Name: Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Impara la tipizzazione multiplex PCR dei tipi SCCmec I-V in Staphylococcus aureus resistente alla meticillina. Questo metodo semplifica la caratterizzazione degli isolati MRSA per il monitoraggio epidemiologico in laboratorio clinico.

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Ringraziamo T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre, e D. Coleman per il gentile dono di alcuni ceppi di riferimento utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato in parte sostenuto finanziariamente dal Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Queste procedure devono essere effettuate in un laboratorio certificato di livello 2 di biosicurezza. Adeguati dispositivi di protezione individuale, come guanti e camici da laboratorio deve essere utilizzato in ogni momento. 1. Preparazione del campione <ol><li> Sono tenuti fresche durante la notte culture piastra di MRSA. Il giorno prima della PCR deve essere fatto, selezionare una singola colonia di MRSA con una cultura bastoncino sterile e preparare una pesante striscia di batteri su una piastra di Tryptic Soy Agar (TSA). Campioni multipli possono essere strisciati su un singolo piatto. Incubare per una notte a 37

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Il test PCR multiplex qui descritto fornisce un metodo semplice e affidabile per classificare i tipi e i principali sottotipi di SCCmec I-V negli stafilococchi, con discriminazione simultanea di MRSA da MSSA. Il test è robusto, viene eseguito comodamente in un'unica reazione PCR e i risultati sono facili da interpretare. Il test ha dei limiti in quanto si rivolge a singoli loci all'interno di ciascun tipodi mec SCC, ma non offre una tipizzazione completa del complesso CCR e MEC , e qui...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) ha acquisito e integrato nel suo genoma di un elemento genetico mobile 21-67-kb, definito il stafilococco cassetta cromosoma mec (SCC mec) che ospita la resistenza alla meticillina (mecA) gene e altri fattori determinanti di resistenza agli antibiotici 1 . SCC mec

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata sterile</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: include 10x tampone PCR e 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ Scala DNA</td><td>Life Tecnologie</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncini per coltura</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (new #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Camera di elettroforesi su gel orizzontale sommergibile con stampo in gel</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Alimentazione</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a bilanciere</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molecolare Imager Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche mec tipi i a v, resistente alla meticillina<em&gt; staphylococcus aureus</em

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Stafilococco Cassette Cromosoma mec (SCC mec) tipizzazione molecolare

Questo M-PCR aggiornato è in grado di determinare (classificare) i tipi di SCCmec da I a V, oltre ai principali sottotipi di SCCmec IV. Il saggio mira a loci unici e specifici di SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE e V, con contemporanea rilevazione del gene mecA. È inoltre possibile un'identificazione provvisoria di SCCmec VI e VIII, ma sarebbero necessari ulteriori test per confermarla. Figura 3 illustra i rappresentanti di SCCmec I-VI e VIII...

Dimostriamo un semplice test PCR multiplex per lo screening rapido e la tipizzazione di Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) di tipo I-V per Staphylococcus aureus resistente alla meticillina e forniamo alcuni dei passaggi vitali e delle sfumature procedurali che lo rendono efficace per adattare questo test ai singoli laboratori.

Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è determinare il tipo SCC MEC di stafilococco aureo resistente alla meticillina, o isolati MRSA, mediante un saggio di PCR multiplex. Questo viene realizzato innanzitutto isolando il DNA dai ceppi, utilizzando una tecnica di estrazione rapida e semplice che prevede il riscaldamento delle cellule batteriche in acqua. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire un saggio di PCR multiplex al fine di amplificare bersagli specifici per ciascuno dei tipi SEC ME.Successivamente, i prodotti della PCR vengono separati mediante elettroforesi su gel AROS. L'ultimo passaggio consiste nella colorazione del gel per la visualizzazione del DNA e nell'analisi dei dati. In definitiva, la combinazione unica di prodotti specifici della PCR ottenuti con questo saggio di PCR multiplex viene utilizzata per determinare i tipi SE cmec degli isolati di MRS A. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli schemi tradizionali di tipizzazione S CEC, che mirano a complessi genici CCR e MEC singoli e richiedono l'uso di molteplici provette per PCR, è che questo processo semplifica notevolmente il carico di lavoro ed è eseguibile in un

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