vista epidermico localizzazione ferita giornalista può essere ripreso con 10 successive sezioni ottiche 1μm. Una laterale-vista epidermico localizzazione ferita giornalista può essere ripreso con 40 successive 1 micron sezioni ottiche. Utilizzando metodi di attraversamento genetico standard, è possibile combinare i giornalisti ferita con mutazioni genetiche. Un esempio presentato in questo documento è flotillina-2 (Flo-2), in quanto guadagno-di-funzione (sovraespressione generato con espressione ubiquitaria in tutte le cellule) mutanti perdita-di-funzione (allele nullo generato con l&#39;inserimento P-elemento) e di flo-2 dimostrano il prodotto genico Flo-2 è necessario e sufficiente per inibire la localizzazione del DDC-GFP ferita reporter 9 (figure 2A e 2B). Utilizzando la miprotocollo croinjection, è possibile verificare se l&#39;introduzione di soluzioni chimiche superactivates o inibisce la localizzazione di reporter ferita. Embrioni chimicamente feriti sono stati simultaneamente feriti e iniettati con un rapporto 1:4 di 1% toluidina blu colorante e composti solubilizzati. Toluidina blu colorante consentito per conferma visiva di composti solubilizzati essere iniettato nella cavità del corpo. Embrioni di controllo sono stati feriti con un ago rotto contenente 01:04 rapporto di 1% toluidina blu colorante e soluti, senza chimica. Due esempi presentati in questo documento sono perossido di idrogeno (H 2 O 2) e metil-β-ciclodestrina (MβCD), in quanto entrambe le soluzioni chimiche sono sufficienti per attivare globalmente la localizzazione del DDC-GFP avvolto reporter 9 (Figure 2C e 2D) . Il perossido di idrogeno (H 2 O 2) è stato diluito in H 2 O e 0,6 M. Metil-β-ciclodestrina (MβCD) è stato solubilizzato in 1 mM NaOH a 3 mM. Utilizzando il protocollo fissazione embrione, è possibile rilevare l&#39;attivazione della trascrizione dei geni di risposta avvolti in un dominio localizzato, che circonda un sito della ferita. Un esempio qui presentato è il ibridazione in situ di sonde di RNA per rilevare DDC e trascrizioni PLE 4,6,9 (Figure 3A e 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. DDC-GFP e PLE-DsRed ferita giornalista localizzazione. Brightfield e le immagini fluorescenti feriti embrioni wild type. (A) Top-view del DDC-GFP giornalista ferita. (B) Top-view di PLE-DsRed ferita giornalista. Tutte le immagini sono state raccolte su un microscopio confocale Leica SP2, con l&#39;obiettivo 20X. Le frecce indicano sito della ferita. Le linee tratteggiate nel pannello datis segnano i contorni di embrioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Localizzazione del giornalista DDC-GFP avvolto in background mutanti genetici e chimici microiniettato embrioni. Brightfield e immagini fluorescenti di feriti flotillina-2 (Flo-2) embrioni mutanti. (A) Perdita di funzione Flo-2 {} KG00210 mutanti, espansione delle attività di giornalista in tutte le cellule epidermiche. (B) guadagno-di-funzione Flo-2 (armadillo-GAL4, UAS-FLO2) mutanti, l&#39;inibizione dell&#39;attività di giornalista in tutte le cellule epidermiche. (C) perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) soluzione microiniezione, l&#39;espansione di reporter attività durante tutte le cellule epidermiche. (D) metil-β-ciclodestrina (MβCD) soluzione microiniezione, espansione dell&#39;attività giornalista in tutte le cellule epidermiche. Tutte le immagini sono state raccolte su un microscopio confocale Leica SP2, con l&#39;obiettivo 20X. Le frecce indicano sito della ferita. Le linee tratteggiate nei pannelli di dati segnano i contorni di embrioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Rilevamento di risposta ferita trascritti del gene RNA. Immagini fluorescenti di ibridazione in situ e la rilevazione di RNA a feriti embrioni wild type. DDC (A) e PLE (B) trascritti di RNA si accumulano intorno al luogo della ferita. Tutte le immagini sono state raccoltated su un microscopio confocale Leica SP2, con l&#39;obiettivo 20X. Le frecce indicano sito della ferita. Le linee tratteggiate nei pannelli di dati segnano i contorni di embrioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Tabella 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabella 1. Sintesi dei giornalisti risposta epidermica ferita. Inserimenti dei quattro giornalisti di risposta ferita (DDC, pio, msn, KKV) sono disponibili sia sul secondo e terzo cromosomi. Tutti i reporter risposta ferita attivare il gene fluorescenza (GFP o DsRed) in un numero limitato di cellule epidermiche circostanti il sito di lesione di puntura nel tipo selvatico sfondo (es fenotipo &quot;locale&quot;). Reporter risposta DDC e MSN ferita richiedono Grh per attivazione del fluorescence gene dopo l&#39;infortunio puntura (ad esempio, &quot;none&quot; fenotipo). Tutti i giornalisti ferita richiedono Flo-2 per la localizzazione del gene della fluorescenza dopo l&#39;infortunio puntura (ad es fenotipo &quot;globale&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

L&#39;epidermide embrionali di fase molto avanzata di Drosophila embrioni fornisce un sistema in vivo per l&#39;analisi rapida risposta puntura ferita e possono essere combinati con manipolazioni genetiche o trattamenti chimici microiniezione per avanzare gli studi nella guarigione delle ferite per la traduzione in modelli di mammiferi.

Microiniezione Wound Assay e<em&gt; In vivo</em&gt; Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare in vivo un reporter per la risposta alla ferita epidermica nell'embrione di drosophila. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo lo stadio di sviluppo in cui l'attività del reporter può essere rilevata in modo costante. Il secondo passaggio della procedura consiste nel forare l'embrione utilizzando un ago di vetro e un apparato per microiniezione.Il terzo passaggio consiste nell'anestetizzare l'embrione per visualizzare il reporter. L'ultimo passaggio prevede la validazione della localizzazione del reporter mediante rilevamento del pattern di espressione delle sonde di RNA. Alla fine, i risultati possono mostrare l'attivazione specifica del reporter della risposta alla ferita epidermica esclusivamente nelle cellule circostanti il sito di lesione da puntura, mediante microscopia confocale.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti che prevedono l'osservazione della chiusura della ferita è che possiamo visualizzare negli embrioni vivi l'espressione genica indotta da una ferita da punzonatura. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione dei tessuti, come ad esempio in che modo le cellule circostanti una lesione regolano una risposta immediata alla ferita per favorire la riparazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi della rigenerazione tissutale, poiché la regolazione della risposta alla ferita rappresenta il passo iniziale.La guarigione delle ferite può essere analizzata in qualsiasi stadio di sviluppo. Tuttavia, allo stadio 17, il cuticolo è troppo maturo. I noti marcatori di ferita non verranno attivati.Pertanto, per dimostrare il procedimento, verranno feriti embrioni allo stadio 15-16. Raccogliere due o tre giorni di moscerini adulti, 50 femmine e 25 maschi. Trasferirli in una gabbia per la raccolta di embrioni con una piastra fresca di succo di mela, agar e una quantità abbondante di pasta di lievito.Mantenere la gabbia a 25 gradi Celsius ogni mattina per i tre giorni successivi. Sostituire la piastra con una nuova. Nel pomeriggio del terzo giorno, far accumulare le uova su una piastra fresca per due ore.Conservare questa piastra per 14 ore a 25 gradi Celsius. Un periodo di deposizione di due ore dovrebbe produrre circa 200 embrioni il giorno successivo. Aggiungere alcuni millilitri di acqua nella piastra e agitare delicatamente.Quindi, utilizzando un pennello, trasferire l'acqua e gli embrioni dalla piastra a un cestello in maglia di nylon posto all'interno di un tubo di raccolta. Preparare ora un bagno di candeggina diluita e immergervi gli embrioni per due minuti. Questo passaggio rimuove le COR, ovvero le uova.Mescolare delicatamente il bagno alcune volte per evitare l'aggregazione degli embrioni. Dopo due minuti, risciacquare gli embrioni con acqua corrente e con una soluzione di lavaggio in una piastra di Petri per cinque secondi ciascuno. Successivamente, trasferire il cestello degli embrioni su un tovagliolo di carta per asciugare gli embrioni.Successivamente, utilizzando un ago da dissezione, spostare circa 50 embrioni dalla griglia a una piastra in agar preparata con colorante alimentare verde. Il colorante serve ad aumentare la visibilità delle uova di knee. Sotto un microscopio stereoscopico, disporre due file parallele di embrioni a circa cinque millimetri di distanza l'una dall'altra.Posizionare le file a una distanza pari alla larghezza di un embrione per consentire lo scambio gassoso. Successivamente, premere delicatamente un vetrino con nastro adesivo doppio su entrambi i lati sugli embrioni in modo che le file siano perpendicolari alla lunghezza del vetrino. Per ridurre la pressione interna, lasciare asciugare gli embrioni all'aria.In questo modo non scoppiare quando vengono feriti. Dopo 25 minuti, il primo vetrino preparato dovrebbe essere asciutto. Ora, coprire gli embrioni con due o tre gocce di olio al carbonio alo, per prevenire un'ulteriore disidratazione, e procedere immediatamente con la ferita degli embrioni secchi.Posizionare il vetrino con l'embrione sulla stage del microscopio per iniezioni. Individuare gli embrioni nel campo visivo ed esercitarsi a muovere la stage del microscopio invertito. Ora mettere a fuoco il piano mediano dell'embrione lungo l'asse dorso-ventrale e portare nell'area visibile l'embrione superiore della prima fila allineata.Successivamente, posizionare e fissare con cura un ago tirato nel portaaghi. Utilizzare il micromanipolatore per abbassare l'ago verso il vetrino. Allineare l'ago con l'embrione nello stesso piano focale.Ora, non regolare ulteriormente il micromanipolatore. Spostare quindi il portapreparati in modo da perforare l'embrione completamente. Successivamente, passare all'embrione successivo nella fila.Dopo aver ferito la prima fila, sollevare completamente l'ago e allontanarlo dalla piastra. Ruotare quindi il vetrino e continuare a perforare gli embrioni nella seconda fila. Una volta feriti tutti, gli embrioni possono essere fissati immediatamente per l'ibridazione in situ o per la colorazione con anticorpi.Per esaminare i reporter fluorescenti, attendere da quattro a sei ore e trasferire l'embrione su un nuovo vetrino; posizionare delle perline di vetro attorno agli embrioni. Quindi aggiungere alcune gocce di 50% one phenoxy, two propanol, che è un anestetico, e coprire gli embrioni con un coprioggetto per le microiniezioni. Caricare l'ago di iniezione dalla parte posteriore con un microlitro di soluzione chimica più colorante, ad esempio perossido di idrogeno 0,6 molare.Permettere all'azione capillare di far risalire la soluzione chimica fino alla punta dell'ago. Successivamente, spezzare la punta dell'ago contro il bordo di una lamella in una miscela di olio di carbonio in halo. Per prima cosa, mettere a fuoco l'ago montato con il bordo della lamella inclinata a un angolo quasi ma non del tutto di 90 gradi.Successivamente, spostare delicatamente il bordo del vetrino coprioggetto lungo la punta dell'ago finché non si spezza. Quindi applicare pressione sull'apparato di microiniezione e verificare che la soluzione fuoriesca dall'ago. Se non fuoriesce, spezzare ulteriormente l'ago di poco.Ora, eseguire la stessa procedura utilizzata per forare solo gli embrioni. Questa volta, microiniettare la soluzione simultaneamente al foro. Idealmente, iniettare 10 nanolitri.Se viene iniettata troppa soluzione nell'embrione, la membrana vitellina si romperà durante la procedura di fissazione descritta nel protocollo testuale; prestare particolare attenzione ai passaggi seguenti. Utilizzare una pipetta di vetro, non di plastica, per risciacquare l'eptano sulla lamella e usare il vetro per far ruotare gli embrioni al centro della piastra di Petri in vetro. Successivamente, agitare gli embrioni nel fissativo per 25 minuti a 220-230 giri al minuto.Dopo l'agitazione, attendere che le bolle all'interfaccia si rompano prima di rimuovere completamente la fase acquosa inferiore. Inoltre, fare attenzione a non sollevare gli embrioni. Dopo l'aggiunta del metanolo, gli embrioni feriti dovrebbero raggrupparsi all'interfaccia; successivamente, distribuirli lungo la superficie della piastra in questo modo e trasferirli su un vetrino di vetro con nastro adesivo doppio lato come illustrato.Quindi spingere delicatamente gli embrioni con l'ago da dissezione per rompere la membrana vitellina e procedere con la disidratazione. Le mosche di tipo selvatico sono state trasformate con reporter fluorescenti fusi a enhancer della DOPA decarbossilasi o della tirosina idrossilasi e sottoposte al saggio descritto. In campo chiaro, è stato possibile osservare il sito della ferita, mentre in illuminazione fluorescente è stata osservata l'attività del reporter della ferita DCD.Il reporter della tirosina idrossilasi ha mostrato un risultato simile. Entrambe le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale Leica SP con un obiettivo da 20 x. La procedura è stata eseguita in un contesto di perdita di funzione in un doppio mutante.In condizioni di controllo, l'attività del reporter della DOPA decarbossilasi si è espansa in tutte le cellule epidermiche in mutanti con acquisizione di funzione generati mediante espressione ubiquitaria in tutte le cellule. È stata osservata inibizione del reporter in tutta l'epidermide. Successivamente, embrioni sono stati contemporaneamente feriti e iniettati con un composto solubilizzato e con colorante blu di udina, perossido di idrogeno e acqua, espandendo così l'attività del reporter della DOPA decarbossilasi nelle cellule epidermiche; lo stesso effetto è stato ottenuto mediante iniezione di metil-β-ciclodestrina in idrossido di sodio utilizzando ibridazione in situ U.L'attivazione trascrizionale dei geni della risposta alla ferita è stata analizzata mediante la decarbossilasi endogena del DOPA. L'espressione dell'RNA è risultata localizzata intorno al sito della ferita e, naturalmente, anche i trascritti di tirosina idrossilasi si sono accumulati nel sito della ferita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 60 minuti se effettuata correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante non dedicare troppo tempo all'allineamento degli embrioni e procedere con i passaggi successivi.

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Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Questi protocolli delineano come caratterizzare l'organizzazione e la funzione di occluso delle giunzioni del setto piegato nell'epitelio embrionale di Drosophila di controllo e mutante.

Immunocolorazione e esperimenti di penetrazione del colorante per definire le proteine di giunzione settata piegate core nell'epitelio embrionale di Drosophila

Impara la microiniezione per visualizzare la risposta epidermica alle ferite in embrioni di Drosophila. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica in tempo reale tramite microscopia confocale.

Microiniezione Wound Assay e

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