Name: Profiling Contenuti Triacylglyceride nella BAT tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e MALDI-TOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri come isolare e identificare i triacilgliceroli nelle secrezioni sebacee dei pipistrelli utilizzando cromatografia su strato sottile preparativa e spettrometria di massa MALDI-TOF. Questo metodo consente di analizzare i profili lipidici coinvolti nella segnalazione chimica.

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L&#39;assistenza è stata fornita da Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, e Cheyenne Gerdes durante lo sviluppo di metodi di laboratorio. Vorremmo ringraziare la Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) per l&#39;assistenza con TLC scansione densitometria. MALDI-TOF MS utilizzato per questo progetto è stato fornito attraverso il NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Iniziativa P3 Center (EPS-0701890) in Arkansas Biosciences Institute. Il finanziamento è stato fornito da una pesca degli Stati Uniti e Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, la Nazionale Società Speleologica, e The Center for North American Bat Ricerca e Conservazione presso l&#39;Indiana State University.

ATTENZIONE: Ottenere in anticipo tutte le statali e federali autorizzazioni necessarie per la movimentazione, il trasporto e la conservazione pipistrelli. Approvazioni devono essere ottenuti da vostra cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale, nonché dal comitato di biosicurezza istituzionale. Se pipistrelli vivi (o tessuto del sistema nervoso) devono essere trattati, i gestori degli animali dovrebbero essere vaccinati per la rabbia. Pipistrelli utilizzati in questo studio sono stati raccolti dal National Forest Ozark San Francesco, AR, durante l&#39;estate 2010 secondo metodi standard (di Arkansas State University Istituzionale Comitato Biosicurezza approvazione # 135349-1) 28. 1. Tissue Trattamento e lipidi estrazione <ol><li> Pulire tutti gli strumenti con metanolo prima e tra la raccolta di tessuto da diversi individui. Tagliare i capelli (circa 1,0 g) a partire da pelle con un paio di forbici e posto in un pallone da 125 ml Erlenmeyer. Sebo campione dalla superficie alare con il lavaggio pelle con 4-6 palle di cotone inumidito di cloroformio: Metanolo solvente (C: M; 03:02 v / v), e disporre questi in un pallone separato. </li><li> Estrarre tessuto con 10 ml di C: M (2:1 v / v) contenente 0,5% butilidrossitoluene (BHT) per evitare l&#39;ossidazione 29. Utilizzare solo solventi di qualità HPLC. </li><li> Dopo 2 ore, aggiungere circa 0,5 g di solfato anidro ad ogni pallone, mescolare brevemente, e raccogliere il solvente filtrando attraverso carta da filtro. </li><li> Ripetere i punti 1.2 e 1.3 due volte. Una volta con il 1:1 C: M e sequenziale con 1:02 C: M. Pool filtrati insieme. </li><li> Evaporare i filtrati riuniti sotto un flusso di N 2, determinare il peso secco, e disciogliere il residuo lipidico 3:2 C: M (con 0,5% BHT) ad una concentrazione di 10 mg / ml. Conservare campione in fiale di vetro a -20 ° C. In genere è meglio analizzare i campioni entro un mese dopo la raccolta del campione e per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo. </li></ol> 2. Lipid separazione da preparativa cromatografia su strato sottile <ol><li> Preparare in anticipo lavato con solvente da 1,5 ml microcetubi ntrifuge di riempimento con 3:02 C: M, risciacquo con acetone e asciugatura all&#39;aria. Questo viene fatto per rimuovere i plastificanti che possono interferire con la successiva analisi di spettrometria di massa. Conservare provette in un contenitore privo di polvere e maneggiare i tubi solo con i guanti per evitare la contaminazione da oli per la pelle. </li><li> Attivare la piastra TLC per primo pre-sviluppo con 3:02 C: M. Aggiungere abbastanza solvente alla camera TLC ad una profondità di 1 cm, quindi posizionare placca nella camera (chiudere con coperchio in vetro) e lasciare che il solvente eseguire completamente alla parte superiore della piastra. Questa operazione richiede circa 45 min. </li><li> Rimuovere la piastra e asciugare in una cappa aspirante fino a solvente evapora (circa 15 min), poi posto in un forno per almeno 10 minuti a 120 ° C. Inserire un segno di matita nella parte superiore della piastra di mantenere l&#39;orientamento quando vengono applicati campioni. Posizionare una linea di matita retta, a 1,5 cm dal bordo inferiore della piastra, per segnare la linea di base dove saranno collocati il ​​campione e gli standard. </li><li> Preparare camera di TLC tagliando unpezzo di carta da filtro grande abbastanza per allineare le due pareti corte e una parete lunga. Posizionare il filtro di carta fodera nella camera. Sarà completamente bagnata quando il solvente viene aggiunto alla camera. </li><li> Preparare 100 ml di fase mobile solvente, che è esano: etere dietilico: acido acetico (H: E: A; 80:20:2 v / v / v). Versare solvente nella camera di dare una profondità di circa 1 cm. Coprire con il coperchio in vetro, con una guarnizione grasso al silicone lungo il bordo superiore della camera. Lasciare la camera per equilibrare la notte prima dell&#39;uso. </li><li> Applicare il campione manualmente alla piastra preparata con un tubo capillare o pipetta come una striscia continua di circa 1,5 cm da un bordo a 1,5 cm dal bordo altri. Un applicatore automatico di campioni è preferito poiché caricherà il campione in una vena più omogeneo. Utilizzare le corsie esterne della piastra TLC di individuare circa 20 microlitri miscela di steroli, FFAs, TAG, e gli standard esteri di steroli (uso 10 mg / ml; miscele predefiniti possono essere ottenuti). </li><li> Posizionare la piastra TLC caricato inla camera equilibrata, chiudere con il coperchio, e sviluppare la piastra finché il solvente corre al bordo superiore. Questo richiede circa 45 min con la fase mobile qui descritto. Rimuovere la placca dalla camera e lasciare che il solvente in eccesso di evaporare dalla piastra in una cappa aspirante per circa 1 min. </li><li> Spruzzare con 0,05% rodamina 6G in etanolo al 95%. Visualizzare bande lipidi sotto una lampada a raggi ultravioletti di lunghezza d&#39;onda lunga. Segna con una matita la posizione f R per le bande fluorescenti risolti nel campione e standard. Una documentazione fotografica può essere preso a questo punto. </li><li> Identificare la banda corrispondente con lo standard TAG e rimuoverlo dalla piastra raschiando la silice con una spatola su un grande foglio di carta glassine pesare. Trasferimento di silice per una 1,5 ml di solvente lavato provetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di 3:2 C: M solvente provetta, ultrasuoni per 1 min, la silice pellet per centrifugazione, e poi trasferire il solvente in un nuovo tubo pre-pesati. Ripetere the passo precedente, in comune i filtrati, ed evaporare il solvente sotto un flusso di N 2. </li><li> Conservare il residuo essiccato contenente TAG sotto N 2 al buio a 4 ° C mentre campioni di tessuto aggiuntivi sono separati mediante TLC. Rodamina 6G è presente nei campioni, ma è insolubile in esano e viene rimosso durante dissoluzione del campione immediatamente prima analisi MS. </li></ol> 3. Analisi TAG mediante MALDI-TOF MS <ol><li> Preparare una soluzione fresca matrice α-ciano-4-idrossi-acido cinnamico (CHCA) sciogliendo 10 mg CHCA in 1 ml di solvente (49,5% etanolo, acetonitrile 49,5%, e 1% acquoso 0,1% TFA). </li><li> Preparare adrenocarticotropic ormone (ACTH; 18-39 clip, 2465,1989 Da) per risoluzione dello strumento e test di sensibilità mescolando 1 ml di ACTH (1 mg / ml) con 39,5 ml di acido trifluoroacetico 0,1% (TFA) per ottenere un 10 pmol / ml soluzione madre. Questo può essere conservato a -20 ° C per un uso futuro. </li><li> Preparare una nuova ACTH solut lavoroione (1 pmol / ml), prendendo 1 ml di / ml soluzione stock 10 pmol, la miscelazione con 9 ml 0,1% TFA, e quindi la miscelazione (1:1) con 10 ml di soluzione di matrice CHCA per ottenere un 500 fmol / concentrazione microlitri. </li><li> Preparare gli standard TAG a 10 mg / ml a 03:02 C: M per la calibrazione dello strumento MALDI (ad es tricaprin [470,361 Da], tricaprilina [554,455 Da], trilaurin [638,549 Da], tripalmitina [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristin [806,736 Da], trioleina [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], e trierucin [1.052,971 Da]). </li><li> Preparare trioleina a 10 mg / ml a 03:02 C: M per una taratura standard di lock-massa esterna TAG. </li><li> Sciogliere i campioni TAG memorizzati in esano ad una soluzione 10 mg / ml. </li><li> Preparare un 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) soluzione madre di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) con il 90% di metanolo per uso come campione e matrice standard. Anche preparare una soluzione 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) di NaOH. Coprire la provetta con la soluzione DHB con foi di alluminio<html> l al riparo dalla luce. </li><li> Mix (in tubi pre-lavati) 10,0 ml matrice DHB, 10,0 microlitri del campione o standard e 5,0 microlitri 1,0 M NaOH. Mescolare e centrifugare brevemente il tubo per portare miscela al fondo. </li><li> Spot 1.0 ml di norma, campione o ACTH su una piastra porta in acciaio inox MALDI e posto in un essiccatore fino a secco. Posizionare la piastra di destinazione nello strumento per l&#39;acquisizione dati. </li><li> Eseguire MALDI-TOF MS analizza in modo reflectron positivo. Tune e calibrare lo strumento, come descritto dal produttore dello strumento utilizzando la soluzioni standard TAG ACTH e. </li><li> Acquisire spettri per ogni campione avvistato sulla piastra bersaglio (in linea con le specifiche dello strumento; parametri per questo lavoro sono stati 5 gittata Hz laser, ~ 100 scatti al posto di ottenere uno spettro medio). Dopo la rasatura e sottraendo lo sfondo da spettri MALDI, picchi di ioni processo manualmente con il motore di ricerca online LIPID MAPPE (/ Tools / ms / glycerolipids_batch &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). </li><li> Copia e incolla spettri lista nella lista di ioni precursori e box intensità. Limitare la ricerca alla composizione acile desideri. Identificare i tag di massa / carica (m / z) rapporti da ioni presenti nello spettro per ogni campione. Se l&#39;estere metilico di acidi grassi (FAME) le percentuali sono disponibili dall&#39;analisi GC / MS separato, aggiungere questi dati per ottenere le probabilità di TAG presenti. </li></ol> STRUMENTO: Lo spettrometro di massa utilizzato in questo studio è un MALDI Micro MX Waters (dotato di un nm 20 Hz N 2 laser 337). Strumento MALDI di qualsiasi produttore con possibilità di modalità reflectron positivo può essere utilizzato. Impostazioni generali utilizzati sono tensione ad impulsi, 2.000 V; reflectron, 5.200 V; fonte, 15.000 V, con l&#39;acquisizione dei dati utilizzando il software MassLynx (ver. 4.0). Queste condizioni operative offrono una risoluzione di massa superiore a 12.000.

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<li>Fuchs, B., Süß, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo articolo presenta un metodo semplice e robusto per separare ampie classi di lipidi isolati da mammiferi tegumento mediante TLC preparativa e determinazione profili TAG mediante MALDI-TOF MS, senza dispendio di tempo derivatizzazione delle molecole lipidiche. Le fasi critiche produrre spettri qualità di TAG con MALDI-TOF MS seguenti: 1) estrazione di successo del composto con contaminazione minima o ossidazione; 2) separazione sufficiente e l&#39;isolamento mediante cromatografia e 3) ad alta risoluzione e precisione di massa MALDI-TOF MS. Questo documento viene illustrato il metodo per l&#39;estrazione e la separazione della frazione lipidica neutro dal plagiopatagium del pipistrello rosso orientale per ottenere profili MS TAG. Mentre il presente studio ha utilizzato una specie di pipistrelli (Mammalia: Chiroptera) questi metodi possono essere estesi a studiare i lipidi tegumentario di qualsiasi specie di mammifero. Bat tegumento si caratterizza per essere prevalentemente colesterolo, con minori quantità di TAG, FFAs, squaLene, e steroli / esteri di cera. Rapporti di sebo lipidi nel pipistrelli differiscono dagli esseri umani in che lo squalene è presente in basse quantità (al contrario di fino al 16% nell&#39;uomo), mentre il colesterolo si verifica in rapporti più grandi (1-7% negli esseri umani, ma 26-62% nei pipistrelli) 22 , 31. Capelli umani contengono circa il 3% TAG, mentre i rapporti fino al 28% si trovano in capelli pipistrello rosso orientale. L&#39;estrazione di campioni di lipidi dai pipistrelli è simile per le altre specie. Mentre in questo studio batuffoli di cotone imbevuto di solvente sono usati per rimuovere sebo, si può anche invertire un tubo fiala o campione contenente il solvente sulla superficie del tegumento più volte. Prodotti a nastro specializzati forniscono anche mezzi alternativi per estrarre lipidi di superficie 32. Una parte fondamentale di una corretta estrazione dei lipidi è quello di minimizzare la contaminazione da oli per la pelle. Questo è facilmente realizzabile mantenendo una bottiglia a spruzzo con metanolo e spruzzare tutti i bicchieri e utensili, pulire gli utensili con un fazzoletto tra tutti i campioni e indossando i guanti. Ossidazione of acili polinsaturi è impedito attraverso l&#39;aggiunta di BHT, e dovrebbe essere utilizzato indipendentemente dalla temperatura campioni vengono conservati a. Analisi di biomolecole di solito richiede un passo cromatografica alle molecole separate di interesse da contaminanti. TLC è usato in questo metodo, che evita requisiti strumentazione per gascromatografia, la cromatografia liquida e richiede meno esperienza tecnica per ottenere risultati affidabili e ripetibili. A seconda della classe di lipidi di interesse, molte diverse fasi mobili possono essere incorporati. Inoltre, l&#39;utilizzo di piastre HPTLC e scansione densitometria può essere utilizzato per ottenere risultati quantitativi. Mentre le variazioni dei metodi di TLC sono troppo numerosi da elencare qui, alcune fasi mobili comuni utilizzati in lipidi TLC includono cloroformio: metanolo: acqua per la separazione dei fosfolipidi e glicolipidi o isooctane: etere etilico per la separazione dei lipidi non-polari 28. In termini di separare TAG da altre classi di lipidi, la H: E: A in modosistema lvent lavora costantemente e fornisce risultati comparabili. Un altro vantaggio nell&#39;usare TLC è che le bande di interesse possono essere rapidamente profilati mediante MALDI-TOF MS senza previa derivatizzazione degli analiti. In questo studio, la silice viene tolto dalla piastra TLC, e l&#39;analita viene eluito da esso mediante sonicazione in un solvente e successiva centrifugazione per separare l&#39;adsorbente ed evaporazione del solvente di eluizione. In alternativa, matrice può essere applicato direttamente su bande analita separati su lastre TLC e poi direttamente analizzati mediante MALDI-TOF MS 33. Profili di successo, MALDI-TOF MS non si basa su sufficienti preparazione del campione e la competenza dell&#39;operatore con la sintonizzazione e la calibrazione dello strumento. Lo strumento deve essere calibrato ogni giorno con le norme riguardanti molecolare gamma di peso appropriato per le molecole di interesse. La sensibilità e risoluzione adatto (ad es ≥ 10.000) dell&#39;apparecchiatura dovrebbero essere confirmeD al giorno con ACTH. I costituenti lipidici sebacee presenti sulla superficie del tegumento dei mammiferi possono svolgere un ruolo nella colonizzazione da patogeni batterici / fungini. Pertanto, la conoscenza della composizione chimica tra le specie e gli individui possono fornire indizi sui processi di malattie umane e della fauna selvatica. Differenze intraspecifici tra gli individui malati e sani possono rappresentare segni clinici che aiutano nella individuazione della malattia e la diagnosi. Inoltre, se composti specifici che inibiscono la crescita microbica sono presenti, essi possono essere identificati per l&#39;uso nel trattamento e prevenzione di malattie.

Tessuti tegumentario mammiferi comprendono l&#39;epidermide, strutture cheratinose (ad esempio capelli e unghie), e delle ghiandole esocrine. Ghiandole esocrine sebacea tipo sono associati con follicoli piliferi, che sono indicate collettivamente come unità pilo-sebaceo 1. Ghiandole sebacee rilasciare un essudato oleoso sulla superficie della pelle denominata sebo. Il sebo è composto in gran parte da glycerolipids (ad esempio trigliceridi [tag]), acili grassi liberi (FFA), esteri di steroli / cera, e squalene. Composizione chimica del sebo è 2 specie-specifico. Oltre ad essere parte del sistema immune innato e modalità funzione antimicrobica 3, lipidi sebacee influenzano importanti processi fisiologici tra cui la perdita per evaporazione dell&#39;acqua attraverso la pelle 4, integrità cellulare e regolazione genica 5, 6 e l&#39;assorbimento del farmaco. Composizioni lipidiche sebacee possono anche servire come marcatori di malattia. Rapporti e quantità di sebacea b Alteredclassi di lipidi stradali sono segni clinici di malattie come l&#39;acne vulgaris 7, 8 forfora, dermatite seborroica 8, asteatosis 9, tra gli altri 10. Tessuti epidermici e asciugacapelli includono profili variabili contenenti steroli e derivati, TAG, FFAs, ceramidi, fosfolipidi e altri componenti lipidici minori. Poiché lipidi tegumentario possono funzionare in processi patologici, determinando differenze di composizione chimica dei TAG tra individui sani e malati può essere utile per la diagnosi clinica di malattia. I lipidi sono generalmente definiti come composti organici insolubili in acqua con sostituenti sia polare o non polare polari 11. Strutture lipidiche possono essere lunghe catene di idrocarburi, alcani ossigenati (compresi esteri cerosi, FFAs, alcoli, chetoni e aldeidi) o strutture ad anello complesse come il colesterolo 12. Ci sono otto classi principali di lipidi in base alla struttura (FFA, glycerolipids [GL], glicerofosfolipidi [GP], sfingolipidi [SP], lipidi steroli [ST], lipidi prenol [PR], saccharolipids [Sl], e polichetidi [PK]), che presentano una vasta gamma di proprietà chimiche a seconda delle classe 13. A causa della grande variazione delle proprietà chimiche delle classi lipidiche, profilazione diretta senza previa derivatizzazione di molecole lipidiche si desidera. Un metodo emergente nella ricerca lipidi è cromatografia su strato sottile (TLC) in combinazione con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione spettrometria tempo di volo di massa (MALDI-TOF MS) 14. MALDI-TOF MS è ampiamente utilizzato nella ricerca proteomica per identificare le proteine ​​e associarli a specifiche sequenze di aminoacidi a causa del molto accurate di massa &quot;impronte digitali&quot; peptide ioni generati dalle proteine ​​tripsina-digerito 15. MALDI-TOF MS può anche essere usato per profilare altre classi di biomolecole, comprese lipidi come TAG 16-18. MALDI è necessario l&#39;utilizzo di una matrice, tipcamente un composto organico che contiene le strutture doppio legame aromatiche e coniugati. Le molecole della matrice servono per trasferire delicatamente l&#39;energia del laser per gli analiti, promuovere il trasferimento di protoni, e produrre singolarmente praticati ioni in fase gassosa 19-21. Gli ioni sono sottoposti ad un campo di alta tensione sotto alto vuoto ed accelerati in un analizzatore di massa TOF dove gli ioni vengono successivamente separati da differenze di velocità che sono proporzionali alle loro rapporti tra massa e carica. Anche molto grandi biomolecole possono essere ionizzati con poca frammentazione, specie da produzione di ioni molecolari singolarmente praticati per l&#39;analisi dello spettro semplificata. La capacità di analizzare molecole lipidiche direttamente senza previa derivatizzazione ha promosso adozione immediata di MALDI-TOF MS nella ricerca lipidomico 18. Questo articolo presenta un metodo di routine per isolare e analizzare lipidi tegumentario dai capelli, le secrezioni sebacee e plagiopatagium del pipistrello rosso orientale (Lasiurus Borealis). Questo viene utilizzato per determinare le variazioni interspecifici a pipistrello lipidi tegumentario per chiarire il processo della malattia della Sindrome White-Nose (WNS) 22. WNS è una malattia fungina di pipistrelli ed è causata dalla specie psicrofile descritti di recente Geomyces destructans 23-25. WNS ha causato la morte di oltre 5 milioni di pipistrelli della caverna del Nord America e minaccia l&#39;estinzione di specie di pipistrelli vulnerabili, con potenziali impatti economici di miliardi di dollari di danni al settore agricolo 26,27. Per studiare i passaggi in G. destructans infezione, lipidi sono stati estratti dai capelli e ala tessuti di pipistrelli rossi orientali e separati in classi di lipidi di massima mediante TLC per isolare la frazione TAG per la successiva analisi mediante MALDI-TOF MS. TAG contengono catene di acidi brevi e sono facilmente rilevati da MALDI-TOF MS con poca interferenza matrice.

<table><tbody><tr><td>Butilated Hydroxytoluene</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td></tr><tr><td>TLC Piastre flessibili</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a></td></tr><tr><td>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Triolein</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TLC Lipid Standard</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>Codice NIH 53B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiale di vetro con tappo in teflon</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td></tr><tr><td>DHB</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>Codice 50862-1G-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>C8982-10X10 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sebutape</td><td>CuDerm</td><td>S100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

profiling contenuti triacylglyceride nella bat tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e maldi-tof

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Il tegumento mammiferi comprende ghiandole sebacee che secernono un materiale oleoso sulla superficie della pelle. Produzione di sebo è parte del sistema immune innato che è protettiva contro i microbi patogeni. Produzione di sebo anomala e la composizione chimica sono anche un sintomo clinico di malattie della pelle specifici. Il sebo contiene una miscela complessa di lipidi, tra cui trigliceridi, che è specie-specifico. Le proprietà chimiche di massima esposti da diversi classi di lipidi ostacolano la specifica determinazione della composizione del sebo. Tecniche di analisi per i lipidi in genere richiedono derivatizations chimici che sono i costi di preparazione dei campioni aumento alta intensità di lavoro e. Questo documento descrive come estrarre lipidi dal tegumento mammiferi, classi di lipidi ampi separati mediante cromatografia su strato sottile, e il profilo dei contenuti triacylglyceride utilizzando la spettrometria di massa matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione di tempo di volo. Questo metodo robusto consente una determinazione direttadei profili triacylglyceride tra specie e individui, e può essere facilmente applicato a qualsiasi gruppo tassonomico di mammiferi.

Il metodo di estrazione per isolare lipidi totali dal tessuto descritto da Folch 30 è una procedura semplice, atta qui. Dopo estrazione tessuto ed evaporazione del solvente, i lipidi appaiono spesso come una pellicola giallastra. Il colore giallo più probabile è da contaminanti proteici, che possono essere rimossi eseguendo una estrazione liquido-liquido. Questa elaborazione campione aggiuntivo non è necessario in questa procedura perché TLC preparativa separa la frazione TAG da tali contaminanti. L&#39;aggiunta di fresco solfato di sodio anidro in tutte le fasi di filtraggio aiuta a ridurre la contaminazione dell&#39;acqua che colpisce determinazioni di peso lipidico accurate. Mammiferi lipidi tegumentario analisi mediante TLC preparativa con H: E: A come fase mobile solito risolvere quattro bande distinte corrispondenti a (a partire dall&#39;origine) steroli, FFAs, tag e esteri di steroli / esteri di cera / squalene (Figura 1). A volte quando si utilizza analiticoad alte prestazioni cal (HP) TLC con la H: E: Una fase mobile, gli esteri di steroli, esteri cerosi, e squalene separerà e appaiono come tre bande separate. Nelle condizioni utilizzate nel presente studio, gli esteri di sterolo / cerose non sono separati. Se queste bande sono di interesse, la fase mobile può essere commutato isoottano: etere etilico (95:5 v / v), e la piastra HPTLC può essere analizzata mediante la scansione densitometria. Altri fattori che possono causare la separazione poveri. Questi sono solitamente eliminati posizionando la carta da filtro nella camera, applicando grasso per una perfetta tenuta sul coperchio, equilibrante la camera durante la notte, e mantenendo TLC camere pulite, avere separazioni e dati TLC qualità costante. Rappresentante spettri di massa MALDI-TOF ottenuto per TAG isolati dal pipistrello rosso orientale sono mostrati nelle Figure 2 e 3. Questi spettri contengono picchi di ioni TAG nel range di massa tra m / z 850-910, che è tipico per TAG isolati da mammiferi non acquaticos. L&#39;aggiunta di 1,0 M NaOH promuove singolarmente comportano ioni Na + che sono più stabili di ioni H +. Oltre alla stabilità, l&#39;assenza di ioni H + + e K aumenta la facilità di analisi spettrale. La m / z 850-910 ioni picchi corrispondono alle 16:00, 18:00, 18:01, 18:02 e porzioni FA essendo i componenti acile dominanti nei tag (Tabella 1). Eventuali frazioni FA di TAG possono essere inizialmente determinati da totale ioni m / z presenti in MALDI-TOF MS spettri, e le differenze tra le specie e degli individui dedotte. Tuttavia, se sono necessari i rapporti specifici di contenuto acile, quindi devono essere utilizzati MS / MS o la gas cromatografia (GC / MS). Ulteriori informazioni sui rapporti acil può dedurre osservando i picchi nella regione diacylglycerides dello spettro (Figura 4). Diacylglycerides sono prodotte dalla frammentazione TAG nell&#39;origine MALDI e possono essere trovati in m / z 590-650 regione. TAG frammentazione può essere aumentataomettendo l&#39;aggiunta di 1,0 M NaOH 16. Bat rosso ala tessuto orientale è caratterizzata da un picco dominante al m / z 879,7 e tessuto capelli con un picco dominante a m / z 881,8 (Figure 2 e 3, rispettivamente). Picchi a m / z 907,8, 879,7 e 855,7 (POP, OPP) sono circa anche in intensità (~ 50%) nel tessuto capelli con il picco a 853,7 essere ~ 40%. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Composizione </td><td fo:width="1in"> Elemental Composizione </td><td fo:width="1in"> Mass osservata </td></tr><tr><td> TAG Na + </td><td></td><td> TAG Na + </td></tr><tr><td> SSO </td><td> C 57 H 108 O 6 </td><td> 911,8 </td></tr><tr><td> OOS, LSS </td><td> C 57 H 106 O 6 </td><td> 909,8 </td></tr><tr><td> OOO, GFI LNSS, LSO </td><td> C 57 H104 O 6 </td><td> 907,8 </td></tr><tr><td> LOO, LLS </td><td> C 57 H 102 O 6 </td><td> 905,8 </td></tr><tr><td> LLO, OOLn </td><td> C 57 H 100 O 6 </td><td> 903,7 </td></tr><tr><td> LLL </td><td> C 57 H 98 O 6 </td><td> 901,7 </td></tr><tr><td> LLLn </td><td> C 57 H 96 O 6 </td><td> 899,7 </td></tr><tr><td> LLnLn </td><td> C 57 H 94 O 6 </td><td> 897,7 </td></tr><tr><td> LnLnLn </td><td> C 57 H 92 O 6 </td><td> 895,7 </td></tr><tr><td> OSP </td><td> C 55 H 104 O 6 </td><td> 883,8 </td></tr><tr><td> LSP, OOP, Sopo </td><td> C 55 H 102 O 6 </td><td> 881,8 </td></tr><tr><td> LOP, LnSP, LSPo </td><td> C 55 H 100 O 6 &lt;/ Td&gt; <td> 879,7 </td></tr><tr><td> LLP, LNOP, Lopo </td><td> C 55 H 98 O 6 </td><td> 877,7 </td></tr><tr><td> LnLP, LLPo, LnOPo </td><td> C 55 H 96 O 6 </td><td> 875,7 </td></tr><tr><td> LnLnP, LnLPo </td><td> C 55 H 94 O 6 </td><td> 873,7 </td></tr><tr><td> LnLnPo </td><td> C 55 H 92 O 6 </td><td> 871,7 </td></tr><tr><td> PPS </td><td> C 53 H 102 O 6 </td><td> 857,8 </td></tr><tr><td> POP, OPP </td><td> C 53 H 100 O 6 </td><td> 855,7 </td></tr><tr><td> OOM, PPL, PoPoS, Popo </td><td> C 53 H 98 O 6 </td><td> 853,7 </td></tr><tr><td> PPLN, ppol, Popoo, MYOO </td><td> C 53 H 96 O 6 </td><td> 851,7 </td></tr><tr><td> LLM, LnOM </td><td> C 53 H 94 </sub&gt; O 6 </td><td> 849,7 </td></tr><tr><td> PPP, SSLA </td><td> C 51 H 98 O 6 </td><td> 829,7 </td></tr><tr><td> PPPO, Osla </td><td> C 51 H 96 O 6 </td><td> 827,7 </td></tr><tr><td> PPoPo, PMyO </td><td> C 51 H 94 O 6 </td><td> 825,7 </td></tr><tr><td> LnLnLa </td><td> C 51 H 86 O 6 </td><td> 817,6 </td></tr><tr><td> MMS, Slap, PPM </td><td> C 49 H 94 O 6 </td><td> 801,7 </td></tr><tr><td> SLaPo, PPOM, PPMy </td><td> C 49 H 92 O 6 </td><td> 799,7 </td></tr><tr><td> PoPoM, OOCa </td><td> C 49 H 90 O 6 </td><td> 797,7 </td></tr><tr><td> MMP </td><td> C 47 H 90 O 6 </td><td> 773,7 </td></tr><tr><td> MMPo, OCAP </td><td> C 47 H 88 O6 </td><td> 771,7 </td></tr><tr><td> OCaPo </td><td> C 47 H 86 O 6 </td><td> 769,6 </td></tr><tr><td> MMM, PPCA, PMLA </td><td> C 45 H 86 O 6 </td><td> 745,6 </td></tr><tr><td> PoPCa, PoMLa </td><td> C 45 H 84 O 6 </td><td> 743,6 </td></tr><tr><td> Popoca </td><td> C 45 H 82 O 6 </td><td> 741,6 </td></tr><tr><td> LaLaP, Mmla, MCAP </td><td> C 43 H 82 O 6 </td><td> 717,6 </td></tr><tr><td> LaLaPo </td><td> C 43 H 80 O 6 </td><td> 715,6 </td></tr><tr><td> OO </td><td> C 39 H 72 O 5 </td><td> 643,5 </td></tr><tr><td> OL </td><td> C 39 H 70 O 5 </td><td> 641.5 </td></tr><tr><td> LL </td><td> C 39 H 68 O 5 </td><td> 639,5 </td></tr><tr><td> SP </td><td> C 37 H 72 O 5 </td><td> 619,5 </td></tr><tr><td> OP </td><td> C 37 H 70 O 5 </td><td> 617,5 </td></tr><tr><td> LP </td><td> C 37 H 68 O 5 </td><td> 615,5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Composizione di acidi grassi, composizione elementare, e la massa isotopica di addotti sodiated di trigliceridi e diacylglycerides. Ln = acido linolenico (18:03), L = acido linoleico (18:02), O = acido oleico (18:01), S = acido stearico (18:00), P = acido palmitico (16:00), Po = acido palmitoleico (16:01), M = acido miristico (14:00), My = acido miristoleico (14:01) La = laurico acido (12:00), Ca = acido caprico (10:00). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" /> Figura 1. Sottile strato cromatogramma ampio separazione classe di lipidi da esano: etere etilico: acido acetico(80:20:2 v / v / v) come fase mobile. Banda tra steroli e FFA non è stata identificata da uno standard, ma può essere un alcol grasso o cera diestere. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" /> Figura 2. Regione TAG estesa MALDI-TOF spettro di massa di TAG sodiated. (M / z 700-950) da pipistrello rosso orientale (L. borealis) tessuto ala Peaks individuate a m / z 853,7 (OOM, PPL, PoPoS, Popo) e m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" /> Figura 3. Regione TAG estesa MALDI-TOF spettro di massa dei TAG sodiated (m / z 700-950) da pipistrello rosso orientale (L. borealis) tessuto dei capelli.Peaks individuati a m / z 905,8 (LOO, LLS) e m / z 907,8 (OOO, GFI LNSS, LSO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" /> Figura 4. DAG regione MALDI-TOF spettro di massa di frammenti DAG sodiated (m / z 530-730). Tessuto dalla bat rosso orientale (L. borealis) ala Peaks individuate a m / z 643,5 (OO) e m / z 615,5 (LP) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

Tegumento mammiferi contiene lipidi solventi estraibili che possono fornire le composizioni chimiche caratteristiche delle singole specie. Questo articolo presenta un metodo di routine per separare ampie classi lipidiche isolate da tessuti tegumentario mediante cromatografia su strato sottile e determinare il profilo triacylglyceride laser desorbimento / ionizzazione spettrometria di massa matrix-assisted tempo di volo.

Profiling Contenuti Triacylglyceride nella BAT tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e MALDI-TOF

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e identificare il contenuto di trigliceridi presente nelle secrezioni sebacee dei pipistrelli. In primo luogo, estrarre la frazione lipidica superficiale dai tessuti tegumentari in condizioni che minimizzino contaminazioni e ossidazione. Separare i lipidi mediante cromatografia su strato sottile per ottenere la frazione di trigliceridi.Ora elaborare i dati spettrali con il software dello strumento e analizzarli mediante database chimici online. Infine, si utilizza la cromatografia su strato sottile preparativa e la spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice e tempo di volo per determinare le differenze nei profili di composizione dei trigliceridi tra i gruppi sperimentali e di controllo. Questo metodo può essere impiegato per aiutare a identificare i lipidi secreti che potrebbero svolgere la funzione di segnali chimici nelle interazioni tra ospite e patogeno.Mentre stiamo utilizzando questo metodo per studiare i segni clinici della sindrome del naso bianco, esso può essere applicato ad altri sistemi mammiferi, inclusa l'analisi dei segnali sessuali o di eventuali differenze interspecifiche nella composizione del latte. Pulire tutti gli strumenti con metanolo prima e tra un campionamento e l'altro da individui diversi. Tagliare circa un grammo di peli dalla cute e collocarlo in un pallone erlenmeyer da 125 millilitri.Per prelevare il sebo dalle superfici delle ali. Inumidire delle palline di cotone con solvente cloroformio-metanolo. Scrubbare la pelle e collocarle in un flacone separato.Estrarre ora il tessuto con 10 millilitri di cloroformio-metanolo contenente 0,5% di BHT per prevenire l'ossidazione, dopo due ore aggiungere circa 0,5 grammi di solfato di sodio anidro ed effettuare la filtrazione su carta da filtro per raccogliere il solvente. Ripetere l'estrazione in modo sequenziale con cloroformio-metanolo in rapporto 1:1 e 1:2. Successivamente, unire i filtrati ed evaporare il filtrato combinato sotto flusso di azoto.Determinare il peso secco e sciogliere il residuo lipidico a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Conservare il campione in vial di vetro a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un mese per rimuovere i plastificanti che potrebbero interferire con successivi analisi di spettrometria di massa. Riempire provette microcentrifuga da 1,5 millilitri con da tre a due di cloroformio metanolo.Quindi risciacquare con acetone ed essiccare all'aria; conservare le provette in un contenitore privo di polvere e maneggiarle esclusivamente con guanti, per prevenire contaminazioni da oli cutanei. Attivare la piastra TLC pre-sviluppandola inizialmente con un rapporto da tre a due di cloroformio e metanolo.Aggiungere il solvente nella camera per TLC fino a una profondità di un centimetro. Successivamente, posizionare la lastrina nella camera e lasciare risalire il solvente completamente fino al bordo superiore della lastrina. Rimuovere la lastrina e farla asciugare in una cappa fino a completa evaporazione del solvente.Riscaldare quindi la piastra per almeno 10 minuti a 120 gradi Celsius. Ora segnare la piastra con una matita nella parte superiore. Tracciare una linea dritta con la matita a 1,5 centimetri dal bordo inferiore della piastra per indicare la linea di base dove verranno depositati il campione e gli standard.Successivamente, tagliare un pezzo di carta da filtro sufficientemente grande da rivestire le due pareti corte e una parete lunga della camera per TLC. Inserire il rivestimento di carta da filtro nella camera. Versare 100 millilitri di fase mobile appena preparata nella camera fino a una profondità di circa un centimetro.Applicare un sigillo di grasso siliconico lungo il bordo superiore della camera. Coprire con il coperchio di vetro ed equilibrare durante la notte. Applicare il campione manualmente o con un applicatore automatico, eseguendo una strisciata continua.Utilizzare le corsie esterne della piastra TLC per applicare circa 20 microlitri di una miscela di standard. Posizionare la piastra TLC caricata nella camera equilibrata. Chiudere il coperchio e sviluppare la piastra fino a quando il solvente raggiunge il bordo superiore.Dopo circa 45 minuti, rimuovere la piastra e lasciare evaporare l'eccesso di solvente in una cappa. Spruzzare con iodio allo 0,05% in etanolo al 95%. Successivamente, visualizzare le bande lipidiche sotto una lampada a ultravioletti a lunga lunghezza d'onda utilizzando una matita. Contrassegnare la posizione dell'Rf per le bande fluorescenti risolte nel campione e nei campioni standard.Effettuare una registrazione fotografica. Successivamente, identificare la banda corrispondente al campione con tag. Trasferirla su un grande pezzo di carta vetrata e carta da filtro, quindi in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri lavato con solvente.Aggiungere un millilitro di solvente cloroformio-metanolo in rapporto 3:2 al campione e sottoporre a sonicazione per un minuto. Recuperare la silice per centrifugazione, quindi trasferire il solvente in un nuovo tubo pre-pesato. Ripetere l'estrazione con un millilitro, raccogliere i filtrati ed evaporare il solvente sotto un flusso di azoto.Conservare il residuo secco contenente i marcatori sotto azoto, al buio e a quattro gradi Celsius, mentre ulteriori campioni di tessuto vengono separati mediante TLC Rho Domine. Nelle miscele è presente Six G, ma esso è insolubile nell’esano e viene rimosso durante la dissoluzione del campione immediatamente. Prima dell’analisi mediante spettrometria di massa, preparare la soluzione lavorativa da 500 fmol per microlitro di A CTH e gli standard dei marcatori da 10 milligrammi per millilitro come descritto nel protocollo testuale.Inoltre, preparare la soluzione madre 0,5 molare di DHB con metanolo al 90% da utilizzare come matrice per campione e standard. Coprire il tubo con pellicola di alluminio per proteggerlo dalla luce. Ora mescolare 10 microlitri di matrice DHB, 10 microlitri di campione o standard e cinque microlitri di una soluzione di idrossido di sodio 1 molare, quindi centrifugare brevemente il tubo per far scendere la miscela nel punto inferiore.Applicare un microlitro di campione standard o di A CTH su una piastra target in acciaio inossidabile per MALDI e collocarla in un essiccatore per farla asciugare. Successivamente, inserire la piastra target nello strumento per l'acquisizione dei dati. Eseguire l'analisi MALDI in modalità di riflessione positiva.Regolare e calibrare lo strumento come descritto dal produttore dello strumento, utilizzando le soluzioni standard di A CTH e tag. Acquisire gli spettri per ogni campione depositato sulla piastra bersaglio, quindi eseguire la levigatura e la sottrazione del fondo manualmente dagli spettri Aldi; elaborare i picchi ionici con il motore di ricerca online lipid maps, copiare e incollare l'elenco degli spettri nell'elenco dei precursori ionici e nella casella di intensità. Limitare la ricerca alla composizione AAL desiderata. Identificare i tag in base ai rapporti massa/carica degli ioni presenti nello spettro per ciascun campione.Se sono disponibili percentuali di esteri metilici degli acidi grassi da un'analisi GCMS separata, aggiungere questi dati per ottenere le probabilità dei tag. L'analisi dei lipidi tegumentari dei mammiferi mediante TLC preparativa con HEA come fase mobile di solito si risolve in quattro bande distinte corrispondenti a steroli, acidi grassi liberi (FFAs), esteri sterili, cera, EERs e squalene. Questi spettri di massa multipli sono stati ottenuti per i tag isolati dal pipistrello rosso orientale.Tipico di un campione ottenuto da mammiferi non acquatici. Gli spettri contengono picchi ionici nell'intervallo di massa tra rapporto carica otto 50 e nove 10. Le frazioni aciliche degli acidi grassi sono i costituenti e i marcatori principali degli AAL.Ulteriori informazioni sui rapporti AAL possono essere dedotte osservando i picchi nella regione D dei gliceridi AAL dello spettro, che rappresentano la frammentazione del marcatore. Lo spettro MALDI mostra tre distinte regioni del marcatore in cui il rapporto di carica principale è basato sul numero di atomi di carbonio. Il tessuto alare del pipistrello rosso orientale è caratterizzato da picchi dominanti in queste tre regioni con rapporti di carica principali di 8 53 0.7 8, 79 0.7 e 907.8.Ricordare che quando si lavora con pipistrelli vivi o eutanasizzati, è necessario ottenere tutti i permessi richiesti per la manipolazione, lo stoccaggio e il trasporto di questi animali. Inoltre, è necessario ottenere l'autorizzazione dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e dal comitato istituzionale per la biosicurezza. Se si manipolano pipistrelli vivi o tessuto nervoso proveniente da pipistrelli, ricordare che tutti gli operatori devono essere vaccinati contro la rabbia.Inoltre, quando si lavora con determinati patogeni da bagno come gli *geo MiSiS ants*, è richiesto un laboratorio di livello di sicurezza biologica due.

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