Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire il recupero dell'antigene sul tessuto cerebrale dell'ippocampo per visualizzare meglio i tipi di cellule progenitrici che danno origine ai neuroni neonati. Ciò si ottiene prelevando prima il cervello perfuso dal topo tagliando sottili sezioni coronali e montando queste sezioni su un vetrino, specificamente progettato per aderire fortemente al tessuto. Il secondo passo consiste nell'far bollire i vetrini con il trattamento atopico Tissue e Kay e lasciare un tempo sufficiente per il raffreddamento.

Quindi, colorare il tessuto durante la notte con gli anticorpi primari. Il passaggio finale consiste nell'eseguire la colorazione secondaria degli anticorpi sul tessuto il giorno successivo per almeno due ore. In definitiva, visualizzare i vari tipi di cellule pro genere attraverso le varie fasi di sviluppo durante la neurogenesi adulta del tessuto ippocampale con il time lapse o la microscopia confocale.

Ciao, mi chiamo Hun Jo, sono un postdoc, un membro del laboratorio del Dr.Ian John e della Mayo Clinic. Il nostro obiettivo principale in John Lab è lo studio del processo di altre neurogenesi nei disturbi neurologici e psichiatrici. Il nostro obiettivo finale è quello di tradurre con successo tali conoscenze in applicazioni terapeutiche dimostrando che la nostra procedura di recupero dell'antigene sarà Quam Hui e ciao John dal nostro laboratorio.

Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti di immunoistochimica è che consente una visualizzazione efficace di tipi di cellule distinte durante la neurogenesi ippocampale adulta. Questi tipi di cellule, comprese le cellule staminali neurali precursori che altrimenti sarebbero difficili da rilevare, possono essere etichettate e visualizzate in modo efficiente utilizzando il nostro metodo di recupero dell'antigene. Questo metodo fornirà informazioni sullo sviluppo e la regolazione dei neuroni neonati durante la neurogenesi ippocampale adulta.

Per coloro che sono interessati allo studio dei disturbi mentali e al trattamento farmacologico, il nostro recupero dell'antigene si rivelerà utile per indagare il ruolo dello sviluppo neuronale durante questa malattia. Patogenesi. Iniziare la procedura posizionando il cervello di un topo perfuso in para formaldeide al 4% in un tubo conico da 10 millilitri durante la notte a quattro gradi Celsius, o per almeno 12-24 ore, ma non più di 36 ore per la fissazione completa. Dopo la fissazione notturna, rimuovere il PFA e lasciare il cervello nel tubo conico.

Successivamente, sciacquare il cervello con il 30% di saccarosio per rimuovere eventuali residui di PFA e scartare il saccarosio. Quindi riempi nuovamente il tubo con il 30% di saccarosio e mantienilo a quattro gradi Celsius fino a quando il cervello non affonda sul fondo del tubo. Successivamente, tagliare l'ippocampo in sezioni cerebrali di 40 micrometri su un microtomo.

Conservare le sezioni nella soluzione antigelo fino a quando non sono pronte per l'immunoistochimica. Quindi montare le fette sui vetrini del microscopio che sono specificamente progettati per aderire fortemente al tessuto. Dopo aver montato il fazzoletto, lasciare asciugare i vetrini per circa 10 minuti.

L'asciugatura può essere accelerata se i vetrini vengono appoggiati su una superficie verticale su un tovagliolo di carta per garantire la completa rimozione delle sostanze chimiche precedenti. Una volta che i vetrini sono asciutti, lavarli con PB S3 volte per cinque minuti ogni volta. Quindi lascialo asciugare di nuovo.

In questa procedura, preparare la soluzione per l'ebollizione dei tessuti secondo la descrizione nel manoscritto allegato. Quindi, far bollire la soluzione per cinque minuti in un forno a microonde standard a impostazione standard. Una volta completata l'ebollizione, rimuovere con cura il contenitore dal microonde.

Successivamente, trasferire i vetrini essiccati nella soluzione. Assicurati che il lato con le sezioni dell'ippocampo sia completamente esposto alla soluzione. Se possibile, posizionare i vetrini ad angolo contro le pareti del contenitore e impilare altri vetrini attorno ad essi.

Quindi far bollire il composto con le ciabatte per sette minuti nel microonde a impostazioni standard. Nel frattempo, riempi due secchielli del ghiaccio a metà con il ghiaccio. Una volta completata l'ebollizione, togliete il contenitore dal microonde e mettetelo all'interno di uno dei secchielli per il ghiaccio.

Versa il resto del ghiaccio dall'altro secchio tutto intorno al contenitore e coprilo completamente. Dopodiché, lascialo riposare per un'ora dopo un'ora. Rimuovere i vetrini dal contenitore.

Lavateli con tampone TBST tre volte per cinque minuti ogni volta. Quindi, asciugare i vetrini al buio per cinque-10 minuti o fino a quando il vetrino non è completamente asciutto. Nel frattempo, preparare una camera con DDH due O per la colorazione notturna degli anticorpi primari.

Una volta che i vetrini si sono asciugati, disegnare un contorno attorno alle sezioni di tessuto utilizzando una penna per ricorrenza ad acqua. Questo contorno funge da barriera per impedire alla miscela di anticorpi di traboccare. Quindi preparare la miscela di anticorpi primari in T-B-S-T-T.

Posizionare i vetrini essiccati sul tavolino nella camera di colorazione. Aggiungere lentamente 500 microlitri dell'anticorpo primario fino a coprire l'intera superficie. Successivamente, coprire la camera di colorazione per bloccare la luce esterna e mantenerla per una notte a temperatura ambiente il giorno successivo, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ogni volta con tampone TBST.

Dopodiché, asciugali al buio. Ora prepara la miscela di anticorpi secondari in T-B-S-T-T. Quindi posizionare i vetrini asciutti nella camera di colorazione.

Aggiungere 500 microlitri di anticorpo secondario. Coprire lentamente la camera di colorazione e tenerla al riparo dalla luce esterna per almeno due ore a temperatura ambiente dopo il completamento della colorazione secondaria, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ogni volta con tampone TBST, asciugare i vetrini al buio dopo l'asciugatura. Aggiungere la soluzione di montaggio alle diapositive.

Coprirli accuratamente con vetrini coprioggetti per evitare l'introduzione di eventuali bolle. Successivamente conservare i vetrini al buio per almeno due ore prima di eseguire l'analisi successiva e l'esecuzione dell'analisi time lapse o convo sul tessuto colorato. La neurogenesi dell'ippocampo adulto è raffigurata nella zona subgranulare del giro dentato.

Una cellula staminale di tipo uno simile a una glial radiale attivata passa attraverso fasi distinte mentre si differenzia, matura e si integra funzionalmente con una morfologia elaborata nel circuito neuronale. Ciascuna delle fasi e i rispettivi tipi di cellule possono essere identificati in base alla loro espressione di una combinazione di marcatori. MCM 2 è un marcatore di proliferazione che è espresso in tutti i tipi di cellule progenitrici mitotiche mentre il nein è espresso tra le cellule staminali gliali radiali e non radiali.

Quando i progenitori di tipo A due si differenziano, l'espressione nidificata viene prima disattivata. L'espressione anti TBR due aumenta nel progenitore post-mitotico, l'espressione MCM due viene persa, mentre l'espressione DCX e NEWAN determina la migrazione e la maturazione in un neurone funzionale. Questa è un'immagine confocale rappresentativa di MCM viola, due nestoni verdi e colorazione dappy rossa.

Le immagini ingrandite nelle caselle mostrano un progenitore radiale simile a GL che esprime neston MCM due e dpi. Ecco un'immagine confocale rappresentativa di MCM blu due rossi, TBR due DCX verdi e dpi grigi. La colorazione delle caratteristiche di un tipo di cellula progenitrice B di tipo due è mostrata nelle immagini ingrandite nelle caselle che esprimono MCM due, TBR 2D, c, X e dpi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare tre cose. Uno, utilizzare tessuto ben perfuso e fissato del giusto spessore coronale. Due, montare il tessuto in piano sui vetrini e prevenire eventuali danni mentre lo si fa.

E infine, tre, lasciando un tempo sufficiente per l'ebollizione e il successivo raffreddamento durante il recupero dell'antigene. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la ricostruzione del tessuto confocale e gli esperimenti comportamentali per rispondere a ulteriori domande su come i neuroni neonati possono integrarsi nei circuiti dell'ippocampo e contribuire alla funzione cognitiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'antigene retriever sul tessuto ippocampale per visualizzare con maggiore efficacia i tipi di cellule presentative che danno origine a nuovi neuroni durante altre nevrosi ippocampali.