Basata-Cell Assay Protocollo per la previsione prognostica della scoliosi idiopatica Uso Cellular dielettrica Spettroscopia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di prevedere la prognosi della scoliosi idiopatica in base al raggruppamento funzionale dei pazienti, esaminando la risposta del loro PBM C all'attivazione di GPCR R utilizzando la spettroscopia dielettrica cellulare. Ciò si ottiene coltivando pbmc in presenza di fitoemoagglutinina o PHA per espandere il numero di cellule. L'espansione delle celle viene completata in un tubo, mantenuto in posizione inclinata.

In una seconda fase, le cellule vengono trattate con OSTEOPONTINA o OPN, che aumenta o riduce l'attività della proteina GI. A seconda dei pazienti dopo il trattamento, la sospensione cellulare viene trasferita nella micropiastra. Successivamente, le cellule vengono stimolate con agonisti GI o GS GPCR per determinare le variazioni di impedenza risultanti.

I risultati forniscono risposte cinetiche per tutti i pozzetti e le risposte integrate vengono quindi quantificate in base alle variazioni di impedenza. L'implicazione di questa tecnica va ben oltre la semplice diagnosi. Quindi, per la prima volta, possiamo rilevare in una fase precoce come pazienti sintomatici a rischio di sviluppare la scoliosi, e ora sapendo chi svilupperà la scoliosi o in quale stadio si trova, possiamo fornire nuove terapie per trattarli.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'esposizione ai raggi X, è che questa tecnica consente di prevedere la scoliosi osteopata progno senza la necessità di misurare il covid e nessun rischio per la salute. La cosa più recente, la tecnica ora sarà la nostra assistente di ricerca Nita Franco, scongelamento di aliquote congelate di cellule mononucleate del sangue periferico in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pipetta sterile, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri contenente 15 millilitri di terreno completo e centrifugare.

Le cellule aspirano il surnatante. Quindi sospendere delicatamente il pellet della cella in un millilitro di terreno PHA, completare il volume a 20 millilitri con lo stesso supporto, tappare il tubo senza stringere per consentire l'ingresso dell'aria. Incubare la provetta per una notte a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per consentire ai linfociti quiescenti di trasformarsi in linfoblasti a rapida proliferazione.

Serrare completamente i tappi e pellettare le celle mediante centrifugazione. Rimuovere il surnatante per aspirazione. Sospendere delicatamente il pellet della cella in un millilitro di terreno completo.

Completare il volume a 20 millilitri con lo stesso terreno e tappare la provetta con una coltura senza stringere la notte per espandere il numero di cellule. Dopo due lavaggi con 10 millilitri di RPMI 1640, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 600 microlitri di RPMI 1640. Misura la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato e un analizzatore di vitalità.

Quindi aggiungere un volume appropriato di RPMI 1640 per regolare una concentrazione cellulare di 1,5 volte 10 alla quinta cellula per 20 microlitri. Trasferire 100 microlitri di sospensione in due provette sterili da 1,5 millilitri. Aggiungere l'osteopontina ricombinante in una provetta fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.

Aggiungere un volume uguale di PBS al secondo tubo. Miscelare delicatamente ogni condizione pipettando due volte utilizzando una pipetta sterile impostata a 100 microlitri. Quindi, aggiungere cinque microlitri di RPMI 1640 a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, centrifugare la piastra a 200 GS per tre minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria e trasferire le celle dalla provetta alla micropiastra.

Pipettare delicatamente su e giù una volta per garantire una sospensione uniforme delle cellule. Seminare 40 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in duplicato quadruplo per cellule non trattate e in duplicato per cellule trattate con ROPN o PBS. Lasciare la piastra cellulare sotto la cappa sterile per cinque minuti per consentire alle cellule di riposare e depositarsi uniformemente sul fondo del pozzetto.

Per ottimizzare l'effetto della coltura OPN, le cellule per 18 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica equilibrano le colture a temperatura ambiente per circa 30 minuti. Nel frattempo, preparare un millilitro di somatostatina 100 micromolare e isoproterenolo in RPMI 1640. Riempire la piastra composta erogando 20 microlitri in appositi pozzetti.

Coprire la piastra composta con un sigillo polimerizzabile. Caricare la piastra, i puntali della pipetta e la piastra composta nel sistema basato su CDS. Assegnare un nome alla targhetta nel software dello strumento basato su CDS.

Andare all'elenco dei protocolli e selezionare il protocollo appropriato per avviare il protocollo. Fare clic su Start. Il sistema fluidico integrato aggiunge contemporaneamente i composti a tutti i pozzi.

Il sistema basato su CDS raccoglie automaticamente i dati per 15 minuti dopo che la vitalità cellulare dell'edizione composta è stata confrontabile tra tutti i campioni con valori coerenti nell'intervallo dell'86 e del 96%. Al contrario, sono state osservate elevate variazioni nel numero di cellule. Tra i campioni dei 32 campioni, due utilizzati avevano un numero insufficiente di cellule e non sono stati classificati. Questo esempio mostra la classificazione funzionale in base al grado di squilibrio tra GI e segnalazione GI.

La valutazione dell'effetto OPN in risposta alla stimolazione gastrointestinale ha rivelato che l'OPN ha aumentato la risposta nei pazienti 353 e 371. Al contrario, la risposta è stata ridotta di oltre il 50% nei pazienti 345 e 382 e di meno del 50% nel paziente 370 dopo il trattamento con ROPN. Quindi, secondo i nostri criteri di classificazione, siamo stati in grado di classificare i pazienti 353 e 371 in FG uno, i pazienti 300 da 45 e 382 in FG due e il paziente 370 in FG tre.

Parallelamente, tutti i pazienti sono stati sottoposti a screening per la loro risposta alla stimolazione proteica gastrointestinale e confrontati con soggetti di controllo. Come previsto, tutti i pazienti sono risultati meno reattivi rispetto ai soggetti di controllo. I pazienti classificati nello stesso gruppo funzionale hanno mostrato livelli simili di risposta massima.

La classificazione di un'ampia coorte di pazienti SC regolarmente seguiti nella nostra clinica speciale presso l'Ospedale San Justine ha rivelato che i tre gruppi funzionali erano distribuiti in modo simile. Tra i casi moderati, il FG 2 era predominante tra i casi gravi. Dopo aver atteso questo video, dovresti avere una buona comprensione di come classificare il paziente in due, tre gruppi funzionali utilizzando la spettroscopia dielettrica cellulare.