Name: Recupero dellantigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Scopri il recupero dell'antigene indotto dal calore per visualizzare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta nel tessuto cerebrale di topo. Questo metodo migliora l'identificazione dei marcatori genetici nelle cellule staminali neurali.

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La metodologia è stata originariamente sviluppata nel laboratorio del Dr. Hongjun Song presso l'Istituto di Ingegneria Cellulare, Dipartimento di Neurologia, Johns Hopkins School of Medicine. Questo lavoro è stato finanziato dal NIMH (R00MH090115), dal NARSAD, dal Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund e da un pacchetto iniziale della Mayo Foundation assegnato a M.H.J. e al Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (A3014385) assegnato a W.R.K.

1. Pre-immunoistochimica: perfusione e istologia
<ol>
	<li>Perfondere i topi secondo un protocollo transcardico generale adattato per i topi ed estrarre il cervello in paraformaldeide al 4% (PFA)9.</li>
	<li>Lasciare il cervello in PFA per una notte a 4 °C (ad es. una provetta conica da 10 ml riempita con PFA). Conservare in PFA per almeno 12-24 ore, non più di 36 ore per un fissaggio completo. Dopo il fissaggio notturno, svuotare il PFA dal tubo conico ma lasciare il cervello all'interno. Versare il 30% di saccarosio nel tubo e lavare il cervello per 5 secondi per rimuovere eventuali residui di PFA. Infine, riempire nuovamente il tubo contenente il cervello con il 30% di saccarosio. Conservare il cervello nel saccarosio a 4 °C fino a quando il cervello non affonda sul fondo del tubo.</li>
	<li>Tagliare sezioni cerebrali di 40 μm su un microtomo. Consulta un atlante cerebrale di topo per iniziare a raccogliere sezioni dall'inizio del giro dentato fino alla sua fine. Conservare le sezioni in soluzione antigelo (una ricetta semplice è 300 g di saccarosio in 500 ml di 0,1 M PBS e 300 ml di glicole etilenico) fino al momento dell'immunoistochimica.</li>
	<li>Montare il tessuto tagliato su vetrini da microscopio appositamente progettati per aderire fortemente al tessuto. Questi vetrini forniscono una forte tenuta ai tessuti durante la fase di ebollizione. Dopo aver montato il fazzoletto, lasciare asciugare il vetrino per 10 minuti o fino a quando non è completamente asciutto. L'asciugatura può essere accelerata se il vetrino è appoggiato su una superficie verticale con il bordo inferiore del vetrino su un tovagliolo di carta. Se viene montata più di una guida, le altre guide possono essere lasciate asciutte durante quel periodo (1-2 ore va bene) fino al momento di procedere alla fase successiva.</li>
	<li>Una volta che il vetrino è asciutto, lavare con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna e asciugare nuovamente (tampone PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Ciò garantisce che qualsiasi sostanza chimica precedente (come il glicerolo dalla soluzione di conservazione antigelo) venga rimossa a sufficienza e non possa compromettere l'aderenza del tessuto al vetrino.</li>
</ol>
2. Preparazione dei reagenti e delle attrezzature minori
<ol>
	<li>Preparare la soluzione A (0,1 M o 19,21 g/l di acido citrico) e la soluzione B (0,1 M o 24,9 g/l di citrato trisodico) in cui verranno bollite le sezioni di tessuto.</li>
	<li>In un cilindro graduato, unire 9 ml di Soluzione A e 41 ml di Soluzione B. Aggiungere 450 ml di ddH2O a questa miscela.</li>
	<li>Versare questa miscela in un contenitore vuoto (ad es. una scatola vuota di puntali per pipette) adatto al microonde.</li>
</ol>
3. Recupero dell'antigene indotto dal calore
<ol>
	<li>Far bollire la soluzione preparata al punto 2 per 5 minuti a temperatura standard in un forno a microonde standard. La soluzione inizierà a bollire a una temperatura pari o superiore a 100 °C.</li>
	<li>Una volta completata l'ebollizione, rimuovere con cautela il contenitore dal microonde e posizionare i vetrini secchi al suo interno, assicurandosi che la faccia del vetrino con sezioni ippocampali sia rivolta verso il basso e completamente esposta al liquido. Se possibile, posiziona i vetrini ad angolo contro le pareti della scatola e impila altri vetrini attorno ad essi. Assicurati che la loro "adattamento" all'interno della scatola sia ben salda in modo che le guide non abbiano spazio per muoversi l'una sull'altra.</li>
	<li>Far bollire questa miscela con i vetrini per 7 minuti a impostazioni standard nel microonde. Durante questo periodo la soluzione bollirà a una temperatura pari o superiore a 100 °C.</li>
	<li>Durante questa fase di ebollizione, riempire due secchielli di ghiaccio a metà con ghiaccio.</li>
	<li>Una volta completata l'ebollizione nel passaggio 3.3, rimuovere il contenitore dal microonde e posizionarlo all'interno di uno dei secchielli per il ghiaccio. Versa il resto del ghiaccio dall'altro secchio tutto intorno al contenitore e coprilo completamente. Lasciate riposare per 1 ora.</li>
</ol>
4. Colorazione degli anticorpi primari e secondari
<ol>
	<li>Al termine del periodo di attesa di 1 ora, rimuovere i vetrini dal contenitore e lavare con il tampone TBS-T 3 volte per 5 minuti ciascuno. Per eseguire questi lavaggi di base può essere utilizzato qualsiasi apparecchio. (Tampone TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% tampone Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% tampone TBS-T siero d'asina).</li>
	<li>Dopo il lavaggio, lasciare asciugare le guide in un luogo buio (ad es. all'interno di un cassetto del banco, posizionare un tovagliolo di carta all'interno del cassetto e inclinare la guida contro di esso) per 5-10 minuti o fino a quando la guida non è completamente asciutta. Durante questo periodo, preparare una camera per la colorazione notturna degli anticorpi primari. Una camera di colorazione semplice può comprendere un contenitore con un'ampia superficie riempita con ddH2O e un tavolino all'interno del contenitore, sopra il quale il vetrino può essere appoggiato sopra il ddH2O.</li>
	<li>Una volta che il vetrino si è asciugato, disegna un contorno attorno alle sezioni di tessuto usando una penna idrorepellente. Durante la fase 4.5, questo contorno funge da barriera impedendo alla miscela di anticorpi di fluire.</li>
	<li>Preparare la miscela di anticorpi primari in TBS-TT. Ad esempio, sono necessari almeno 500 μl per coprire un intero vetrino, ad esempio, se lo stock di anticorpi è a una concentrazione di 1:500, aggiungere 1 μl di un particolare anticorpo a 500 μl di TBS-TT). Utilizzare gli anticorpi primari come indicato nella tabella dei reagenti.</li>
	<li>Posizionare il vetrino essiccato sopra il tavolino nella camera di colorazione. Aggiungere lentamente 500 μl degli anticorpi primari e coprire l'intera superficie. Coprire l'intero apparato e avvolgerlo in un foglio di alluminio per bloccare la luce esterna. Lasciate riposare per una notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare il vetrino tre volte per 5 minuti ciascuna con tampone TBS-T. Lasciarlo asciugare in una zona buia come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Preparare una miscela di anticorpi secondari simile al passaggio 4.4. Fare riferimento alla tabella dei reagenti per gli anticorpi secondari.</li>
	<li>Posizionare il vetrino asciutto nella camera di colorazione come descritto nei passaggi 4.2 e 4.5. Aggiungere lentamente 500 μl di anticorpi secondari e coprire l'intera superficie. Avvolgere la camera di colorazione in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce esterna. Lasciarlo riposare coperto e al riparo dalla luce esterna per almeno 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo aver completato la colorazione secondaria, lavare il vetrino tre volte per 5 minuti ciascuna con tampone TBS-T. Lasciare asciugare il vetrino in una zona buia. Dopo l'asciugatura, mettere la soluzione di montaggio e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti evitando accuratamente l'introduzione di bolle. Lasciare riposare il vetrino in un'area buia per almeno 2 ore prima della successiva analisi.</li>
	<li>Eseguire analisi time-lapse o confocali sul tessuto colorato.</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I passaggi più critici per il successo del recupero dell'antigene e della colorazione dei tipi di cellule progenitrici sono: 1) l'utilizzo di tessuto ben perfuso e fissato dello spessore coronale ottimale; 2) lasciando un tempo sufficiente per l'ebollizione e il successivo raffreddamento durante il recupero dell'antigene; 3) destrezza manuale nel montare sezioni coronali fisse e prevenire il loro danneggiamento quando lo si fa.
È fondamentale nell'IHC utilizzare tessuto perfuso che abbia subit...

La neurogenesi, la generazione di nuovi neuroni da cellule staminali neurali, è ora nota per verificarsi costantemente nell'età adulta in due regioni specializzate del cervello. Questi includono la zona subventricolare (SVZ) del bulbo olfattivo e la zona subgranulare (SGZ) del giro dentato nell'ippocampo. Nell'ultimo decennio, il campo della neurogenesi ippocampale adulta ha visto un lavoro significativo. La regione ha suscitato molto interesse poiché i neuroni neonati nella SGZ contribuiscono a una maggiore plasticità neurale che può sostenere specifiche funzioni cerebrali1-5. La neurogenesi dell'ippocampo adulto è stata implicata per svolgere un ruolo importante nella regolazione dell'umore, nella rigenerazione, nell'apprendimento e nella memoria. Pertanto, c'è stato uno sforzo concertato per comprendere lo sviluppo e la regolazione dei neuroni in questa ricca nicchia neurogena.
Un aspetto inevitabile e importante dello studio della neurogenesi dell'ippocampo adulto è l'identificazione di stadi separati che una cellula staminale neurale attivata attraversa nel suo percorso per diventare un neurone completamente funzionale. In questo processo, la cellula staminale neurale quiescente viene attivata e procede attraverso una serie di tipi di cellule progenitrici attive precoci e attive tardive (Figura 1). Queste distinte popolazioni di progenitori neurali possono essere identificate dalla morfologia e dalla loro espressione di marcatori molecolari come MCM2, nestina, Tbr2 e Doublecortin (DCX) e NeuN che guidano la conversione degli RGL nei rispettivi tipi di cellule progenitrici. La nestina è una proteina del filamento intermedio che viene espressa attraverso le cellule simili alla glia radiale e alcuni tipi di cellule progenitrici precoci. Un altro marcatore è Tbr2 che è specificamente espresso nelle cellule progenitrici amplificatrici. L'espressione del transgene Tbr2 è inizialmente disattivata nelle cellule di tipo 1 (simile alla glia radiale), attivata attraverso i progenitori di tipo 2a, tipo 2ab e tipo 2b e disattivata tra i neuroni di tipo 3 più differenziati e immaturi (Figura 1). La DCX è un marcatore di migrazione neuronale che è espresso nei progenitori neurali di tipo 2ab, tipo 2b e tipo 3. Utilizzando questa combinazione di tre marcatori, possiamo etichettare sottotipi distinti di progenitori neurali. Questi includono il Tipo-1 (MCM2+nestina+Tbr2-), il Tipo-2a (MCM2+nestina+Tbr2+), il Tipo-2ab (MCM2+nestina-Tbr2+ parziale e MCM2+Tbr2+DCX-), il Tipo-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) e il Tipo-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Le cellule post-mitotiche come i neuroni immaturi e funzionalmente integrati possono essere identificate utilizzando DCX e il marcatore neuronale maturo, NeuN.
I metodi tradizionali di IHC utilizzano anticorpi per identificare antigeni per specifici tipi di cellule in base alla loro espressione genica. Per la loro identificazione può essere utilizzata la successiva visualizzazione attraverso tecniche di imaging ad alta risoluzione come la microscopia confocale. Tuttavia, attualmente esistono problemi con questi metodi che non consentono un'identificazione efficiente delle cellule simili alla glia radiale e dei primi tipi di cellule progenitrici. È difficile identificare questi particolari tipi di cellule perché l'anticorpo applicato non è in grado di penetrare e legare efficacemente la proteina nestina. La nestina è la proteina del filamento intermedio che comprende i processi radiali prodotti dalla cellula simile alla glia radiale. Il legame inefficiente di un anticorpo all'antigene può essere il risultato di molti fattori, tra cui il tempo di fissazione, la temperatura e la tecnica utilizzata6-7. Per aiutare a risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo di recupero dell'antigene o "bollitura". Oltre alla nestina, questo metodo di recupero dell'antigene migliora anche la colorazione di altri marcatori come Ki67, BrdU, proteina acida fibrillare gliale (GFAP), Tbr2 e MCM2. Il nostro metodo combina approcci chimici e fisici. Comporta la fissazione chimica del tessuto in paraformaldeide e la successiva ebollizione ad alta temperatura di sottili sezioni coronali dell'ippocampo in un tampone di un trattamento denaturante e caotropico. Ciò migliora l'accessibilità dell'antigene all'anticorpo, migliora la specificità degli anticorpi e consente una migliore identificazione dei tipi di cellule progenitrici. Il nostro approccio è semplice da usare e richiede per lo più strumenti e reagenti già disponibili in laboratorio. Lo abbiamo ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo delle cellule staminali neurali e la loro regolazione attraverso fattori ambientali genetici intrinseci o estrinseci8.

<table><tbody><tr><td>Vetrino SuperFrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>Fornisce una forte aderenza al tessuto ippocampale durante l'ebollizione</td></tr><tr><td>PVA/DABCO Terreno di montaggio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10981-100 ml</td><td> </td></tr><tr><td>Nestina (pollo) </td><td>Aves Lab</td><td>NES</td><td>Marcatore di cellule staminali neurali</td></tr><tr><td>GFAP (coniglio)</td><td>Dako North America</td><td>Z033401-2</td><td>Marcatore di astrociti e cellule staminali neurali</td></tr><tr><td>MCM2 (topo)</td><td>Laboratorio di trasduzione BD</td><td>610701</td><td>Marcatore di proliferazione</td></tr><tr><td>DCX (capra)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8066</td><td>Marcatore di neuroni immaturi</td></tr><tr><td>Tbr2 (coniglio)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>Marcatore progenitore di amplificazione</td></tr><tr><td>NeuN (topo)</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>Marcatore di neuroni maturi</td></tr><tr><td>Cy2 (anti-coniglio)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2 (anti-pollo)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anti-topo)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anti-capra)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>Dako</td><td>Pen S2002</td><td>Dako</td><td>Penna idrorepellente</td></tr></tbody></table>

recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

I metodi tradizionali di immunoistochimica (IHC) dopo la fissazione dei tessuti consentono la visualizzazione di vari tipi di cellule. Questi tipicamente procedono con l'applicazione di anticorpi per legare gli antigeni e identificare le cellule con caratteristiche che sono una funzione della biologia e dello sviluppo intrinseci. La neurogenesi ippocampale adulta è un processo sequenziale in cui una cellula staminale neurale quiescente può attivarsi e procedere attraverso fasi di proliferazione, differenziazione, maturazione e integrazione funzionale. Ogni fase è distinta con una morfologia caratteristica e una sovraregolazione dei geni. L'identificazione di queste fasi è importante per comprendere i meccanismi regolatori in gioco e le eventuali alterazioni di questo processo che sono alla base della fisiopatologia dei disturbi debilitanti. Il nostro approccio di recupero dell'antigene indotto dal calore migliora l'intensità del segnale che viene rilevato e consente la corretta identificazione del tipo di cellula progenitrice. Come discusso in questo articolo, ci permette in particolare di aggirare gli attuali problemi nel rilevamento di alcuni tipi di cellule progenitrici.

La neurogenesi ippocampale adulta è un processo sequenziale in cui il tipo rappresentativo di cellula progenitrice in ogni stadio può essere identificato mediante una combinazione di marcatori. Una fissazione chimica accurata e il recupero dell'antigene migliorano l'efficacia e la rilevabilità di marcatori altrimenti difficili da individuare. Uno di questi è la nestina, espressa nelle cellule staminali neurali di tipo gliale radiale e in alcuni tipi precoci di cellule progenitrici attive. La nestina può essere una protei...

Durante la neurogenesi dell'ippocampo adulto, un insieme distinto di marcatori genetici viene espresso quando una cellula staminale neurale quiescente progredisce in sequenza e si sviluppa in un neurone funzionalmente integrato nel circuito. Utilizzando il recupero dell'antigene indotto dal calore, i tipi di cellule progenitrici che altrimenti sarebbero difficili da rilevare vengono identificati con maggiore efficacia.

Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire il recupero dell'antigene su tessuto cerebrale ippocampale per visualizzare meglio i tipi di cellule progenitrici che danno origine ai neuroni neonati. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando il cervello perfuso dal topo, tagliando sezioni coronali sottili e montando queste sezioni su un vetrino specificamente progettato per aderire fortemente al tessuto. Il secondo passaggio consiste nel far bollire i vetrini con il tessuto e il trattamento citopatico, permettendo un tempo sufficiente per il raffreddamento.Successivamente, colorare il tessuto durante la notte con anticorpi primari. Il passaggio finale consiste nell'eseguire la colorazione con anticorpi secondari sul tessuto il giorno successivo per almeno due ore. Infine, visualizzare i vari tipi cellulari progenitori in relazione al sesso attraverso le diverse fasi di sviluppo durante la neurogenesi adulta del tessuto ippocampale mediante microscopia a tempo differito o microscopia confocale.Ciao, mi chiamo Hun Jo, sono un ricercatore postdottorato, membro del laboratorio del dottor Ian John presso la Mayo Clinic. Il nostro principale obiettivo nel John Lab è studiare il processo di neurogenesi in relazione a disturbi neurologici e psichiatrici. Il nostro scopo finale è tradurre con successo queste conoscenze in applicazioni terapeutiche. Dimostreranno il nostro procedimento di recupero dell'antigene Quam Hui e ciao John dal nostro laboratorio.Il principale vantaggio della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti di immunohistochimica è che consente una visualizzazione efficace di diversi tipi cellulari durante la neurogenesi ippocampale adulta. Questi tipi cellulari, inclusi le cellule staminali neurali precursori che altrimenti sarebbero difficili da rilevare, possono essere etichettati e visualizzati in modo efficiente mediante il nostro metodo di recupero dell'antigene. Questo metodo fornirà informazioni sullo sviluppo e sulla regolazione dei neuroni neonati durante la neurogenesi ippocampale adulta.Per coloro che sono interessati allo studio dei disturbi mentali e del trattamento farmacologico, il nostro recupero dell'antigene si rivelerà utile per indagare il ruolo dello sviluppo neuronale durante questa patogenesi. Iniziare la procedura posizionando il cervello di un topo perfuso in paraformaldeide al 4% in un tubo conico da 10 millilitri, lasciandolo in incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius, oppure per almeno 12-24 ore, ma non più di 36 ore per una fissazione completa. Dopo la fissazione notturna, rimuovere la PFA e lasciare il cervello nel tubo conico.Successivamente, risciacquare il cervello con saccarosio al 30% per rimuovere qualsiasi residuo di PFA e scartare lo saccarosio. Poi riempire nuovamente il tubo con saccarosio al 30% e mantenerlo a quattro gradi Celsius fino a quando il cervello non affonderà sul fondo del tubo. Successivamente, tagliare l'ippocampo in sezioni cerebrali di 40 micrometri utilizzando un microtomo.Conservare i campioni nella soluzione antigelo fino al momento dell'immunohistochimica. Quindi montare le sezioni su vetrini specificamente progettati per aderire in modo forte al tessuto. Dopo il montaggio del tessuto, lasciare asciugare i vetrini per circa 10 minuti.La disidratazione può essere accelerata se i vetrini vengono appoggiati su una superficie verticale su un foglio di carta assorbente per garantire la completa rimozione dei prodotti chimici precedenti. Una volta che i vetrini sono asciutti, lavarli con PBS 3 volte per cinque minuti ciascuna. Quindi lasciarli asciugare nuovamente.In questo procedimento, preparare la soluzione per l'ebollizione del tessuto secondo la descrizione riportata nel manoscritto allegato. Successivamente, far bollire la soluzione per cinque minuti in un forno a microonde standard impostato alla potenza normale. Al termine dell'ebollizione, rimuovere con attenzione il contenitore dal microonde.In seguito, trasferire i vetrini essiccati nella soluzione. Assicurarsi che il lato con le sezioni dell'ippocampo sia completamente esposto alla soluzione. Se possibile, posizionare i vetrini con un angolo contro le pareti del contenitore e disporre altri vetrini intorno ad essi.Quindi far bollire la miscela con i vetrini per sette minuti nel microonde a impostazioni standard. Nel frattempo, riempire per metà due secchi per il ghiaccio con del ghiaccio. Al termine dell'ebollizione, rimuovere il contenitore dal microonde e collocarlo all'interno di uno dei secchi per il ghiaccio.Versare il resto del ghiaccio dall'altro secchio tutto intorno al contenitore e coprirlo completamente. Successivamente, lasciare in posa per un'ora. Rimuovere i vetrini dal contenitore.Lavare con tampone TBST tre volte per cinque minuti ogni volta. Successivamente, asciugare le vetrine al buio per cinque-dieci minuti o fino a quando la vetrina è completamente asciutta. Nel frattempo, preparare una camera con DDH due O per la colorazione con anticorpo primario da incubare tutta la notte.Dopo che i vetrini si sono asciugati, tracciare un contorno intorno alle sezioni di tessuto utilizzando una penna idrorepellente. Questo contorno funge da barriera per impedire al mix di anticorpi di fuoriuscire. Preparare quindi il mix di anticorpi primari in T-B-S-T-T.Posizionare i vetrini essiccati sul portapreparati nella camera di colorazione. Aggiungere lentamente 500 microlitri dell'anticorpo primario per coprire l'intera superficie. Successivamente, coprire la camera di colorazione per bloccare la luce esterna e lasciare in incubazione tutta la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone TBST.Dopodiché, asciugarli al buio. Preparare ora la miscela di anticorpo secondario in T-B-S-T-T. Quindi posizionare i vetrini asciutti nella camera di colorazione.Aggiungere 500 microlitri dell'anticorpo secondario. Coprire lentamente la camera di colorazione e proteggere dal contatto con la luce esterna per almeno due ore a temperatura ambiente. Al termine della colorazione secondaria, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone TBST, quindi asciugare i vetrini al buio dopo l'essiccazione. Aggiungere la soluzione di montaggio sui vetrini.Coprirli con coprioggetti con attenzione per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Successivamente, conservare i vetrini al buio per almeno due ore prima di procedere con l'analisi successiva o con l'analisi temporale o convoluta del tessuto colorato. La neurogenesi ippocampale adulta è rappresentata lungo la zona subgranulare del giro dentato.Una cellula staminale di tipo uno, simile a un'astrocita radiale attivata, attraversa fasi distinte durante la differenziazione, la maturazione e l'integrazione funzionale, con una morfologia complessa, nel circuito neuronale. Ogni fase e i rispettivi tipi cellulari possono essere identificati in base all'espressione di una combinazione di marcatori. MCM2 è un marcatore di proliferazione espresso in tutti i tipi di cellule progenitrici mitotiche, mentre Neun è espresso nelle cellule staminali simili ad astrociti radiali e non radiali.Mentre i progenitori di tipo A2 si differenziano, l'espressione annidata viene prima interrotta. L'espressione di anti-TBR2 aumenta nei progenitori post-mitotici, l'espressione di MCM2 viene persa, mentre l'espressione di DCX e di NEUN determina la migrazione e la maturazione in un neurone funzionale. Questa è un'immagine rappresentativa al microscopio confocale con colorazione viola per MCM2, verde per nestina e rossa per DAPI.Le immagini ingrandite nelle caselle mostrano un progenitore di tipo GL radiale che esprime nestina MCM2 a 2 e 7 dpi. Di seguito è riportata un'immagine confocale rappresentativa con MCM2 in blu, TBR2 in rosso, DCX in verde e dpi in grigio. La colorazione caratteristica di un progenitore di tipo B di tipo 2 è mostrata nelle immagini ingrandite nelle caselle che esprimono MCM2, TBR2, DCX e dpi.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare tre aspetti. Primo, utilizzare un tessuto ben perfuso e fissato dello spessore coronale corretto. Secondo, montare il tessuto in modo piatto sui vetrini ed evitare qualsiasi danno durante l'operazione.E infine, tre, prevedendo un tempo sufficiente per l'ebollizione e il successivo raffreddamento durante il recupero dell'antigene. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la ricostruzione tissutale confocale e gli esperimenti comportamentali possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo al modo in cui i neuroni neonati potrebbero integrarsi nei circuiti ippocampali e contribuire alla funzione cognitiva. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come eseguire il recupero dell'antigene sui vostri tessuti ippocampali per visualizzare in modo più efficace i tipi cellulari presenti che danno origine a nuovi neuroni durante la neurogenesi ippocampale.

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Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi dell'ippocampo adulto

Il video illustra un metodo di colorazione in immunofluorescenza utilizzato per esaminare la neurogenesi nell'ippocampo adulto. Inizialmente, una sezione cerebrale di topo viene sottoposta a trattamento con anticorpi primari diretti contro le proteine marcatrici associate alla neurogenesi nelle cellule progenitrici neuronali. Successivamente, viene marcato con anticorpi secondari marcati con fluorofori. La sezione cerebrale viene quindi osservata al microscopio confocale per distinguere vari...

Una tecnica di colorazione in immunofluorescenza per rilevare la neurogenesi dell'ippocampo adulto

Questo video mostra la procedura per colorare le cellule staminali neurali appena proliferate in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando l'incorporazione di EdU, seguita dall'immunofluorescenza per visualizzare proteine specifiche, migliorando la comprensione della dinamica cellulare e della proliferazione.

Colorazione in immunofluorescenza per la visualizzazione di cellule staminali neurali proliferate in sezioni cerebrali di topo

Questo articolo video illustra un protocollo completo per rilevare e quantificare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta all'interno della stessa sezione di tessuto. Abbiamo elaborato un metodo per superare i limiti dell'immunofluorescenza multipla indiretta che si verificano quando non sono disponibili anticorpi adatti da diverse specie ospiti.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un approccio per l'analisi del comportamento delle cellule staminali/progenitrici neurali adulte in risposta alla manipolazione chemiogenetica di uno specifico circuito neurale locale.

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Questo articolo presenta quattro delle tecniche più comuni per visualizzare le cellule BrdU positive per misurare la neurogenesi adulta nei ratti. Questo lavoro include istruzioni per la preparazione del reagente, la somministrazione di analoghi della timidina, la perfusione transcardica, la preparazione dei tessuti, la reazione immunoistochimica della perossidasi, l'immunofluorescenza, l'amplificazione del segnale, la controcolorazione, l'imaging al microscopio e l'analisi cellulare.

Tecniche di immunoistochimica per analizzare la proliferazione cellulare e la neurogenesi nei ratti utilizzando l'analogo della timidina BrdU

L'encefalite autoimmune è una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale. I neuroni ippocampali possono essere utilizzati per scoprire e caratterizzare questi anticorpi. Questo articolo fornisce un protocollo per la coltura cellulare primaria e l'immunocolorazione per determinare gli autoanticorpi nel siero e nel liquido cerebrospinale dei pazienti.

Colture neuronali ippocampali per rilevare e studiare nuovi anticorpi patogeni coinvolti nell'encefalite autoimmune

Il trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti umane generati dalla programmazione neuronale potrebbe essere un potenziale approccio terapeutico per i disturbi dello sviluppo neurologico. Questo protocollo descrive la generazione e il trapianto di precursori neuronali GABAergici derivati da cellule staminali umane nel cervello di topi neonatali, consentendo l'indagine a lungo termine dei neuroni innestati e la valutazione del loro potenziale terapeutico.

Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Scopri il recupero dell'antigene indotto dal calore per visualizzare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta nel tessuto cerebrale di topo. Questo metodo migliora l'identificazione dei marcatori genetici nelle cellule staminali neurali.

Recupero dellantigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta (Video) | JoVE Journal

Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

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