Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di integrare array cromosomici extra transgenici nel genoma dell'eleganza del dentato utilizzando l'irradiazione ultravioletta. Innanzitutto, selezionare la linea transgenica con la più alta velocità di trasmissione possibile, idealmente superiore all'80%, quindi irradiare con i raggi UV le quattro larve transgeniche selezionate per quattro dei due animali transgenici fluorescenti F da ciascuna piastra F1 selezionata. Schermata successiva, le due piastre F per transgenico fluorescente al 100%.

F tre vermi. In definitiva, la scelta di un animale fluorescente della terza generazione F può mostrare il 100% di ereditarietà del transgene. Questo approccio sperimentale è adatto per le linee transgeniche che trasmettono array di cromosomi extra ad alta velocità.

A dimostrare la procedura sarà Stephanie Belman, un tecnico del nostro laboratorio. Inizia con 500 grandi piastre di Petri contenenti la crescita dei nematodi. Seme medio ogni piatto con 0,3 millilitri di isia coli saturo.

OP 50 cultura. Valutare la velocità di trasmissione della linea transgenica da integrare per ogni linea transgenica. Scegli 10 adulti a gravità fluorescente su 10 piastre di coltura separate sotto una coltura stereoscopica fluorescente.

Gli animali in un'incubatrice per vermi impostata ad una temperatura permissiva alla riproduzione del background genetico. Monitorare la progenie ogni giorno per valutare in quale stadio di sviluppo è espresso il marcatore di coiniezione e può essere osservato al meglio utilizzando l'oscopia fluorescente. Valutare la velocità di trasmissione della progenie determinando la percentuale di progenie fluorescente.

Per l'integrazione transgenica, selezionare la linea transgenica con la più alta velocità di trasmissione. Ottenere una popolazione di animali transgenici sincronizzati allo stadio larvale L quattro. Per l'integrazione, prelevare 30 adulti GRA fluorescenti su cinque piastre di coltura.

Dopo che i vermi hanno deposto le uova per tre o quattro ore a 15 gradi Celsius, verificare la presenza di almeno 30 uova per piastra e poi eliminare gli adulti dalle piastre per coltivare gli animali in un'incubatrice per vermi fino a quando la progenie non raggiunge lo stadio larvale L quattro. Posizionare ogni piastra contenente da 15 a 20 animali transgenici fluorescenti L quattro in un reticolante UV con i coperchi rimossi, irradiare i vermi per il recupero. Incubare i vermi irradiati per una notte a 15 gradi Celsius.

Controlla il numero di animali che sono vivi nelle nostre mani. Un tasso di sopravvivenza di circa l'80-90% è adattato per un'irradiazione efficiente. Far crescere gli animali irradiati a una temperatura compresa tra 15 e 25 gradi Celsius fino a quando la progenie non ha raggiunto lo stadio di sviluppo, consentendo l'osservazione dell'espressione del marcatore di iniezione di co.

Trasferire singoli animali fluorescenti F1 su piastre di coltura separate. Mantenere queste lastre F1 a una temperatura compresa tra 15 e 25 gradi Celsius fino a quando la progenie non raggiunge uno stadio appropriato per l'osservazione di animali fluorescenti F 2 a seconda del marcatore co utilizzato. In questo caso particolare, abbiamo osservato che i vermi da adulti scartano tutte le piastre F1 che presentano una, nessuna progenie, indicando che l'animale F1 era sterile o è morto, o due no, o solo pochi animali fluorescenti F due che indicano che l'animale F1 non ha trasmesso il transgene alla velocità prevista.

Individuare quattro animali fluorescenti transgenici F due da ciascuna piastra F1 selezionata. Quando si utilizzano transgeni fluorescenti, scegliere due vermi F con un alto livello di fluorescenza in quanto ciò potrebbe indicare che questi animali sono omozigoti per l'array integrato. Si noti che quando si raccolgono F due animali, è fondamentale non portare con sé uova o larve per evitare falsi negativi nel passaggio successivo.

Dopo aver coltivato i due animali F, esamina le piastre F two per i vermi F 3 transgenici fluorescenti al 100%. Lo screening è abbastanza rapido in quanto la presenza di un singolo verme non fluorescente indica che la piastra deve essere gettata via, individuare otto animali fluorescenti F tre da piastre selezionate per confermare l'ereditarietà del 100% del transgene. Se possibile, mantenere diversi ceppi transgenici integrati indipendenti.

Sono state eseguite integrazioni di transgeni in due linee diverse, trasmettendo array cromosomici extra a circa la stessa frequenza. Utilizzando i protocolli standard e migliorati, il tempo e il numero di piastre necessarie per linea integrata sono ottimizzati nel protocollo migliorato. Successivamente, abbiamo testato l'ipotesi che una velocità di trasmissione del transgene più elevata in una linea non integrata renda più facile l'integrazione del transgene nel genoma.

Un particolare transgene è stato integrato in linee che trasmettono a velocità diverse utilizzando il protocollo migliorato per la linea di trasmissione più alta. Tre linee integrate sono state recuperate da soli 90 animali F1 selezionati, mentre per la linea transgenica che trasmette dal 50 al 60% Una linea integrata è stata recuperata da 110 animali F1 selezionati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire diversi metodi per rispondere a ulteriori domande come la determinazione dell'espressione, del modello e della regolazione genica, la localizzazione e la sovraespressione proteica o lo sviluppo di marcatori subcellulari.