Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina

L'obiettivo generale di questo procedimento è determinare il tipo SCC MEC di stafilococco aureo resistente alla meticillina, o isolati MRSA, mediante un saggio di PCR multiplex. Questo viene realizzato innanzitutto isolando il DNA dai ceppi, utilizzando una tecnica di estrazione rapida e semplice che prevede il riscaldamento delle cellule batteriche in acqua. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire un saggio di PCR multiplex al fine di amplificare bersagli specifici per ciascuno dei tipi SEC ME.

Successivamente, i prodotti della PCR vengono separati mediante elettroforesi su gel AROS. L'ultimo passaggio consiste nella colorazione del gel per la visualizzazione del DNA e nell'analisi dei dati. In definitiva, la combinazione unica di prodotti specifici della PCR ottenuti con questo saggio di PCR multiplex viene utilizzata per determinare i tipi SE cmec degli isolati di MRS A. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli schemi tradizionali di tipizzazione S CEC, che mirano a complessi genici CCR e MEC singoli e richiedono l'uso di molteplici provette per PCR, è che questo processo semplifica notevolmente il carico di lavoro ed è eseguibile in un'unica provetta per PCR.

Queste procedure devono essere eseguite in un laboratorio certificato di livello di sicurezza biologica due. È necessario utilizzare sempre un'adeguata attrezzatura di protezione individuale per l'intera giornata precedente l'esecuzione della PCR. Selezionare una singola colonia di MRSA da una piastra fresca coltivata per tutta la notte, utilizzando un'asticella sterile per colture, e preparare un'abbondante striatura dei batteri su una piastra di agar triptico di soia.

È possibile seminare più campioni su un singolo piatto e incubare per tutta la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere 75 microlitri di acqua distillata sterile in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro. Utilizzando un’asticella da prelievo sterile.

Prelevare una piccola quantità di batteri dalla striatura densa della coltura notturna. Agitare i batteri nell'acqua sterile per preparare una soluzione torbida. Ripetere questo processo per tutti i campioni.

Incubare i tubi in un blocco riscaldante secco impostato a 95 gradi Celsius per 10 minuti per lisare i batteri e rilasciare il DNA. Rimuovere i campioni dal blocco riscaldante e lasciarli in posa a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare i campioni a 13.000 RPM per un minuto.

Il campione risultante presenta un pellet di detriti cellulari e un soprannatante limpido contenente il DNA. Per preparare la PCR, rimuovere i reagenti per la PCR, inclusi il buffer 10 XPCR, il cloruro di magnesio 50 millimolare, i DTP e i primer, dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e lasciarli scongelare a temperatura ambiente sul bancone PCR pulito, dove non è consentita la presenza di batteri o DNA. In questo momento possono essere preparati e etichettati i tubi PCR da 0,2 millilitri.

Dopo il scongelamento, vortexare brevemente per mescolare tutti i reagenti, quindi combinarli come indicato nel protocollo testuale. È importante utilizzare la DNA polimerasi platinum tech poiché si è riscontrato che influisce sul successo della reazione. Dopo aver vortexato la miscela maestra, distribuirla nei singoli tubi PCR, chiudere tutti i tubi PCR e trasferirli al banco di lavoro generale.

Aggiungere il template ai tubi PCR pipettando due microlitri del soprannatante limpido dai campioni batterici precedentemente preparati. Spostarsi nel luogo dedicato all'amplificazione prima di posizionare i tubi nel termociclatore ed eseguire la reazione come indicato nel protocollo testuale. Lavorare in un'area dedicata all'elettroforesi su gel utilizzando 2,5 grammi di agarosio in 100 millilitri di tampone 0,5 XTBE in un pallone erlenmeyer di vetro.

Coprire il becher con della pellicola trasparente e far bollire la soluzione al microonde fino a completa dissoluzione. Un gel al 2,5% può fuoriuscire rapidamente. Pertanto, interrompere periodicamente il riscaldamento al microonde e agitare la soluzione con movimenti circolari.

Raffreddare gli agarosio fino a renderli comodi al tatto ruotando i tubi sotto acqua fredda o lasciandoli in riposo sul banco per cinque minuti. Versare l'agarosio nel vassoio di colatura dopo aver rimosso i tubi dal termociclatore PCR. Preparare i campioni aggiungendo due microlitri di colorante di carico 6X DNA a ciascun campione.

Caricare da cinque a dieci microlitri di campione per pozzetto sul gel. È appropriato utilizzare un DNA marker da un KB plus o da 100 paia di basi per le dimensioni previste delle bande. Il bromuro di etidio può essere aggiunto al gel prima di versarlo oppure, in alternativa, il gel può essere colorato in un bagno di bromuro di etidio prima della visualizzazione.

Posizionare il gel finito in una soluzione di 0,5 microgrammi per millilitro di bromuro di atherio e acqua distillata, quindi mescolare delicatamente su un agitatore per 10 minuti. Trasferire il gel in un contenitore pulito e lasciarlo in acqua distillata per ulteriori 10 minuti. Qui viene mostrato un gel rappresentativo che illustra i prodotti PCR attesi per tutti i ceppi rappresentativi dei tipi SEC MEC da uno a sei e otto, nonché per i sottotipi A-F di SEC MEK. Per un ceppo tipico di SEC MEK uno sono attese due bande.

La banda specifica di tipo uno a 613 paia di basi, nonché la banda di controllo mecA a 147 paia di basi. Sono mostrati tre ceppi rappresentativi di SEC MEK due, inclusi il ceppo prototipico di tipo due N315 e i meno prevalenti tipo due A e tipo due B. Per classificare un ceppo come SEC MEK due, devono essere presenti due bande, inclusa la sequenza bersaglio del locus di tipo due a 128 paia di basi e la banda di controllo mecA. Sono mostrati due ceppi rappresentativi di SEC MEK tre, inclusi il ceppo prototipico SEC MEK tre 85/2082 e il meno comune tipo tre A del ceppo JCSC 290. SEC MEC tre viene identificato sulla base della presenza di due prodotti di PCR, inclusa la sequenza bersaglio specifica del tipo tre a 257 paia di basi e la sequenza di controllo mecA.

Anche il SEC MEC tre dominante sarà positivo per la sonda specifica del mercurio a 280 paia di basi, che si trova su un elemento SEC adiacente e serve a distinguerlo dal SEC MEC tre A cinque, meno comune. Sono mostrati gli elementi rappresentativi del SEC MEC quattro, inclusi i tipi quattro A, quattro B, quattro C, quattro D, quattro E e quattro F. A differenza del SEC MEK da uno a tre, non esiste un unico bersaglio presente in tutti i sottotipi del SCC MEK quattro, a parte meck A. Il ceppo rappresentativo del SCC MEK quattro E viene identificato sulla base della presenza della banda di tipo quattro E, nonché del prodotto CCR AB quattro, presente su un elemento accessorio adiacente, e del prodotto di tipo quattro C, presente poiché il SEC MEK quattro E condivide la stessa regione J uno del SE Cmk quattro. Il CSCC MEK quattro F è simile al SEC MEK quattro E in quanto condivide la stessa regione J tre ed è pertanto positivo anche per il bersaglio quattro E, oltre ad essere positivo per il bersaglio CCR AB quattro grazie a un elemento accessorio adiacente. Tuttavia, il S Cmk quattro F può essere distinto dal S CMK quattro E poiché manca del bersaglio di tipo quattro C.

Un ceppo SE CMK di tipo cinque presenterebbe tipicamente due prodotti di PCR sul gel: una banda specifica del tipo cinque a 325 paia di basi e un controllo ME a 147 paia di basi. Infine, sebbene l'obiettivo di questo saggio non fosse fornire un'identificazione definitiva né di SEC MEK sei né di otto, sono stati inclusi ceppi rappresentativi di entrambi i tipi, poiché un profilo specifico di PCR fornisce evidenze indiziarie della presenza di questi ceppi.

Oltre al target Meck A, ci si aspetta che il rappresentante SEC MEK sei produca un prodotto positivo CR AB quattro a 106 paia di basi, poiché questo è il suo principale tipo di complesso CCR. Il rappresentante SEC MEC otto risulterà anch'esso positivo per MEC A a 147 paia di basi e per C-C-R-A-B quattro a 106 paia di basi, e potrà essere distinto dal SEC MEK sei in base a un prodotto specifico del tipo due, derivante dalla presenza della stessa regione J due SEC MEK due. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che, a causa della complessità dell'analisi e del gran numero di primer presenti nella reazione, potrebbero insorgere difficoltà.

Adattando questo protocollo ai singoli laboratori, prestare particolare attenzione ad alcune questioni fondamentali come la preparazione del template di DNA e il marchio dei reagenti per la PCR agevolerà notevolmente questo obiettivo.