Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è integrare array transgenici extracromosomici nel genoma di *C. elegans* mediante irradiazione ultravioletta. In primo luogo, selezionare la linea transgenica con la percentuale di trasmissione più elevata possibile, idealmente superiore all'80%. Quindi, irradiare con raggi UV le larve transgeniche L4 selezionate ed isolare quattro animali transgenici fluorescenti F2 da ciascuna piastra F1 selezionata. Successivamente, analizzare le piastre F2 alla ricerca di progenie transgenica fluorescente al 100%.

tre vermi. Alla fine, la selezione di animali fluorescenti della generazione F tre può dimostrare l'ereditarietà al 100% del transgene. Questo approccio sperimentale è particolarmente adatto per linee transgeniche che trasmettono array cromosomici aggiuntivi a un'alta frequenza.

La procedura sarà dimostrata da Stephanie Belman, una tecnica del nostro laboratorio. Iniziare con 500 piastre di Petri grandi contenenti terreno di crescita per nematodi. Seminare ogni piastra con 0,3 millilitri di un'ispessita di E. coli satura.

Cultura OP 50. Valutare il tasso di trasmissione della linea transgenica da integrare per ciascuna linea transgenica. Scegliere 10 adulti fluorescenti sensibili alla gravità e posizionarli su 10 piastre di coltura separate sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.

Gli animali vengono mantenuti in un incubatore per vermi impostato a una temperatura permissiva per la riproduzione del background genetico. Monitorare ogni giorno la prole per valutare in quale stadio di sviluppo il marcatore di co-iniezione è espresso e può essere osservato al meglio mediante microscopia fluorescente. Valutare la percentuale di trasmissione della prole determinando la percentuale di prole fluorescente.

Per l'integrazione del transgene, selezionare la linea transgenica con la percentuale di trasmissione più elevata. Ottenere una popolazione di animali transgenici sincronizzati allo stadio larvale L4. Per l'integrazione, selezionare 30 adulti GRA fluorescenti e posizionarli su cinque piastre di coltura.

Dopo che i vermi hanno deposto le uova per tre o quattro ore a 15 gradi Celsius, verificare la presenza di almeno 30 uova per piastra, quindi eliminare gli adulti dalle piastre e coltivare gli animali in un incubatore per vermi fino a quando la prole raggiunge lo stadio larvale L4. Posizionare ogni piastra contenente da 15 a 20 animali transgenici fluorescenti allo stadio larvale L4 in un crosslinker a UV con i coperchi rimossi, irradiare i vermi per il recupero. Incubare i vermi irradiati tutta la notte a 15 gradi Celsius.

Verificare il numero di animali vivi in nostro possesso. Un tasso di sopravvivenza di circa l'80-90% è adatto per un'irradiazione efficiente. Far crescere gli animali irradiati a una temperatura compresa tra 15 e 25 gradi Celsius fino a quando la prole ha raggiunto lo stadio di sviluppo che permette l'osservazione dell'espressione del marcatore di co-iniezione.

Trasferire singoli animali F1 fluorescenti su piastre di coltura separate. Mantenere queste piastre F1 a una temperatura compresa tra 15 e 25 gradi Celsius fino a quando la progenie raggiunge uno stadio adeguato per l'osservazione degli animali F2 fluorescenti, in base al marcatore co utilizzato. In questo caso specifico, abbiamo osservato i vermi in fase adulta, scartando tutte le piastre F1 che mostravano o un solo figlio, o nessuna progenie, indicando che l'animale F1 era sterile o morto, oppure solo due o pochi animali F2 fluorescenti, indicando che l'animale F1 non aveva trasmesso il transgene al tasso atteso.

Selezionare quattro animali transgenici fluorescenti di F2 da ciascuna piastra F1 selezionata. Quando si utilizzano transgeni fluorescenti, scegliere vermi F2 con un elevato livello di fluorescenza, poiché ciò potrebbe indicare che questi animali sono omozigoti per l'array integrato. Si noti che durante la selezione degli animali F2, è fondamentale non trasferire uova o larve, al fine di evitare falsi negativi nel passaggio successivo.

Dopo aver coltivato gli animali F2, esaminare le piastre F2 alla ricerca di vermi transgenici F3 fluorescenti al 100%. Lo screening è piuttosto rapido, poiché la presenza di un singolo verme non fluorescente indica che la piastra deve essere scartata. Isolare otto animali F3 fluorescenti da piastre selezionate per confermare l'ereditarietà del transgene al 100%. Se possibile, mantenere diverse ceppi transgenici integrati indipendenti.

Sono state effettuate integrazioni di transgeni in due linee diverse, trasmettendo array extracromosomiali con una frequenza approssimativamente uguale. Utilizzando i protocolli standard e quello migliorato, il tempo e il numero di piastre necessari per ogni linea integrata sono stati ottimizzati nel protocollo migliorato. Successivamente, abbiamo verificato l'ipotesi secondo cui un tasso di trasmissione più elevato del transgene in una linea non integrata facilita l'integrazione del transgene nel genoma.

Un particolare transgene è stato integrato in linee con tassi di trasmissione diversi utilizzando il protocollo migliorato per la linea con la trasmissione più elevata. Tre linee integrate sono state ottenute da soli 90 animali F1 selezionati, mentre per la linea transgenica con trasmissione al 50-60% è stata ottenuta una sola linea integrata da 110 animali F1 selezionati. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti diversi metodi per rispondere ad ulteriori domande, come determinare l'espressione genica, il profilo e la regolazione, la localizzazione proteica e l'iperespressione proteica, oppure sviluppare marcatori subcellulari.