Name: Colture neuronali stratificate per sesso per studiare le vie di morte delle cellule ischemiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri come preparare colture neuronali primarie stratificate per sesso da tessuto ippocampale embrionale. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di segnalazione specifici nel neuroni maschi e femmine.

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Lavoro supportato in parte dalla Walter S. and Lucienne Driskill Foundation e NIH R01NS058792.

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<li>Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+cerebral+ischemia%3A+possible+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms.</a> J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).</li>
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<li>Yang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+increases+neurotoxicity+of+glutamate+in+vitro+and+ischemia-reperfusion+injury+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model.</a> J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).</li>
<li>Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+effects+of+dihydrotestosterone+on+cerebral+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).</li>
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<li>Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effect+of+phenol+red+in+MCF-7+cells+is+achieved+through+activation+of+estrogen+receptor+by+interacting+with+a+site+distinct+from+the+steroid+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).</li>
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<li>Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+mitogenic+action.+III.+is+phenol+red+a+%22red+herring%22%3F%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"?</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le colture neuronali dell'ippocampo primario dissociato stratificato per sesso, in cui l'ippocampo maschile e femminile vengono sezionati, dissociati e coltivati separatamente, rappresentano uno strumento utile per studiare la segnalazione cellulare specifica del sesso nella morte delle cellule neuronali. Mentre i neuroscienziati utilizzano comunemente colture neuronali primarie, i protocolli variano tra i laboratori a seconda dei loro specifici obiettivi e interessi sperimentali. Molti ricercatori scelgono di co-coltiva...

I mammiferi sono sessualmente dimorfici con maschi e femmine che mostrano tratti e caratteristiche diverse. Le differenze di sesso si estendono anche al cervello e sono evidenti nella suscettibilità neuronale a lesioni e malattie (rivisto in1-5). Ad esempio, il cervello maschile è più suscettibile al danno neuronale ischemico da ictus o arresto cardiaco seguito da rianimazione (rivisto in6). Il morbo di Parkinson (rivisto in7) e la schizofrenia (rivisto in8) sono più comuni nei maschi umani che nelle femmine, mentre il cervello umano femminile sembra più suscettibile al morbo di Alzheimer (rivisto in9) e ai disturbi dell'umore come la depressione (rivisto in10). Nonostante le differenze osservabili tra i sessi nella suscettibilità alle lesioni neuronali e alle malattie, la maggior parte degli attuali paradigmi di trattamento non considera il sesso e sono simili sia negli uomini che nelle donne. Si potrebbe ottenere un successo maggiore se si tenesse conto e si comprendessero le differenze di sesso.
I modelli animali in vivo di lesioni e malattie neuronali dimostrano un dimorfismo sessuale simile a quello umano e sono fondamentali per migliorare la nostra comprensione delle differenze sessuali e di come tali differenze contribuiscano alla sopravvivenza e alla funzione neuronale. Le prove hanno dimostrato, ad esempio, che i roditori maschi sono più suscettibili delle femmine al danno neuronale ischemico11-15. Si ritiene che questa differenza dipenda almeno in parte dalla segnalazione molecolare del testosterone, il principale ormone steroideo sessuale maschile, e degli estrogeni, il principale ormone steroideo sessuale femminile. Studi con roditori maschi e femmine gonectomizzati rivelano che il testosterone e il metabolita del testosterone, il diidrotestosterone (DHT) esacerbano e gli estrogeni diminuiscono il danno neuronale dopo ischemia cerebrale12-14,16-18. Tuttavia, le differenze di sesso nell'ischemia cerebrale sono presenti sia negli animali neonati che in quelli adulti19,20. I neonati sperimentano picchi di estrogeni o testosterone in utero durante lo sviluppo, ma hanno livelli relativamente bassi di ormone dopo la nascita fino alla pubertà (rivisto in21). Pertanto, la presenza o l'assenza di ormone sessuale primario non è l'unico fattore determinante della suscettibilità neuronale al danno influenzata dal sesso. In effetti, è probabile che durante lo sviluppo si stabiliscano dimorfismi sessuali che si traducono in differenze nella segnalazione cellulare e nella risposta all'ischemia anche quando i livelli ormonali sono bassi.
Indipendentemente dal fatto che le differenze di sesso dipendano dalla presenza dell'ormone steroideo sessuale o che siano dovute a dimorfismi stabiliti durante lo sviluppo, sta diventando chiaro con ulteriori studi che ci sono differenze nella segnalazione cellulare tra maschi e femmine nel cervello. Nell'Herson Lab della University of Colorado School of Medicine, abbiamo identificato una di queste differenze. Abbiamo scoperto che il canale ionico permeabile al calcio, al sodio e al potassio, TRPM2 (rivisto in22,23), induce la morte delle cellule neuronali a seguito di insulto ischemico in vivo nel topo maschio ma non nella femmina24. Dimostriamo che l'inibizione farmacologica o il knockdown genetico di TRPM2 è protettivo nel topo maschio ma non nella femmina nel nostro modello in vivo di occlusione arteriosa carotidea media (MCAO) di ictus24.
Nonostante la loro utilità, i modelli animali in vivo di danno neuronale ischemico possono, a volte, essere limitati per gli studi molecolari sulla morte neuronale, a causa della difficoltà o dell'incapacità di indirizzare specificamente i neuroni per l'indagine. Per questo motivo, il nostro laboratorio utilizza neuroni corticali o ippocampali primari dissociati in vitro per integrare il nostro lavoro in vivo. Le colture primarie di neuroni dissociati rappresentano uno strumento utile per studiare le vie di segnalazione cellulare coinvolte nel danno neuronale e nella malattia. I neuroni in coltura possono essere mantenuti in un ambiente strettamente controllato, con o senza input gliale. In assenza di glia, tutte le risposte osservate in coltura sono neuronali. Gli agenti farmacologici possono essere somministrati alla coltura senza preoccuparsi dell'assorbimento attraverso la barriera ematoencefalica, consentendo l'inibizione o l'attivazione di componenti specifici di una determinata via di trasduzione del segnale. La biologia molecolare può essere utilizzata per sovraesprimere o abbattere varie proteine di interesse e le misurazioni elettrofisiologiche possono essere condotte su singole cellule, cosa che non sarebbe possibile in un sistema modello in vivo.
Il laboratorio Herson espande l'utilità delle colture neuronali primarie dissociate sessuando prima gli embrioni utilizzati per preparare le colture. Le colture di neuroni stratificati in base al sesso maschile e femminile dimostrano chiaramente che i neuroni maschili sono più suscettibili dei neuroni femminili alla morte delle cellule neuronali in seguito alla privazione di ossigeno e glucosio25. La privazione di ossigeno e glucosio è un modello in vitro accettato di ischemia neuronale poiché l'ischemia riduce la disponibilità di ossigeno e glucosio per il cervello. Inoltre, abbiamo dimostrato con esperimenti elettrofisiologici in neuroni dissociati e stratificati in base al sesso che TRPM2 è attivato nei neuroni maschili ma non in quelli femminili24,26. Attualmente stiamo studiando i regolatori molecolari sesso-specifici dell'attività di TRPM224,26. Qui, condividiamo e discutiamo il nostro protocollo per stabilire colture di neuroni ippocampali embrionali primari dissociati stratificati per sesso e presentiamo dati rappresentativi utilizzando questo metodo che suggeriscono che l'enzima di riparazione del DNA, PARP-1, contribuisce alla morte delle cellule ischemiche in un modo specifico per il sesso simile a TRPM2. PARP-1 è attivato dalla rottura del DNA a causa dello stress ossidativo (rivisto in27,28). Quando il danno al DNA è minimo, l'attività di PARP-1 migliora la sopravvivenza cellulare, ma quando il danno è eccessivo, l'aumento dell'attività di PARP-1 esacerba la morte cellulare. PARP-1 produce poli-(ADP)ribosio, un noto attivatore del canale TRPM228-31, e alcune prove suggeriscono che PARP-1 sia attivato preferenzialmente nel cervello maschile ma non femminile in risposta allo stress ossidativo32,33. Pertanto, ipotizziamo che PARP-1 attivi TRPM2 nel maschio ma non nella femmina, inducendo la morte delle cellule neuronali in risposta alla privazione di ossigeno e glucosio.

<table><tbody><tr><td>Integratore B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borace</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino</td><td>Albumina Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM, senza glutammina, senza rosso fenolo</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal, senza glutammina, senza rosso fenolo</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina, MW 70.000-150.000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ATTREZZATURA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinze angolate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze curve fini</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe seghettata (Londra)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per graefe extra fini 1 x 2 denti</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Moria Strumenti per</td><td>le scienze</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative medie</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione extra fini</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 40 &; M Rete di nylon</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

colture neuronali stratificate per sesso per studiare le vie di morte delle cellule ischemiche

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Le differenze sessuali nella suscettibilità neuronale al danno ischemico e alle malattie neurodegenerative sono state osservate a lungo, ma i meccanismi di segnalazione responsabili di tali differenze rimangono poco chiari. La coltura neuronale embrionale primaria dissociata fornisce un modello sperimentale semplificato con cui studiare la segnalazione delle cellule neuronali coinvolta nella morte cellulare a seguito di ischemia o malattia; Tuttavia, la maggior parte delle colture neuronali utilizzate oggi nella ricerca sono di sesso misto. I ricercatori possono testare gli effetti del trattamento con steroidi sessuali in colture neuronali di sesso misto in modelli di lesioni e malattie neuronali, ma l'accumulo di prove suggerisce che il cervello femminile risponde agli androgeni, agli estrogeni e al progesterone in modo diverso rispetto al cervello maschile. Inoltre, i neonati maschi e femmine di roditori rispondono in modo diverso al danno ischemico, con i maschi che subiscono un danno maggiore a seguito di ischemia cerebrale rispetto alle femmine. Pertanto, le colture neuronali di sesso misto potrebbero oscurare e confondere i risultati sperimentali; Le informazioni importanti potrebbero essere perse. Per questo motivo, l'Herson Lab presso la University of Colorado School of Medicine prepara regolarmente colture neuronali embrionali primarie dissociate stratificate per sesso sia dall'ippocampo che dalla corteccia. Gli embrioni vengono sessuati prima della raccolta del tessuto cerebrale e il tessuto maschile e femminile vengono dissociati separatamente, piastrati separatamente e mantenuti separati. Utilizzando questo metodo, l'Herson Lab ha dimostrato un ruolo specifico per gli uomini del canale ionico TRPM2 nella morte cellulare ischemica. In questo manoscritto, condividiamo e discutiamo il nostro protocollo per il sessaggio di topi embrionali e la preparazione di colture di neuroni primari dissociati ippocampali stratificati in base al sesso. Questo metodo può essere adattato per preparare colture corticali stratificate in base al sesso e il metodo per il sessaggio dell'embrione può essere utilizzato in combinazione con altri protocolli per qualsiasi studio in cui si ritiene che il sesso sia un importante determinante dell'esito.

La corretta determinazione del sesso nei topi embrionali è un passaggio fondamentale nella preparazione di colture primarie di neuroni stratificate per sesso. Per assicurare che gli ippocampi maschili e femminili fossero coltivati separatamente da embrioni correttamente sessuati, gli embrioni sono stati divisi in base al sesso e i loro cervello e ippocampo sono stati isolati. L'acido desossiribonucleico genomico è stato estratto dal tessuto raccolto da ciascun embrione seguendo procedure standard, avendo cura di mantener...

Le colture neuronali dell'ippocampo embrionale primario dissociate sono utili per studiare i meccanismi di segnalazione coinvolti nella morte dei neuroni. Il sessaggio degli embrioni prima dell'isolamento e della dissociazione dell'ippocampo consente la preparazione di colture maschili e femminili separate, che consentono al ricercatore di identificare e studiare la segnalazione cellulare sesso-specifica.

Colture neuronali stratificate per sesso per studiare le vie di morte delle cellule ischemiche

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture primarie di neuroni dissociati ippocampali stratificate per sesso. Il primo passo della procedura consiste nel determinare il sesso ed eseguire la dissezione degli embrioni al diciottesimo giorno embrionale, al fine di ottenere colture primarie di neuroni stratificate per sesso. Il passo successivo è preparare i neuroni associati a partire dal tessuto neuronale.L'ultimo passaggio consiste nel seminare i neuroni alla densità appropriata e coltivarli per l'esperimento. In definitiva, questo metodo, utilizzato in combinazione con altri protocolli, può essere impiegato in qualsiasi studio in cui si ritenga che il sesso sia un determinante importante dell'esito. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul genere, come ad esempio se i roditori maschi e femmine rispondano in modo diverso all'ischemia neuronale. Tra le diverse preparazioni necessarie, alcune meritano particolare attenzione, come ad esempio le piastre per colture cellulari.Preparare una soluzione diluita di poli-D-lisina a 0,1 milligrammi per millilitro. Quindi, all'interno di una cappa a flusso laminare per coltur

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Colture neuronali stratificate per sesso per studiare i percorsi di morte cellulare ischemica

Questo video dimostra la tecnica di valutazione della morte neuronale in fette organotipiche di corteccia rinale-ippocampo. La morte neuronale si verifica attraverso crisi epilettiche in evoluzione, simili all'epilessia in vivo, e viene rilevata attraverso la doppia colorazione delle cellule morte utilizzando ioduro di propidio e immunofluorescenza.

Saggio di morte neuronale per valutare la morte cellulare in un modello di epilessia ex vivo

Questo video dimostra una tecnica ex vivo per indurre la morte delle cellule cerebrali mediata da cellule T CD8+ citotossiche. Dopo aver ottenuto le fette di cervello, le cellule T CD8+ attivate dirette verso gli oligodendrociti vengono trasferite sulle fette per colpire la guaina mielinica e gli oligodendrociti. Dopo l'incubazione, il danno alla mielina e la morte neuronale possono essere valutati istologicamente nelle regioni di interesse.

Una tecnica ex vivo per indurre la morte neuronale tramite cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti

Occlusione carotidea bilaterale accoppiato con ipotensione sistemica produce ischemia cerebrale globale nel ratto, con conseguenti danni al dell'ippocampo con severità riproducibile. Soggetti animali sono compromesse con modelli prevedibili di danni cerebrali, si riprendono speditamente, ed i tassi di mortalità sono relativamente bassi.

2-occlusione di vasi / Ipotensione: un modello di ratto di Global Ischemia cerebrale

Abbiamo sviluppato un modello fetta cervello che può essere usato per esaminare meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata. Questa tecnica genera tessuto cerebrale maturo vitale e riduce il numero di animali necessari per la sperimentazione, pur mantenendo la circuiteria neuronale, interazioni cellulari e compartimenti post-sinaptici in parte intatto.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Questo studio presenta una tecnica per l'isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l'attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età.

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Un metodo efficace per studiare valanghe neuronale, cioè scala-invarianti spazio-temporale scoppia attività, indicativa delle dinamiche condizioni critiche nella corteccia. Valanghe emergere spontaneamente nello sviluppo di strati superficiali della corteccia cerebrale in coltura che permette di misure a lungo termine delle attività con gli array planare integrata multi-elettrodi (MEA), a condizioni ben controllate.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

Scopri come preparare colture neuronali primarie stratificate per sesso da tessuto ippocampale embrionale. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di segnalazione specifici nel neuroni maschi e femmine.

Colture neuronali stratificate per sesso per studiare le vie di morte delle cellule ischemiche

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