Name: Basata-Cell Assay Protocollo per la previsione prognostica della scoliosi idiopatica Uso Cellular dielettrica Spettroscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Scopri un saggio cellulare basato sulla spettroscopia dielettrica cellulare per prevedere la prognosi della scoliosi idiopatica utilizzando PBMC. Questo metodo non invasivo classifica i pazienti in gruppi funzionali.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Parigi, Francia (al Dr. Moreau), la Canadian Institutes of Health Research (Grant PP2-99.466 a Dr. Moreau) e da Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (assegno di ricerca al Dr. Moreau).

L&#39;intera procedura viene eseguita sotto cappa sterile biologico e tutte le soluzioni e le attrezzature che vengono a contatto con le cellule devono essere sterili. 1. Preparazione delle soluzioni Essential <ol><li> Preparare le soluzioni secondo la Tabella 1. </li><li> Mantenere soluzione salina bilanciata (BSS) a temperatura ambiente e tutte le altre soluzioni a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Supporti freddo caldo a 37 ° C nel bagno d&#39;acqua per alcuni minuti prima di utilizzare. </li></ol> 2. Preparazione e conservazione delle PBMC <ol><li> Raccogliere 10 ml di sangue intero in provette per il prelievo trattato con EDTA preparare due aliquote di PBMC con 5 ml per ogni aliquota. </li><li> Trasferire 5 ml di sangue intero dal tubo di raccolta trattato con EDTA ad un tubo 50 ml. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di BSS e mescolare campione delicatamente pipettando su e giù. </li><li> Mettere 3 ml di Ficoll in due provette da 15 ml Falcon. </li><li> Strato con cautela 4,5 mldi miscela diluita sangue sul Ficoll in ogni provetta. </li><li> Lasciate che i tubi riposare per 5 minuti, per favorire una netta separazione del sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno. </li><li> Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga in modo da non disturbare la stratificazione. Le PBMC sono visibili nell&#39;interfaccia BSS / Ficoll. </li><li> Raccogliere lo strato nuvoloso di PBMC all&#39;interfaccia di entrambi i tubi con una pipetta e trasferire in un tubo da 50 ml. </li><li> Aggiungere 20 ml di supporti completi. </li><li> Centrifugare la provetta a 288 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante tramite aspirazione. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 500 ml di mezzi supplementari. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di un mezzo di congelamento. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad una esageratamente. </li><li> Posizionare il esageratamente in un contenitore cryofreezing con isopropanolo. </li><li> Conservare il contenitore congelamento a -80 ° C per una notte. </li><li> Transfer le PBMC congelati aliquota di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 3. Saggio funzionale 1. Giorno 1 <ol><li> Posizionare aliquota da azoto liquido a bagnomaria a 37 ° C per un minuto o fino a scongelamento. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml con una pipetta sterile. </li><li> Aggiungere 15 ml di mezzo completo e centrifugare le cellule giù a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante tramite aspirazione. </li><li> Sospendere delicatamente pellet di cellule in 1 ml di PHA media. </li><li> Completare il volume a 20 ml con lo stesso supporto. </li><li> Chiudere la provetta liberamente per permettere all&#39;aria di entrare. </li><li> Lasciare il tubo notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 per consentire linfociti quiescenti a trasformarsi in linfociti rapidamente proliferanti. </li></ol> 2. Day 2 <ol><li> Prendete il tubo fuori dell&#39;incubatore, avvitare i tappi completamente e girare le celle in basso a 200 xg per 5 mina temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante tramite aspirazione. </li><li> Sospendere delicatamente pellet di cellule in 1 ml di mezzo completo. </li><li> Completare il volume a 20 ml con lo stesso supporto. </li><li> Chiudere la provetta liberamente per permettere all&#39;aria di entrare. </li><li> Lasciare il tubo notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 per espandere il numero di cellule. </li></ol> 3. Day 3 <ol><li> Prendi il tubo fuori dell&#39;incubatore, avvitare i tappi completamente e girare le celle in basso a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante tramite aspirazione. </li><li> Lavare le cellule due volte con 10 ml di RPMI-1640 mediante centrifugazione a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 600 ml di RPMI-1640. </li><li> Misurare la concentrazione e la vitalità cellulare, utilizzando un contatore di cellule automatizzata e analizzatore di vitalità. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di RPMI-1640 per regolare a una concentrazione cellulare di 1,5 x 10 5 cells/20 microlitri. </li&gt; <li> Trattamento di cellule con ricombinante OPN (rOPN) o veicolo (PBS) in 1,5 ml di provette Eppendorf. <ol><li> Trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare per due sterili 1,5 ml provette Eppendorf. </li><li> Aggiungere rOPN in un tubo ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml. </li><li> Aggiungere un volume uguale di PBS nel secondo tubo. </li><li> Mescolare delicatamente ciascuna condizione pipettando su e giù due volte utilizzando un set pipetta sterile a 100 microlitri. </li></ol></li><li> Preparare il piccolo campione 96 pozzetti micropiastra. <ol><li> Aggiungere 5 ml di RPMI-1640 in ciascun pozzetto. </li><li> Centrifugare la piastra a 200 xg per 3 minuti per eliminare eventuali bolle d&#39;aria. </li></ol></li><li> Seed le cellule non trattate e cellule trattate con rOPN o PBS. <ol><li> Prima di trasferire le cellule dal tubo di micropiastra, delicatamente pipetta su e giù contemporaneamente per garantire una sospensione uniforme di cellule. </li><li> Aggiungere 40 ml di sospensione cellulare per pozzetto in quadruplice copia di cellule non trattate, in duplice copia per rOPN o PBS trattati cellule. Refer alla figura 1 per la progettazione. Questo design permette 12 pazienti da testare sulla stessa micropiastra. </li><li> Lasciare la piastra di cella sotto la cappa sterile per 5 minuti per permettere alle cellule di riposo e si depositano uniformemente sul fondo del pozzo prima di mettere in incubatrice. </li></ol></li><li> Incubare la piastra per 18 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 per ottimizzare l&#39;effetto di OPN. </li></ol> 4. Giorno 4 <ol><li> Eseguire il piatto con composti. <ol><li> Prendete il piatto fuori dell&#39;incubatore e lasciarlo a temperatura ambiente per circa 30 min. </li><li> Preparare 1 ml di 100 mM di somatostatina e isoproterenolo in RPMI-1640 con l&#39;aggiunta di 10 ml di soluzione madre (10 mM) in 990 ml di RPMI-1640. </li><li> Riempire il piatto composto da erogare 20 microlitri di pozzetti appropriati, come indicato nella figura 2. </li><li> Coprire il piatto composto con un sigillo pretagliati perforabile per evitare cambiamenti nella concentrazione del composto a causa dell&#39;evaporazione primao durante l&#39;incubazione nel sistema basato CDS. </li><li> Piatto di carico delle cellule, puntali per pipette, e la piastra composti nel sistema basato su CDS. </li><li> Assegnare un nome al piatto nel software dello strumento basato su CDS. </li><li> Selezionare il protocollo appropriato. Il protocollo modificato per la classificazione con PBMC si chiama &quot;cellule agonista non-aderenti piccola piastra Esempio RT 15 min. Vai alla casella di protocollo e selezionare questo protocollo nella lista dei protocolli </li><li> Avviare il protocollo cliccando su &#39;Start&#39;. </li><li> Il sistema fluidico integrato aggiunge simultaneamente i composti a tutti i pozzetti iniettando 5 microlitri per pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 10 mM in un volume totale di 50 microlitri. </li><li> Il sistema basato su CDS raccoglie automaticamente i dati per 15 minuti dopo l&#39;aggiunta composto. </li></ol></li><li> Analisi dei dati <ol><li> Selezionare basse e alte gamme di frequenze da utilizzare per il calcolo dei valori estratti per la noncellule aderenti. </li><li> Selezionare correzione della deriva per correggere la variazione lineare misurazioni dell&#39;impedenza di base nel tempo. </li><li> Selezionare il filtraggio dei dati per ridurre le variazioni nella misurazione della risposta cinetica a causa del rumore elettronico e aggiunta del composto. </li><li> Selezionare il metodo Max-Min per il tempo di analisi pieno. </li><li> Esportare dati in Excel sotto l&#39;opzione di formattazione piastra. </li><li> Calcolo delta G (ΔG) sottraendo la media di risposta in ampiezza a Gi stimolazione (RmGi) dalla media di risposta in ampiezza a Gs stimolazione (RMG) utilizzando la seguente formula: ΔG = RmGi - RMG </li><li> Calcolare la percentuale dell&#39;effetto piega (Fe) di OPN sulla risposta Gi-mediata dividendo la media di risposta in ampiezza alla stimolazione Gi in presenza di OPN (RmGiOPN) con la media di risposta in ampiezza di Gi stimolazione in presenza di PBS ( RmGiPBS) mediante la seguente formula: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Fare riferimento a Tgrado 2 per classificare i pazienti. </li></ol></li></ol>

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Questo lavoro ha portato a numerosi brevetti tenere da Sainte-Justine University Hospital e molti altri sono in corso in diversi paesi. Fourth Dimension Spine LLC è il licenziatario esclusivo del Sainte-Justine University Hospital.

Abbiamo descritto una procedura dettagliata di un test a base di cellule prognostico per la scoliosi idiopatica che è applicabile alle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di fresco isolato o conservati congelati per un massimo di un anno in azoto liquido. Dato che l&#39;utilizzo PBMC appena isolate è ingombrante quando si verifica gran numero di individui, il procedimento è stato presentato con PBMC congelati che offrono un&#39;alternativa più pratica in ambito clinico. Tuttavia, i problemi con aggregazione delle cellule dopo lo scongelamento sono stati riscontrati quando PBMC congelati sono stati inizialmente utilizzati, portando talvolta alla variabilità inter-analisi. Per massimizzare la riproducibilità, si consiglia di evitare il ciclo gelo-disgelo e con il campione congelato una sola volta. La procedura è molto semplice, consente il rilevamento accurato di difettoso funzione della proteina Gi in breve tempo. Utilizzando questa procedura, bambini asintomatici e scoliotiche possono essere facilmente classificati per prevedere meglio il loro esito clinico, senza alcun pericolo per la loro salute. HoWever, quando si esegue la classificazione secondo il grado di massima risposta alla stimolazione Gi rispetto ai soggetti sani di controllo 12, diversi requisiti per i soggetti di controllo dovrebbe essere raggiunto. Infatti, al fine di avere un confronto corretto coorte, i soggetti di controllo devono essere di età e per sesso, non essere su qualsiasi tipo di farmaco, e di fornire informazioni private, come la storia passata individuale / familiare medica. Tali requisiti possono costituire un ostacolo importante per l&#39;assunzione di soggetti di controllo. Pertanto, eseguendo classificazione esaminando il grado di squilibrio tra la risposta a Gi e Gs proteina stimolazione nello stesso individuo è ideale per eliminare la necessità di usare soggetti di controllo. L&#39;utilizzo del sistema basato CDS effettuare questo test prognostico è significativo in termini di fornire contemporaneamente Gi-e risposte cellulari Gs-mediate nello stesso dosaggio. Sebbene molti pazienti possono essere classificati senza amambiguità utilizzando la gamma dinamica fissa per questo saggio, un piccolo numero di pazienti esporrà valori al confine di intervalli, come dimostrano i risultati della presente relazione. Per discriminare questi individui, abbiamo introdotto la valutazione dell&#39;effetto di OPN sulla risposta alla stimolazione Gi dimostrando che OPN induce un effetto differenziale sulla risposta cellulare Gi-mediata tra i tre gruppi funzionali. Infatti, abbiamo trovato che in presenza di OPN, risposta alla stimolazione Gi aumenti FG1, mentre diminuisce in FG2 e FG3, in misura superiore a FG2. Nonostante l&#39;elevato costo di OPN, l&#39;uso di questa chemochina è essenziale distinguere casi ambigui, e quindi migliorare la precisione della nostra analisi classificazione. Tuttavia, questo test ha uno svantaggio che un minimo di 1,5 x 10 5 cellule per pozzetto è tenuta a rispettare risposta cellulare con il sistema basato su CDS nelle nostre condizioni sperimentali. Alcuni campioni di pazienti non avranno un numero sufficiente dicellule da testare. In questo caso, è necessario ricordare i pazienti per la raccolta del sangue aggiuntivo, che può essere preoccupante per le famiglie e frustrante per il personale medico e di laboratorio. Studi prospettici sono previsti nel nostro laboratorio per risolvere questo problema. Tuttavia, l&#39;attuale protocollo si basa su metodi semplici e collaudati per preparare le cellule, mentre il test è automatizzato mediante un sistema privo di etichetta convalidati 13, 14 per monitorare le risposte delle cellule. La piattaforma di prova è relativamente poco costoso se confrontato con piattaforma genetica disponibile per la prognosi di altre malattie. Inoltre, il costo di tutti i materiali monouso, compresi i tubi di raccolta del sangue, punte, l&#39;elettrodo speciale micropiastre, e conica e tubi Eppendorf, non è molto costoso ed è stimato a meno di $ 3.000 a completare un test per circa mille pazienti. Sebbene questa stima non include i costi di manodopera per la preparazione dei campionie di eseguire il test, questo test rimane molto più conveniente rispetto alle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione. Degno di nota, non è solo il confronto dei costi di piattaforme genetiche, ma più specificamente legate al campo della AIS, è i costi associati alle immagini radiologiche. Oggi, più di un milione di bambini negli Stati Uniti e circa 100.000 bambini in Canada con diagnosi di scoliosi idiopatica, e il costo totale della diagnosi e monitoraggio dei bambini scoliotici in caso di esposizione ai raggi X è di oltre 2,5 miliardi di dollari ogni anno in Nord America. Quindi, la nostra procedura di analisi cell-based ci si aspetterebbe di essere adatto per lo screening e il monitoraggio dei bambini con scoliosi idiopatica senza rischi per la salute e ad un costo più basso di routine.

Scoliosi idiopatica è una deformità della colonna vertebrale di causa sconosciuta generalmente definita come una curvatura laterale superiore a 10 gradi, accompagnati da una rotazione vertebrale 1. La condizione colpisce il 4% della popolazione pediatrica ed è più comunemente diagnosticata tra i 9 ei 13 anni tra 2,3,4. La diagnosi è principalmente di esclusione e viene effettuato solo dopo escludere altre cause di deformità della colonna vertebrale come la malformazione vertebrale, neuromuscolare o disturbi sindromici. Tradizionalmente, l&#39;asimmetria trunkal è rivelato da Adams prova di piegarsi in avanti e misurato con Scoliometer durante l&#39;esame fisico 5. La diagnosi può essere confermata dalla osservazione radiografica della curva e la misurazione dell&#39;angolo utilizzando il metodo di Cobb 6. Una volta diagnosticata, la principale preoccupazione per i medici nella gestione dei bambini scoliotici è se la curva progredirà. Infatti, la progressione della curva è spesso imprevedibile eè più frequentemente osservata tra le ragazze che nei ragazzi 7. Se non trattata, la curva può progredire notevolmente, creando notevole deformità fisica e anche problemi cardiopolmonari. Queste manifestazioni diventano pericolo di vita quando la curva supera i 70 ° 8,9. Le attuali opzioni di trattamento per prevenire o fermare la progressione della curva sono rinforzi e chirurgia. In generale, rinforzo è raccomandato per le curve tra i 25-40 °, mentre la chirurgia è riservata per le curve superiori a 45 ° o che non rispondono a rinforzo. Approssimativamente, il 10% dei bambini con diagnosi di scoliosi idiopatica hanno progressione della curva richiedono un intervento chirurgico correttivo 10. Attualmente, non esiste un metodo provato o prova disponibili per identificare questa categoria di pazienti. Di conseguenza, tutti i bambini diagnosticati sono sottoposti a più radiografie per diversi anni, di solito fino a raggiungere la maturità scheletrica. Si stima che i pazienti tipici con scoliosi avrannocirca 22 esami radiologici a una durata di 3 anni 11. A causa del potenziale rischio di molteplici esami radiografici, gli approcci alternativi che potrebbe consentire di eseguire la prognosi della scoliosi idiopatica senza esporre i bambini alle radiazioni ionizzanti sono fortemente auspicabile. Con l&#39;intento di soddisfare tale esigenza, abbiamo precedentemente sviluppato un saggio di screening basato a cella come test prognostico per identificare presto i bambini asintomatici a rischio di sviluppare scoliosi idiopatica. Il test prevede l&#39;esito clinico in bambini asintomatici e affetti da esaminare lo stato funzionale delle proteine ​​Gi e classificare i bambini in tre gruppi funzionali (FG1, FG2 e FG3) secondo il grado di massima risposta alle proteine ​​Gi stimolazione 12 come misurato da CDS sistema basato. Questo sistema è ampiamente utilizzato per valutare la trasduzione del segnale tramite proteine ​​G in vari tipi cellulari 13,14,15,16. Si produce informazioni riguardanti larisposta totale integrata delle cellule agli stimoli esterni misurando variazioni di impedenza in seguito all&#39;attivazione dei recettori della superficie cellulare. Le cellule vengono seminate in micropiastre che contengono elettrodi al fondo dei pozzetti e il sistema applica una piccola tensione che inducono correnti extracellulari e transcellulare. Dopo iniezione composto nel pozzo, recettori della superficie cellulare sono stimolati e si verificano eventi di trasduzione del segnale, portando a cambiamenti cellulari che influenzano il flusso delle correnti extracellulari e transcellulare, e influenzano così la grandezza misurata. Con questo approccio, i pazienti scoliotici ei bambini più a rischio di sviluppare scoliosi sono meno sensibili alla stimolazione della proteina Gi se confrontato con soggetti sani di controllo, e la classificazione si basa sulla percentuale di grado di riduzione rispetto al gruppo di controllo. Le gamme di classificazione sono fissate tra il 10 e il 40% per FG3, 40 e 60% ​​per FG2, e 60 e 90% per FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Più di recente, abbiamo modificato questo approccio, dimostrando che i tre gruppi funzionali possono essere chiaramente distinti in base al profilo di squilibrio tra la risposta alla stimolazione Gi e Gs. Infatti, abbiamo scoperto che la risposta alla stimolazione Gi predominava in FG3, mentre nessun squilibrio apparente è stata osservata in FG2. Al contrario, FG1 esposto predominanza per la risposta alla stimolazione Gs. Inoltre, abbiamo fornito la prova che i pazienti appartenenti a FG2 sono più a rischio di progressione fino al punto di aver bisogno di un intervento chirurgico 17. La precisione di questo test classificazione è stata ulteriormente migliorata, dimostrando un effetto differenziale di osteopontina (OPN) sulla risposta a stimolazione Gi tra gruppi funzionali. Qui documentiamo la procedura dettagliata di procedure sperimentali e di analisi di questo test funzionale, come attualmente svolto nel nostro laboratorio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent, Inc</td><td>350-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Therno Scientific Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fitoemoagglutinina</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>Osteopontina umana ricombinante</td><td>R& D Systems, Inc</td><td>1433-OP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Somatostatina</td><td>Tocris</td><td>1157</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenolo</td><td>Tocris</td><td>1743</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent, Inc</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette sterili</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-06-451</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf sterili</td><td>Ultident</td><td>24-MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml coniche tubi</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey piccolo campione 96W micropiastra</td><td>Molecular Devices</td><td>1026496</td><td></td></tr><tr><td>Punte Cellkey</td><td>Cybio</td><td>OL3800-25-559N</td><td></td></tr><tr><td>Sigilli perforabili pretagliati</td><td>Excel Scientific, Inc</td><td>XP-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vicell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>Contatore di cellule automatizzato</td></tr><tr><td>Cappa per colture cellulari</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td>Classe II</td></tr><tr><td>Stoccaggio di azoto liquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY5093570</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR International</td><td>89032-204</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico standard</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Thermo Scientific</td><td>51019557</td><td>5% CO2 a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa velocità</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004364</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Cellkey</td><td>Molecular Devices</td><td>1019185</td><td>Strumento basato su CDS</td></tr></tbody></table>

basata-cell assay protocollo per la previsione prognostica della scoliosi idiopatica uso cellular dielettrica spettroscopia

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Dettagli Questo protocollo sperimentale e la procedura analitica per un saggio basato su cellule sviluppato nel nostro laboratorio come test funzionale per predire la prognosi di scoliosi idiopatica nei bambini asintomatici e affetti. Il test consiste nella valutazione dello stato funzionale di Gi e Gs proteine ​​nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) mediante spettroscopia dielettrica cellulare (CDS), utilizzando uno strumento basato CDS automatizzato, e la classificazione dei bambini in tre gruppi funzionali (FG1 , FG2, FG3) rispetto al profilo di squilibrio tra il grado di risposta a Gi e Gs stimolazione proteine. La classificazione è ulteriormente confermata dalla effetto differenziale di osteopontina (OPN) sulla risposta alla stimolazione Gi tra i gruppi e la grave progressione della malattia è referenziato da FG2. Approssimativamente, un volume di 10 ml di sangue è necessario per estrarre PBMC dal gradiente Ficoll-e le cellule vengono quindi memorizzati in azoto liquido. Il numero adeguato di PBMC per eseguire il test si ottiene dopo due giorni di coltura cellulare. In sostanza, le cellule vengono incubate con phytohemmaglutinin (PHA). Dopo 24 h di incubazione, il mezzo viene sostituito con un mezzo di coltura privo di PHA per altre 24 ore prima della semina delle cellule e trattamento OPN. Le cellule sono poi spettroscopica a screening per le loro risposte a somatostatina e isoproterenolo, che attivano rispettivamente le proteine ​​Gi e Gs attraverso i loro recettori affini. Sia la somatostatina e isoproterenolo vengono contemporaneamente iniettati con un sistema integrato di fluidica e le risposte delle cellule vengono monitorati per 15 min. Il test può essere eseguita con PBMC freschi o surgelati e la procedura è completata entro 4 giorni.

La vitalità cellulare era simile in tutti i campioni con valori costanti nell&#39;intervallo 86 e 96%. Al contrario, ad ampie variazioni sono state notate in numero di cellule tra campioni (Tabella 3). Dei 32 campioni utilizzati, due avevano numero insufficiente di cellule e non sono stati classificati. Un esempio dei risultati della classificazione funzionale secondo il grado di squilibrio tra Gi e segnalazione Gs è mostrato in Figura 3. L&#39;asse verticale di questa figura è divisa in tre sezioni che delineano i gruppi funzionali con gamme dinamiche accertati&gt; +10 per FG3, tra +10 e -10 per FG2, e infine &lt;-10 per FG1. Tra i 30 pazienti qui testati, 14, 6, e 5 pazienti erano chiaramente classificati in FG3, FG2, e FG1, rispettivamente, mentre cinque pazienti, in particolare 345, 353, 370, 371, e 382, ​​sono stati al confine di intervalli. La valutazione dell&#39;effetto OPN sulla risposta alla stimolazione Gi aveva rivelato che OPN aumentato la risposta in pa353 pazienti e 371. Al contrario, la risposta è stata ridotta di oltre il 50% in pazienti 345 e 382 e da meno del 50% in 370 pazienti dopo il trattamento rOPN. Quindi, secondo i nostri criteri di classificazione (Tabella 2), siamo stati in grado di classificare i pazienti 353 e 371 in FG1, 345 pazienti e 382 in FG2, e paziente 370 in FG3. In parallelo, tutti i pazienti sono stati sottoposti a screening per la loro risposta alla stimolazione proteine ​​Gi e confrontati ai soggetti di controllo. Come previsto, tutti i pazienti erano meno sensibili di quelli soggetti di controllo e pazienti classificati nello stesso gruppo funzionale dalla nostra nuova procedura esibito livelli analoghi di risposta massima (Figura 5). Inoltre, la disparità tra i pazienti di ciascun gruppo funzionale era coerente con la nostra gamma classica della classificazione 12, convalidando la nuova procedura. La classificazione di una grande coorte di pazienti scoliotici regolarmente seguiti nella nostra clinica speciale a Sainte-Justine Hospital ha rivelato che i tregruppi funzionali erano analogamente distribuiti tra casi moderati, mentre il FG2 era predominante tra casi gravi (Figura 6), identificare pazienti catalogati in questo gruppo funzionale come più a rischio di grave progressione della malattia e indicando che questa prova di classificazione può essere utile nel prognosi della scoliosi idiopatica. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Soluzione A </td><td> Anidro D-glucosio </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0,05 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mm </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mm </td></tr><tr><td> Soluzione B </td><td> NaCl </td><td> 140 mm </td></tr><tr><td rowspan="2"> Soluzione salina bilanciata (BSS) </td><td> Soluzione A </td><td> 1 volume </td></tr><tr><td> Soluzione B </td><td> 9 del volume </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; supporti Complete </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Mezzi supplementari </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Congelamento dei media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Mezzi di PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohemaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Essentialsoluzioni. <table border="1"><tbody><tr><td> Gamme dinamiche con ΔG </td><td> Gruppi funzionali </td><td> Gamme dinamiche con Fe </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> ΔG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Categorizzazione di gruppi funzionali in base alle gamme dinamiche instaurate con ΔG e Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Pazienti </td><td> Redditività (%) </td><td> Concentrazione cellulare (x 10 6 / ml) </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> Numero insufficiente di cellule </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> Numero insufficiente di cellule </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Redditività per cento e la concentrazione cellulare come determinato utilizzando un contatore automatico cella e analizzatore di vitalità. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figura 1. Disegno per la semina delle cellule. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figura 2.Progettare per l&#39;erogazione di composti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figura 3. Gamma dinamica della classificazione funzionale utilizzando il sistema basato CDS. Il grafico illustra i valori del grado di squilibrio tra risposte a Gi e Gs stimolazione ottenuto in PBMC di pazienti affetti da scoliosi idiopatica. I valori sono stati misurati mediante il sistema basato CDS in risposta a 10 mM di somatostatina e isoproterenolo. Ogni punto rappresenta la ΔG di entrambe le risposte in duplicato. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figura 4. Effetto di rOPN sulla risposta alla stimolazione Gi in PBMC. Le cellule sono state siero a digiuno per 18 ore in presenza o assenza di 0,5 mg / ml rOPN quindi stimolate con 10<html> 56; M di somatostatina di avviare risposta cellulare Gi-mediata. I dati nel grafico sono stati generati dalla impedenza minima o massima e corrispondono alla media di risposta in duplicato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figura 5. Stato funzionale della proteina Gi in PBMC di controllo e soggetti scoliostic. PBMC di soggetti di controllo e pazienti scoliotici sono stati esposti a concentrazioni crescenti di somatostatina per stimolare proteine ​​Gi via recettore della somatostatina endogeno. La risposta cellulare è stata misurata mediante sistemi basati su CDS come descritto nella sezione procedura. Curve sono stati generati da impedenza minima o massima. Ogni curva rappresenta la regressione non lineare. I dati sono stati normalizzati alla massima risposta in cellule di soggetti di controllo e ciascun punto corrisponde alla media di risposta in duplicato./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figura 6. Distribuzione dei gruppi funzionali tra le diverse fasi di scoliosi. Una grande coorte di pazienti scoliotici con 794 moderati (curvature tra 10-44 °) e 162 gravi (curvatura maggiore di 45 °) i casi regolarmente seguiti a Sainte-Justine Hospital, sono stati classificati in base al loro grado di squilibrio tra la risposta a Gi e Gs stimolazione. Le risposte sono state misurate con il sistema basato CDS in risposta a 10 mM di somatostatina e isoproterenolo.

Un protocollo strutturato è presentato per un saggio basato su cellule come un test funzionale per predire la prognosi di scoliosi idiopatica utilizzando la spettroscopia dielettrica cellulare (CDS). L&#39;analisi può essere eseguita con cellule fresche o congelate mononucleate del sangue periferico (PBMC) e la procedura è completata entro 4 giorni.

Basata-Cell Assay Protocollo per la previsione prognostica della scoliosi idiopatica Uso Cellular dielettrica Spettroscopia

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è prevedere la prognosi della scoliosi idiopatica in base al raggruppamento funzionale dei pazienti, analizzando la risposta dei PBMC all'attivazione del recettore GPCR R mediante spettroscopia dielettrica cellulare. Questo viene ottenuto coltivando i PBMC in presenza di fitoemoagglutinina o PHA per aumentare il numero cellulare. L'espansione cellulare viene completata in un tubo mantenuto in posizione inclinata.Come secondo passaggio, le cellule vengono trattate con OSTEOPONTINA o OPN, che aumenta o riduce l'attività della proteina GI. A seconda dei pazienti dopo il trattamento, la sospensione cellulare viene trasferita nella micropiastra. Successivamente, le cellule vengono stimolate con agonisti GI o GS del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) per determinare le variazioni di impedenza risultanti.I risultati forniscono risposte cinetiche per tutti i pozzetti e le risposte integrate vengono quindi quantificate in base ai cambiamenti di impedenza. Le implicazioni di questa tecnica vanno ben oltre una semplice diagnosi. Per la prima volta, infatti, possiamo individuare in una fase precoce i pazienti sintomatici a rischio di sviluppare scoliosi, e ora che sappiamo chi svilupperà la scoliosi o in quale stadio si trova, possiamo fornire nuove terapie per trattarli.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'esposizione a raggi X è che consente di prevedere la prognosi dell'osteopatia da scoliosi senza la necessità di misurare il covid e senza alcun rischio per la salute. La novità più recente è che la tecnica ora sarà gestita dalla nostra assistente di ricerca Nita Franco, scongelamento di un'aliquote congelata di cellule mononucleate del sangue periferico in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Trasferire, utilizzando una pipetta sterile, la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri contenente 15 millilitri di terreno completo e centrifugare.Le cellule aspirano il sopranatante. Quindi sospendere delicatamente il pellet cellulare in un millilitro di mezzo PHA e portare il volume a 20 millilitri con lo stesso mezzo, chiudendo il tubo in modo lento per permettere l'ingresso dell'aria. Incubare il tubo tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore a anidride carbonica, in modo che i linfociti quiescenti si trasformino in linfoblasti in rapida proliferazione.Chiudere completamente i tappi ed effettuare la centrifugazione per raccogliere le cellule in pellet. Rimuovere il soprannatante per aspirazione. Sospendere delicatamente il pellet cellulare in un millilitro di terreno completo.Portare il volume a 20 millilitri con lo stesso mezzo e chiudere il tubo in modo non ermetico. Coltivare durante la notte per espandere il numero di cellule. Dopo due lavaggi con 10 millilitri di RPMI 1640, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 600 microlitri di RPMI 1640. Misurare la concentrazione cellulare e la vitalità mediante un contatore cellulare automatico e un analizzatore di vitalità.Quindi aggiungere un volume appropriato di RPMI 1640 per aggiustare la concentrazione cellulare a 1,5 volte 10 alla quinta cellule per 20 microlitri. Trasferire 100 microlitri della sospensione in due provette sterili da 1,5 millilitro con chiusura a vite. Aggiungere l'osteopontina ricombinante in una provetta fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.Aggiungere un volume uguale di PBS al secondo tubo. Mescolare delicatamente ogni condizione aspirando e dispensando due volte con una pipetta sterile regolata a 100 microlitri. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di RPMI 1640 in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti; centrifugare la piastra a 200 ×g per tre minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria ed effettuare il trasferimento delle cellule dal tubo alla microplaca.Pipettare delicatamente su e gi&ugrave; una volta per assicurare una sospensione uniforme delle cellule. Seminare 40 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in quadruplicato per le cellule non trattate e in duplicato per le cellule trattate con ROPN o PBS. Lasciare la piastra cellulare sotto la cappa sterile per cinque minuti, in modo che le cellule si riposino e si depositino uniformemente sul fondo del pozzetto.Per ottimizzare l'effetto della coltura con OPN, incubare le cellule per 18 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio e portare le colture a temperatura ambiente per circa 30 minuti. Nel frattempo, preparare un millilitro di somatostatina e isoproterenolo da 100 micromolari in RPMI 1640. Riempire la piastra dei composti dispensando 20 microlitri nelle pozzette appropriate.Coprire la piastra dei composti con un sigillo curabile. Caricare le punte della pipetta e la piastra dei composti nel sistema basato su CDS. Assegnare un nome alla piastra nel software dello strumento basato su CDS.Vai all'elenco dei protocolli e seleziona il protocollo appropriato per avviare il procedimento. Clicca su inizia. Il sistema fluidico integrato aggiunge contemporaneamente i composti in tutti i pozzetti.Il sistema basato sul CDS raccoglie automaticamente i dati per 15 minuti dopo l'aggiunta del composto; la vitalità cellulare era comparabile tra tutti i campioni, con valori compresi nell'intervallo tra l'86 e il 96%. Al contrario, si sono osservate elevate variazioni nel numero di cellule. Tra i 32 campioni analizzati, due presentavano un numero insufficiente di cellule e non sono stati classificati. Questo esempio mostra la classificazione funzionale in base al grado di squilibrio tra segnalazione GI e GI.La valutazione dell'effetto dell'OPN in risposta alla stimolazione GI aveva rivelato che l'OPN aumentava la risposta nei pazienti 353 e 371. Al contrario, la risposta era ridotta di oltre il 50% nei pazienti 345 e 382 e di meno del 50% nel paziente 370 dopo il trattamento con ROPN. Pertanto, secondo i nostri criteri di classificazione, siamo stati in grado di assegnare i pazienti 353 e 371 al gruppo FG uno, i pazienti 345 e 382 al gruppo FG due e il paziente 370 al gruppo FG tre.In parallelo, tutti i pazienti sono stati sottoposti a screening per valutare la risposta alla stimolazione con proteine GI e confrontati con soggetti di controllo. Come previsto, tutti i pazienti erano meno reattivi rispetto ai soggetti di controllo. I pazienti classificati nello stesso gruppo funzionale hanno mostrato livelli simili di risposta massima.La classificazione di un'ampia coorte di pazienti affetti da SC, regolarmente seguiti nella nostra clinica specializzata presso l'Ospedale San Justine, ha rivelato che i tre gruppi funzionali erano distribuiti in modo simile. Tra i casi moderati, il GF due era predominante nei casi gravi. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come classificare i pazienti in due o tre gruppi funzionali utilizzando la spettroscopia dielettrica cellulare.

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